RESOLUCIÓN 2115 DE 2007

Capitulo III – Articulo 10

Técnicas aceptadas para realizar los análisis microbiológicos del agu...
 Protozoo flagelado.
 Pertenece al orden Diplomonadida.
 Parasita el tracto digestivo de humanos y otros
mamíferos, pro...
EPA 1623

CONTEO STOCK

FILTRACION

CONTEO
SPIKE

ELUSION Y
CONCENTRACIÓN

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SEPARACIÓN
INMUNOMAGNETICA

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Barómetro
Proceso que consiste en la separación de

Mide la
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60-70 bares
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 ELUSIÓN. Consiste en una fase de lavado y
descompresión que se le hace al cartucho de
filtración con buffer PBST, en el ...
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Lectura de la muestra Cryptosporidium

FITC

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  1. 1. RESOLUCIÓN 2115 DE 2007 Capitulo III – Articulo 10 Técnicas aceptadas para realizar los análisis microbiológicos del agua para consumo humano Deben ser validadas por el Instituto Nacional de Salud, INS, o revalidadas por este con base en documentos soporte de organismos internacionales que presenten los solicitantes. Giardia y Cryptosporidium El valor aceptable es de cero (0) Quistes y para Cryptosporidium debe ser de cero (0) Ooquistes por volumen fijado según la metodología aplicada. GENERALIDADES DEL METODO Es un método desarrollado para la determinación, identificación y concentración de Cryptosporidium y Giardia en matrices acuosas por filtración , separación inmunomagnetica (IMS) y análisis por microscopia de Inmunofluorescencia (FA) Giardia y Cryptosporidium se pueden confirmar usando 4´6-diamidino-2 phenylindole (DAPI) que se tiñe y se observa por microscopia diferenciada de contraste . Este método no identificara las especies de Cryptosporidium o de giardia o las especies del huésped de origen, ni puede determinar la viabilidad o la inefectividad de quistes u Ooquistes detectados
  2. 2.  Protozoo flagelado.  Pertenece al orden Diplomonadida.  Parasita el tracto digestivo de humanos y otros mamíferos, produciendo la patología giardiosis.  Carecen de ciertos orgánulos como son las mitocondrias y el aparato de Golgi.  Alimentación por fagocitosis y pinocitosis.  Reproducción por división binaria longitudinal. SE PRESENTA EN DOS FORMAS TROFOZOÍTO: Posee dos núcleos y cuatro pares de flagéelos un disco suctorio (órgano de fijación) en la mitad anterior de la superficie ventral. QUISTE: ovoide, de 8 a 14 mm. de largo por 7 a 10 mm. de ancho, con 4 núcleos y el doble de estructuras flagelares que el trofozoíto; es la forma infectante. Es un protozoario, parásito unicelular que viven los intestinos de los animales y humanos. Pertenece a la familia de los coccidios Este patógeno microscópico causa una enfermedad llamada criptosporidiosis La forma inactiva del Cryptosporidium es el ooquiste, El ooquiste tiene una estructura esférica o ligeramente ovoidal que mide de 4 a 6micras de diámetro. Cuando se observa con microscopía de contraste de fases se ve que posee una doble pared y una estructura interna formada por 4 esporozoitos vermiformes y cuerpos residuales que no son claramente visibles. Esta pared lo hace resistente por lo que puede sobrevivir bajo una gran variedad de condiciones ambientales Los Ooquistes de Cryptosporidium están presentes al menos en el 50% de las aguas superficiales del mundo. Son los más resistentes de los patógenos entéricos conocidos a los desinfectantes habituales en el tratamiento de agua para consumo Las concentraciones habituales de cloro no son suficientes para matar al organismo. Asimismo los quistes de Giardia (8-12 μm) y los ooquistes de Cryptosporidium (4-6 μm) son bastante pequeños por lo que pueden no ser eliminados durante la filtración.
  3. 3. EPA 1623 CONTEO STOCK FILTRACION CONTEO SPIKE ELUSION Y CONCENTRACIÓN IPR SEPARACIÓN INMUNOMAGNETICA OPR MS TINCIÓN CON INMUNOFLUORESCENCIA
  4. 4. Barómetro Proceso que consiste en la separación de Mide la presión la cual debe estar entre 60-70 bares o psi uno o más elementos sólidos de un fluido, mediante el paso de la mezcla a través de un elemento poroso filtrante, llamado filtro Totalizador Se basa en la filtración de un volumen adecuado de agua a través de un filtro de anillos de espuma Mide la cantidad de agua que pasa por el equipo m3 comprimidos, con tamaño de poro de 1.2 micras que permite la retención de Giardia y Cryptosporidium presentes en la muestra Rotametro Housing Base donde se coloca el filtro Mide el caudal de agua filtrada
  5. 5.  ELUSIÓN. Consiste en una fase de lavado y descompresión que se le hace al cartucho de filtración con buffer PBST, en el cual quedaran re suspendidas las partículas que fueron filtradas. CONCENTRACIÓN Esta etapa consiste en la reunión de la mayor cantidad de partículas suspendidas en el buffer de la elusión, pasando por una membrana de nitrocelulosa con diámetro menor a 1.2 micra CENTRIFUGACIÓN: Consiste en la separación de partículas de diferentes características teniendo en cuenta la densidad , sedimentando los sólidos o partículas de mayor densidad en este caso son los Ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia.
  6. 6. La separación Inmunomagnetica (IMS) utiliza perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos que selectivamente atrapan los (oo)quistes de Cryptosporidium y Giardia. En esta etapa es importante el tiempo y el movimiento del Dyal , ya que la rotación ayuda a la interacción de las perlas con los antigenos del parásitos. Los anticuerpos ligados a las partículas se unirán de forma selectiva lo quistes/ooquistes formando unos complejos. Dichos complejos se separan mediante un concentrador inmunomagnético (Dynal MPC). Los desechos se descartan, resultando un pequeño volumen de muestra purificada que contiene los organismos. Los parásitos son posteriormente disociados mediante un tratamiento ácido (Ácido clorhídrico) y de vórtex, que rompen los lazos de los complejos, liberando los organismos e impidiendo la reorganización de estos.
  7. 7. Lectura de la muestra Cryptosporidium FITC Se debe emplear la ampliación de 200X Se utiliza epifluorescencia para explorar el pozo buscando formas de quistes y ooquistes de color verde manzana. Buscar formas ovoides o esféricas de 4-6 um. DAPI Se debe emplear la ampliación de 400X. Se usa el bloque UV del filtro para DAPI, el objeto debe exhibir una de las siguientes características: a) una coloración azul palida con un borde verde (DAPI -) , b) que se tiña internamente de azul intenso (DAPI +), C) se observan cuatro núcleos distintos, azul cielo (DAPI +). DIC Se debe emplear la ampliación de 1000X. Se buscan características morfológicas internas y externas anormales de los ooquistes (puntos, tallos, poros, núcleos, esporas, cloroplastos, etc). Cuando no se observan estas caracteristicas, se debe categorizar las formas: a) Un ooquiste vacío de Cryptoposridium, b) un ooquiste de Cryptosporidium con la estructura amorfa, c) un ooquiste de Cryptosporidium con estrucutras internas. Se debe registrar la forma, el tamaño (0.5 µm) y el número de esporozoitos. Lectura de la muestra Giardia Se debe emplear la ampliación de 200X Se observa luz fluorescente verde brillante alrededor de los objetos ovales (de 8-18 µm de largo por 5-25 de ancho). Se debe emplear la ampliación de 400X. Se usa el filtro para DAPI, el objeto debe exhibir una de las siguientes características: a) coloración interno azulada (ningún núcleos distintivo y un borde verde (DAPI -) , b) Coloración interna azul intenso (DAPI +), C) se observan dos o cuatro núcleos distintos, azul cielo (DAPI +). Se debe emplear la ampliación de 1000X. Se buscan características morfológicas internas y externas anormales de los ooquistes (puntos, tallos, poros, núcleos, esporas, cloroplastos, etc). Cuando no se observan estas caracteristicas, se debe categorizar las formas: a) Un quiste vacío de Giardia, b) un quiste de Giardia con la estructura amorfa, c) un quiste de Giardia con un tipo de estructura interna (núcleos, cuerpo mediano o axonemas), d) Un quiste de Giardia con más de un tipo de estructura interna. Se debe registrar la forma, el tamaño (0.5 µm) y el número de núcleos y presencia del cuerpo medio o los axonemas.
  8. 8. Sobre un porta depositamos una muestra en la que buscamos la presencia de un determinado antígeno. Añadimos un suero específico del antígeno problema marcado con isotiocinato de fluoresceína (conjugado). Si el antígeno problema se encuentra presente en la muestra, se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se elimina con un lavado del porta. La lectura se hace con un microscopio de fluorescencia cuya luz excita a una longitud de onda de 490-520 nm al isotiocianato de fluoresceína haciendo que emita luz fluorescente de color verde. La observación de luz verde fluorescente “tiñendo” un objeto del porta indica la presencia del antígeno en la muestra
  9. 9. Es un colorante fluorescente que pertenece al grupo de los colorantes de indol. Se usa para la tinción de ADN, para tinción nuclear, para la tinción de células vivas y para la contratinción en tinciones inmunofluorescentes. Para la determinación de (oo)quistes, este colorante presenta tropismo por la cromatina y se excita a una longitud de 450-470 nm (uv) Giardia Cryptosporidium
  10. 10. La microscopia de interferencia o técnica DIC (DiffentialInterference Contrast) Nomarski, permite la visualización de especímenes mucho más densos gracias a que la imagen proyectada es tridimensional, es decir, permite observar las estructuras externas e internas anormales de un microorganismo.

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