As proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de proteínas. Existem diferentes tipos de proteases classificadas de acordo com seu mecanismo de ação e sítio ativo, incluindo serina-proteases, cisteína-proteases, proteases ácidas e metalo-proteases. Proteases de origem vegetal, bacteriana e fúngica são amplamente utilizadas na indústria de alimentos para aplicações como clarificação de cerveja, modificação do glúten na panificação e desenvolvimento de sabor e cor em
3. Introdução Proteinases
Principal função é a hidrólise de proteínas;
Envolvidas no processo de digestão, ativação de enzimas e no transporte de
proteínas pelas membranas;
A posição da ligação da cadeia polipetidica e o tamanho da cadeia
influenciam na sua atividade;
Apresentam grau de especificidade em relação aos aminoácidos envolvidos
na ligação e na sua posição na molécula.
4. As enzimas são proteínas, cadeias de
aminoácidos.
Enzimas que catalisam a quebra das
ligações peptídicas em proteínas através da
utilização de água são chamadas hidrolases.
5. Hidrólise das proteína
Favorece a digestão e absorção pelo organismo
Formação de compostos responsáveis pelo aroma e textura
especificos;
Proteases (EC 3.4) são enzimas que pertencem ao grupo das
hidrolases
Catalisam a reação de hidrólise das ligações peptídicas das
proteínas
Atividades também nas ligações éster e amida.
10. Enzimas proteases produzidas em escala comercial
75% são hidrolases;
Destas, 60% são proteases
25% proteases alcalinas
10% quimiosina
3% tripsina
21% outras;
11. Modo de ação
As proteases são classificadas pelo modo de ação pelo
seu sítio catalítico:
Exopeptidases
atuam nas extremidade da cadeia polipeptidica
Endopeptidases
agem nas ligações no interior da cadeia proteica
12.
13. Exopeptidases
1. Aminopeptidases
Proteases que agem na
extremidade N-terminal
da cadeia polietitidaica
Liberam aminoacidos
livres, dipeptidios ou
tripepetidios
Geralmente são metalo-
proteases
14. Exopeptidases
2. Carboxipeptidases
Proteases que agem na extremidade C-terminal da cadeia
polipeptidica
Liberam aminoacidos livres ou dipeptidios;
São as serina-proteases, metalo-proteases ou cisteina-proteases
Classificadas pela natureza quimica de seu sitio ativo.
15.
16. Carboxipeptidase
A carboxipeptidase é uma enzima digestiva.
A hidrólise completa de uma proteína leva à separação dos
resíduos dos aminoácidos componentes dessa proteína.
17. Serina-proteases (EC 3.4.21)
Presença do aminoácido serina no sitio ativo
Inibidas irreversivelmente:
3,4-dicloroiscocumarina (3,4-DCI)
Disopropilfluorofosfato (DFP)
Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)
18. Serina-proteases
Ativas em pH neutro e alcalino. Principais exemplos: tripsina,
quimiotripsina e subtilisina.
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio
Ativo
Serina-Protease Quimitripsina
Substilisina
His57, Asp102, Ser195
His32, His64 Ser221
Histidina, Ácido aspártico, Serina.
19.
20. Cisteína-proteases ou proteases sulfidrilicas
(EC 3.4.22)
Apresentam em seu sitio ativo cisteina conjugada com histidine
Mais ativas em meios de pH neutron do que ácido
Ativadas na presença de agentes oxidantes e substância
reagem com grupo sulfidril, p-cloromercuriobenzoato (PCMB)
Bromelina, ficina e papaina são as principais cisteina-proteases
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio Ativo
Cisteína-Protease Papaína Cys25, His159,Asp158
Císteina, Histidina, Ácido aspártico
21.
22. Proteases aspárticas ou acidas
(EC 3.4.23)
Contém ácido aspartico em seu sitio ativo;
Inibidas por 1,2-epoxy-3-p-nitrofenoxipropano (EPNP) na presencça de íons cobre;
Maior atividade em valores de pH ácido e maior afinidade por ligações que envolvem
aminoacidos apolares e aromáticos
Pepsina e a renina
Proteases microbianas fungicas
gêneros Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Neurospora, Endothia e Rhizomucor
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio Ativo
Protease aspártica Pepsina de Peniciluim sp. Asp33 , Asp213
23. O mecanismo geral de base-ácido para a hidrólise do polipeptidio catalisado por proteases aspárticas
(Figura),
Requer um resíduo Asp, a fim de ser protonado, enquanto o segundo não é ionizado;
Os dois aspartatos compartilhar um protões a um pH fisiológico;
A ligação amida sofre ataque por uma molécula de água que é ativado pelo resíduo de ácido aspártico
catalítico desprotonado.
24. Metalo-Proteases
Dependem de íons metálicos divalentes para sua atividade;
Inibidas por agentes quelantes, como ácido etilinodiaminotetracético (EDTA)
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio
Ativo
Metalo-protease Carboxipeptidase Zn , Glu270, Try248
Neutras: colagenases de Costridium bystoliticum
elastases de Pseudomonas aeruginosa
Termolisina - protease neutra comercial de alta termoresistência
Alcalinas:
gêneros Serratia e Myxobacter, com atividade pH 7,0 a 9,0
25. Proteases Vegetais
Mais empregadas na indústria de
alimentos
Consideradas seguras para consumo
humano
Papaina, bromelina e ficina
26. Papaina (EC. 3.4.22.2)
É uma cisteína-protease extraída do látex dos frutos do mamoeiro
(Carica papaya)
Comercializada a forma de extrato bruto que contem:
Papainas (QP-A)
Quimopapaina (QP-B)
Apresenta atividade proteolítica em valores de pH 5,0 a 9,0
Enzima permanece estável até 90º C
Apresenta atividade sobre ligação éster e amida e boa atuação na síntese de
peptídeos
27.
28. Bromelina (EC. 3.4.22.4)
É uma cisteina-protease extraída do pendúnculo
do fruto do abacaxizeiro (Ananas comusus)
Atividade ótima pH 6,0 a 8,0
Perda atividade > 70º C
29. Ficina
Extraída do látex de diversas espécies
do gênero Ficus
Apresenta maior atividade: pH 6,0 a 8,0
Temperatura estável até 60º C
Baixa especificidade de substrato e
hidrolisa ligações que envolve diversos
aminoácidos
30. Proteases microbianas
São excelentes fontes de enzimas
em razão da grande diversidade e
produção em escala
Representam 40% do total utilizado
no mercado de enzimas
31. Origem bacterianas
Gênero Bacillus e Geobacillus
Proteases neutras:
Ativas pH 5,0 a 8,0
Baixa estabilidade térmica
Preferência ligações hidrofóbicas
Proteases alcalinas:
pH 8,0 a 11,0 – temperatura 50 a 60º C
Baixa especificidade de substrato mais utilizadas na
indústria de detergentes
32. Origem fúngica
Aspergillus oryzae produz três proteases extracelulares
Extrato é obtido por fermentação
Atividade proteolítica pH 4,0 a 11,0
Temperatura ótima 40º C
Inativas a 50º C
33. Clarificação de cerveja
Após fermentação alcóolica a cerveja passa por um período de
maturação (cerca de C)
A duração da maturação depende do tipo de cerveja
Varia de poucos dias a varias semanas
Finalidade é a destruição de diacetil (substância de sabor
desagradável que se acumula durante a fermentação)
O diacetil é transformado em acetoína pela adição de enzimas
como acetolactato-descaboxilases e diacetil-redutases
34.
35. Turvação da cerveja
Interação de compostos fenólicos e polipeptídios provenientes do malte e de
cerais não-maltados, que insolubilizam em temperatura baixa;
A simples filtração não garante nova precipitação portanto é necessário
tratamento com proteases;
As proteases hidrolisam os peptídeos e impedem que eles se insolubilizem,
evitando a turvação;
Em geral é usado papaínas pois tem baixa especificidade e hidrolisam peptídeos
de diferentes fontes e tem baixo preço no mercado;
36. Uso de proteases na cerveja
Seu uso é permitido em alimentos
Apresenta alta estabilidade térmica
permanecendo ativa após a operação e
pausterização e ao longo de vida ativa ao
longo da vida de prateleira
Chamado, no qual o uso de papaína vem
sendo substituído pela aplicação de proteases
microbianas
37. Formação de espuma na cerveja
A presença de proteínas é vital a
formação de espuma em cervejas com
alta massa molécula.
A adição de papaina não afeta a
formação de espuma, pois as
substâncias envolvidas nesse processo
são moléculas complexas formada por
resíduos de polipeptideos e polifenóis e
carboidratos, além de fosfato, não
constituindo substrato para a papaina.
38. Panificação
As farinhas de trigo para uso industrial são classificadas de acordo com seu conteúdo
de proteínas
Variam de 5 a 20%
Essa variação deve-se a fatores genéticos. Ambientais e de manejo do trigo
Fração proteica do trigo: chamada glúten
A força do glúten é uma função da concentração dessas proteínas e da sua composição
Formada por dois constituintes básicos:
Glutelina – proteína fibrilar se dispõem em forma de rede
Gliadina – proteína globular que interage com a glutelina
39.
40. Essas proteínas são a farinha a propriedade de formar uma
massa visco elástica com capacidade de reter o ar.
41. GLÚTEN
A rede de glúten é formada por ligações do tipo de
dissulfeto e quanto maior o numero dessas ligações
mais difícil será trabalhar a massa;
A quantidade de proteína na farinha e a proporção
de seus constituintes determinam as características
de extensibilidade e de elasticidade da massa e do
produto final;
Uma massa de pão que contem pouco glúten gerará
um produto pouco macio incapaz de se expandir
pela ação do gás produzido pelo fermento químico.
Com glúten
Sem glúten
42.
43. Modificação do GLUTEN
As propriedade do glúten e redução da força pela
adição de metabissulfito de sódio que torna a farinha
mais adequada a finalidade desejada (produção de
bolos, biscoitos, etc)
A utilização deste produto é regulamentada por
legislação especifica para cada pais
Uma alternativa é utilizar proteases
44. Uso das proteases na panificação
As proteases modificam a rede proteica pela quebra das ligações
peptídicas
A extensão da quebra depende do tipo de protease utilizada, sua
concentração e do tempo de reação
Fornece produto mais macio
Menor densidade
Aparência agradável
Eliminina o sabor (after taste) provocado pelo metabissulfito
45. Uso de proteases na panificação
Na etapa de maceração mecânica a finalidade é o rompimento das
cadeias polipeptídicas do glúten para que essa rede formada por
essas proteases não impeçam o crescimento da massa;
As protease hidrolisa os constituintes do glúten reduz o tempo de
trabalho mecânico em até 30%
As proteases utilizadas Aspergillus oryzae e A. ninger
Consideradas seguras para o consumo;
Apresentam baixa especificidade
São menos ativas que as protease vegetais o que garante a
integridade do glúten
46. A aplicação das proteases é feita durante a fase de
fermentação para que haja tempo para sua ação,
uma vez que são inativas na temperatura do forno.
47. Cheiro e sabor de pão
A hidrólise enzimática permite a liberação de grupos –NH2 e –COOH
pelo rompimento da ligação peptídica entre eles;
Esses grupos reagem com o açúcar usando da formulação ou o
produzido pelo por -amilase
responsável é o desenvolvimento do sabor e da cor característico do pão
(reação de Maillard)
Utilizado a papaína ou bromelina, sendo a ultima mais efetiva, e
proteases neutra de Bacillus subtilis
48. Valor proteico das farinhas
Uso de proteases em farinhas com alto teor proteico, dará
origem a produtos com valor nutricional
Em biscoitos do tipo cracker o uso de proteases de A. oryzae permite
a abertura homogênea da massa e evita deformação do pão no
formo
Produção de bolos e waffers, que exigem farinhas com baixo
conteúdo de proteínas o uso de proteases vegetais pode substituir a
aplicação de metabissulfito de sódio