1. Conjugação e Transdução em
bactérias
Prof. Dra. Adriana Dantas
UERGS - Bento Gonçalves

2. RE PRODUÇ ÃO
• Reproduç ão A s s exuada
Divis ão celular / Fis s ão Binária
- A mitos e
- Duplicaç ão do DNA
- S eparação da c élula mãe em duas c éls -filhas
S epto de divis ão

3. RE PRODUÇ ÃO
• Reproduç ão S exuada
C onjugação
Trans ferência de plas mídios por pontes citoplas máticas
Trans dução
Introdução de fragmentos de DNA entre bactérias
Bacteriófagos
Trans formaç ão
A bs orção de fragmentos de DNA de bactérias lis adas
no meio

4. C LA S S IFIC A Ç ÃO
Pos itivas
• C orante de G ram
C hris tian G ram - 1884
Negativas
 Metodologia
C orante Violeta iodo (fixação) metanol (des coloração) S afranina
Paede Cel a + espessa
r ul r
 G ram Pos itivas F m o 1 º cor nt
ixa ae
A ou V et
zul iol a
Conta e
r st
Paede Cel a - espessa
r ul r
 G ram Negativas Descol a s
or da F m o 2° cor nt
ixa ae
V mel
er ho

5. C LA S S IFIC A Ç ÃO
• B actérias G ram-pos itivas
Várias es pécies de:
 E s treptococos ; E s tafilococos ; E nterococos
• B actérias G ram-negativas
 Vibrião colérico; C los tridium; s almonelas
goulart@ucg.br

7. GE NÉ TIC A B A C TE RIA NA
• Genomar aiv ment pequeno
el t a e
Compaa a G
r do o enomaE r o
ucaiot
• Cont t dir o com o cit a
ao et opl sma
Pr r os – A ê de caiot
ocaiot us ncia r eca
• Compost pordifer modaida de DNA
o entes l des
-Cromossomo
-Pl smídeo
a
-Ta
r nsposon
-Ba eró go
ct i fa

8. C ROMOS S OMO
• F adupl /Cir a
it a cul r
• Difuso nar ã nucl ó
egi o e ide
• T ma v r de a do com o gr
a nho aia cor upo
< Mycop lasm a genitalium (580 Kb )
Paa ax V l r
r sit ida iv e
> Myxococcus xanthus (920 Kb)
0
• G paao met bol e cicl v l
enes r a ismo o ita
it í
• Const udo porpat codifica es
res nt
A ê de Introns e R õ Int gê s
us ncia egi es er nica
• Const uem Rep licons
it
Unida mol aes ca zes de r ç o a ô
des ecul r pa eplica ã ut noma

9. PLA S MÍDE O
• M é ade DNAcir a
ol cul cul r
• T ma v rá el
a nho ai v
1.0 0x /10 0 x cr
0 .0 0 omossomo ba er no
ct ia
• M ior da ba éia ta ta1 ou + t
a ia s ct r s r nspor ipos
• G “a óios”
enes cess r
Nã essencia àsobr iv nciada ba éia
o is ev ê s ct r s
R ê àa ibióicos, pr ç o de t s, ...
odu ã oxina
Sel ç o Naur l
eã t a esist ncia nt t
A pt bil de em condiç es especia
da a ida õ is
• A idos pel Conj ç o
dquir a uga ã
R oduç o sexua
epr ã da
Ta ê porpont cit a áica
r nsfer ncia es opl sm t s

12. TRA NS POS ON
• Fr gment de DNAl rde t ma v rá el
a os inea a nho ai v
í
Mnimo 5 Kb
• Codificapr ena a óia
ot í s cess r s
E er oxina enzima degr daiv s
nt ot s, s a ta
• Eement mó eis
l os v
Ca zes de inser em no cr
pa ir omossomo ba er no
ct ia
• Ta ç o
r nsposi ã
A ó ainser ã deixa có s no st e se desl m damol cul
ps ço m pia í io iga é a
• IS– Seqü ncia de inser ã
ê s ço
Responsá elpel pr
v o ocesso de t a ç o
r nsposi ã
Seqü ncia especifica de DNA(~10 0pb )
ê s s 0
CodificaTa
r nsposase

13. B A C TE RIÓFA GO
• DNAde or v a
igem ir l
• Inser ã do DNAv a no cr
ço ir l omossomo ba er no
ct ia
• Vr ba eró gos ta t m genes que codifica faor de v ul ncia
áios ct i fa r nspora m t es ir ê
oxina éica
Coryneb acterium d ip htheriae – t dift r
Clostrid ium b otulinum – t bot í
oxina ulnica
Escherichia coli – cit oxina
ot
• Conv sã de ba éia nã paogê s em paogê s
er o ct r s o t nica t nica
A ó infecç o porba eró gos
ps ã ct i fa

14. Variabilidade
 Embora as mutações sejam responsáveis
pela expressão de várias novas
características por uma célula, muitos dos
fenótipos expressos pelos microrganismos
procarióticos são decorrentes da aquisição
de novos fragmentos de DNA, por meio de
processos de transferência horizontal de
genes.

15. Processos de Transferências
 Transformação
 Conjugação
 Transdução.
 Conversão lisogênica

16. Transformação
 É definida como um processo de incorporação
de DNA na forma livre, geralmente decorrente
da lise celular.
 A partir de seu descobrimento, foi demonstrado
formalmente que o DNA era a molécula
envolvida na hereditariedade (F. Griffith, 1928).
 Várias bactérias Gram positivas e negativas são
naturalmente transformáveis, entretanto, dentro
de um gênero, nem todas as espécies o são.

17. Reprodução Bacteriana
Transformação
 Reprodução sexuada
 A transferência de material genético ocorre
quando uma célula receptora capta DNA
solúvel liberado no meio por células
doadoras.

18. Transformação natural
 Processo de incorporação de DNA exógeno na forma livre,
geralmente decorrente da lise celular ou extraídos de
células doadoras.
 Para que ocorra transformação a célula deve ser
competente, isto é, deve apresentar sítios de superfície
para a ligação do DNA da célula doadora e apresentar a
membrana em uma condição que permita a passagem
deste DNA.
 Envolve a participação de diferentes proteínas (proteína de
ligação ao DNA, presente na membrana, autolisinas,
nucleases), sendo um processo variável entre os
microrganismos (nem todos apresentam competência).
 Exemplos de bactérias naturalmente competentes:
Bacillus, Streptococcus, Neisseria

19. Célula transformada (recombinante)

20. Processo de Transformaçao
 Na natureza, o processo ocorre quando uma célula sofre
lise, liberando seu DNA.
 Este, por ser de grande tamanho tende a sofrer quebras,
originando centenas fragmentos de aproximadamente 15
kb (o equivalente a cerca de 15 genes, em Bacillus
subtilis).
 Como uma célula absorve poucos fragmentos, apenas
uma pequena proporção de genes podem ser transferidos.
 Inicialmente, para que o processo ocorra, é necessário que
a cél. encontre-se competente, isto é, deve apresentar
sítios de superfície para a ligação do DNA da célula
doadora e apresentar a membrana em uma condição que
permita a passagem deste DNA.

21. Competência celular
 Aparentemente, o número de sítios disponíveis para a
ligação do DNA é limitado. Esta captação parece estar
relacionada a uma pequena sequência, de 10 a 12 pares
de bases, presente no DNA exógeno.
 Em Haemophilus, foi demostrada a presença de uma
proteína que reconhece e liga-se a uma sequência 5’ -
AAGTGGGTCA - 3’, muito comum no genoma deste
microrganismo, garantindo que somente ocorrerá a
captação de DNA de espécies muito similares.
 A competência é um processo que depende de várias
condições distintas nos diferentes microrganismos. Sabe-
se que a fase de crescimento e as condições ambientais
desempenham um papel de extrema importância no
processo. Além destes, a temperatura e a concentração de
cátions também influenciam a eficiência do processo.

22. Captaçao do DNA
 A captação do DNA também é diferente entre
Gram positivos (G+) e Gram negativos (G-):
 Nas G+ o DNA é captado como dupla hélice e
absorvido como fita simples, sendo uma das fitas
degradadas.
 Nas G-, o DNA é absorvido como fita dupla,
embora apenas uma das fitas participe do
processo de recombinação. Independente do tipo
celular, a ligação do DNA à célula é mais eficiente
quando está como fita dupla.

23. Ligação do DNA
 As células competentes ligam o DNA com muito
mais eficiência que células não competentes (1000
vezes mais).
 Streptococcus pneumoniae é capaz de ligar apenas
cerca de 10 moléculas de DNA de dupla fita, de 15
a 20 kb.
 Quando são absorvidas, como DNA de fita simples,
estas passam para cerca de 8 kb.
 Em Haemophilus influenzae, é necessário que o
DNA tenha uma sequência específica de 11 pb,
para que haja a ligação irreversível e o DNA seja
captado.

24. Integração do DNA:
 O DNA liga-se a proteínas na superfície celular, sendo em
seguida absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas
por nucleases antes da absorção.
 À medida que o DNA é absorvido no interior da célula, este
se associa a proteínas de ligação ao DNA de fita simples,
protegendo-o de degradação.
 A proteína RecA também participa deste processo,
associando-se à fita e promovendo a recombinação.
 Há então a degradação do que resta da fita simples e
formação de um DNA híbrido, que na replicação originará
uma molécula parental e outra recombinante.

25. Transformação em
Streptococcus, um
organismo Gram positivo.
O autoindutor (1) ao
encontrar o receptor (2)
interage com este,
promovendo a ativação de
vários genes (3, 4 e 5) dentre
eles as autolisinas,
nucleases e proteína de
ligação ao DNA.
Uma das fitas do DNA passa
a ser captada pela célula,
enquanto a outra é
degradada (6).
Ao penetrar na célula a fita
simples é protegida por
proteínas. Caso este DNa
encontre uma região
complementar, a proteína
RecA auxiliará sua
recombinação com o DNA
endógeno (7).

26. Conjugação
 Processo de transferência de DNA de uma bactéria para
outra, envolvendo o contato entre as duas células (Tatum
& Lederberg, 1946).
 A conjugação está associada à presença de plasmídeos de
natureza F.
 Estes plasmídeos contêm genes que permitem a
transferência do DNA plasmidial de uma célula para outra
ou, em outras palavras, a capacidade conjugativa.
 Quando a célula porta um plasmídeo de natureza F é
denominada F+, doadora, ou macho, enquanto células
desprovidas de tais plasmídeos são denominadas F-,
receptoras, ou fêmeas.

28. Reprodução Bacteriana
Conjugação
 Reprodução sexuada
 É um processo de transferência de material genético,
promovido por plasmídios conjugativos.

29. Conjugação
 Transferência de genes através do contato entre
células bacterianas. O DNA é transferido
diretamente de uma bactéria para outra.
 2 tipos de células envolvidas na conjugação:
 Doadora: possui plasmidio F (fertilidade)
denominada célula F+
 Receptora: não possui plasmídio F, denominada
célula F-

30. Células Hfr (high frequency of recombination) são células onde o
plasmídio F torna-se integrado ao cromossoma. Possuem maior
capacidade conjugativa ou de transferência.

31. Transferência do plasmídio F de uma célula doadora (F+) para célula receptora (F-)

32. O cruzamento entre célula Hfr x F- resulta na transferência de
fragmentos de DNA cromossomal de uma célula para outra.
Raramente ocorre transferência completa dos genes do plasmídio F
então a célula receptora continua F- porém incorpora genes da célula
doadora em seu genoma (recombinação)

33.  A capacidade conjugativa está associada à presença de
determinados genes localizados em um operon
denominado tra.
 Estes genes conferem uma série de características
envolvidas na conjugação tais como a síntese do pilus F,
responsável pelo reconhecimento e contato entre as
células, assim como a transferência do DNA plasmidial.
 Eventualmente, os plasmídeos podem ser integrados no
cromossomo, sendo este processo mediado por pequenas
seqüências de DNA denominadas IS (insertion
sequences).
 As células apresentados tais plasmídeos integrados são
denominadas Hfr (do inglês High Frequency of
Recombination). Quando integrados, esses plasmídeos
podem mobilizar a transferência de genes cromossomais
também.

34. Conjugaçao em gram negativas
 Dois tipos:
– entre células F+ e F-, resultando em duas células F+
– entre células Hfr e F-, resultando em uma célula Hfr e outra F-.
 Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provável de
transferência do DNA seja pelo círculo rolante, onde apenas uma das
fitas é transferida, sendo a fita complementar sintetizada pela célula
receptora.
 O estímulo para o disparo do processo seja o contato das células.
Assim, a conjugação envolve a passagem de DNA de uma célula F+
para outra F-, que torna-se então F+ também.
 Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da célula Hfr para a
receptora, promovendo extensas recombinações.

40. Transdução bacteriana
 Transferência de informação genética
mediada por um bacteriófago
 Transferência mediada por vírus, podendo
ser generalizada (qualquer fragmento de
DNA) ou especializada (determinados
genes, passados por fagos temperados).

41. Reprodução Bacteriana
Transdução
 Reprodução sexuada
 É a transferência dos genes cromossômicos ou de
moléculas de plasmídios de uma bactéria para
outra, por meio de um bacterófago.

43. Bacteriófago
 Um fago (também chamado bacteriófago) é um pequeno
vírus que infecta apenas bactérias.
 Da mesma forma que vírus que infectam eucariontes, os
fagos consistem numa proteína exterior protetora e no
material genético (dupla hélice em 95% dos fagos
conhecidos) dentro da cápsula de 5-650 Kbp (1 Kpb =
1.000 pares de bases).
 Os fagos foram descobertos independentemente por
Frederick Twort em 1915 e por Félix D’Herelle em 1917.

44. Fagos
 Fagos infectam especificamente bactérias.
 Alguns fagos são virulentos, significando que uma vez que
a célula tenha sido invadida, eles imediatamente iniciam
seu processo de reprodução, e em pouco tempo "lisam"
(destroem) a célula, lançando novos fagos.
 Alguns fagos (bem conhecidos como fagos temperados)
podem ao contrário entrar em um estado relativamente
inofensivo, e então integrar seu material genético no DNA
cromossomal da bactéria hospedeira (muito semelhantes
aos retrovírus endógenos em animais) ou estabelecendo-
se a si mesmos como plasmídeos.

45.  Estes fagos endógenos, referidos como profagos, são
então copiados a cada divisão celular junto com o DNA da
bactéria hospedeira.
 Eles não matam a célula, porém monitoram (via algumas
proteínas que eles codificam para isto) o estado de seu
hospedeiro.
 Quando a célula do hospedeiro mostra sinais de stress
(significando que ela esteja próxima de sua morte), os
fagos endógenos tornam-se ativos novamente e iniciam
seu ciclo reprodutivo, resultando na lise de célula
hospedeira.
 Um exemplo é o fago lambda da E. coli. Algumas vezes,
mesmo profagos podem prover benefícios para as células
hospedeiras enquando dormentes, pela adição de novas
funções ao genoma da bactéria, um fenômeno chamado
conversão lisogênica.

46. Importância na biologia molecular
 Utilizados como vetores de clonagem para inserir
DNA bas bactérias.
 Eles estão sendo também avaliados por
pesquisadores médicos como uma alternativa aos
antibióticos para tratar infecções por bactérias
(porque matar bactérias é o que os fagos fazem
de melhor).
 Phage display é um teste para investivar
interações de proteínas pela integração de
múltiplos genes de um banco de genes em fagos.

47. Transdução generalizada
 Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este
processo também ocorra em outras bactérias, tais como E. coli.
 Este tipo de processo requer a ocorrência de um ciclo lítico, onde
eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA
da célula hospedeira, gerando partículas denominadas partículas
transdutoras, que correspondem ao capsídeo viral contendo em seu
interior DNA bacteriano.
 Embora não possam ser descritas como vírus, as partículas
transdutoras exibem a capacidade de adsorção à superfície de outras
células bacterianas.
 A frequência com que um determinado gene é transferido é baixa uma
vez que cada partícula transdutora leva apenas um determinado
fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cél. recebem um determinado
gene).

48. Transdução generalizada: durante um ciclo lítico, pode haver a incorporação de DNA
bacteriano no capsídeo viral. Este DNA poderá ser transferido para outra bactéria, pois os
processos de adsorção e injeção de DNA dependem da estrutura do vírus, independente
do tipo de DNA contido em seu interior .

49. Transdução especializada:
 Evento raro, embora bastante eficiente.
 O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto
foi a transferência de um genes que codificam produtos
envolvidos na degradação de galactose pelo fago l de E.
coli.
 A etapa inicial no processo corresponde à infecção e
lisogenização do fago, que ocorre em sítios específicos do
genoma.
 Neste caso, a integração do fago ocorre adjacente ao
conjunto de genes envolvidos na utilização de galactose.

50. Transdução especializada
 Pela ação de algum indutor (ex: UV) há a separação do
fago do genoma (integração reversa), que normalmente
ocorre perfeitamente.
 Entretanto, em alguns casos, essa separação é defeituosa,
promovendo a remoção de genes bacterianos e deixando
parte do genoma viral na célula.
 Essas partículas podem ser de dois tipos:
– aquelas que carregam genes gal
– outras que carregam genes bio.
 Aquelas partículas levando genes gal são denominadas
ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque são
incapazes de formar partículas virais maduras (porque
deixam no hospedeiro o gene que codifica a proteína
integrase).

51. Transdução especializada: este processo é dependente da ocorrência de um ciclo
lisogênico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e após um determinado período de
tempo e de acordo com certos estímulos, este fago pode iniciar um ciclo lítico. Caso a excisão
do DNA viral ocorra de maneira defeituosa, poderá haver a transferência de um pequeno
fragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficará incorporado ao genoma
bacteriano). Este vírus "defeituoso" poderá transferir o DNA bacteriano para outras células.

52. Conversão lisogênica:
 Transferência de genes de fagos para bactérias.
A própria lisogenização torna a bactéria imune a
outras infecções por este fago, mas além disso,
outros fenótipos podem ser adquiridos.
 O exemplo mais clássico consiste na conversão de
células atoxigênicas de Corynebacterium
diphtheriae em toxigênicas, pelo fago ß. Assim, a
bactéria recebe um gene que codifica uma toxina,
sendo este gene de origem viral.

53. Biologia do Bacteriofago
 Um dos vetores mais utilizados nos
processos de clonagem molecular é o
denominado bacteriófago λ, o qual
comporta-se como um vírus da E.coli.
 O fago λ é um parasita obrigatório da
E.coli, o qual necessariamente deve injetar
o seu DNA na bactéria hospedeira para a
sua multiplicação.

54. Infecção da E .coli o genoma do fago
pode seguir duas vias:
 a) Estado lítico, o DNA do fago permanece na bactéria como uma
molécula independente, havendo a ativação de alguns genes do fago
e a concomitante inativação de outros, dentro de um programa
estritamente definido.
 Como resultado o cromossomo do fago é replicado ativamente, ocorre
a síntese das proteínas da capa e da cauda, formam-se novas
partículas virais.
 Em aproximadamente 45 minutos após a infecção a célula hospedeira
é lisada havendo a liberação de cerca de 100 novos fagos.

55. Infecção da E .coli o genoma do fago
pode seguir duas vias:
 b) Estado lisogênico:
 Neste caso, o DNA do fago é integrado no cromossomo da
bactéria passando a ser chamado profago.
 No estado lisogênico, todos os genes do profago estão
inativos com excessão do gene que produz a proteína
repressora.
 A bactéria hospedeira carregando o profago multiplica-se e
este é replicado passivamente e distribuído para as
bactérias descendentes.

56.  Em condições naturais a opção entre seguir o
estado lítico ou lisogênico depende das condições
do meio.
 Assim, via de regra em meio rico em nutrientes o
estado lítico é preferencial, por exemplo o fago λ
na bactéria E.coli intestinal.
 Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como
é o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado
lisogênico.
 Em condições experimentais, o estado a ser
seguido depende de um balanço entre os fatores
do meio intra e extra celular e de fatores genéticos
da bactéria hospedeira e do bacteriófago

57. Genoma do fago λ
 O bacteriófago lλ é uma partícula viral constituída de
aproximadamente 50% de proteínas e 50% de DNA.
 O DNA do fago λ, na forma como ele é isolado da partícula viral, é
uma molécula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares
de bases.
 As extremidades da molécula contém uma fração de DNA fita simples
com cerca de 12
 nucleotídeos, os quais são complementares na sequência de bases e
através delas é que o DNA assume a forma circular quando ele é
injetado na célula hospedeira.
 Estas extremidades são denominadas de sítio cos.
 O genoma do fago λ codifica para aproximadamente 50 proteínas,
cujos genes tem um cronograma de expressão bem definido, o que
determina a instalação do estado lítico ou lisogênico.