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ESTUDIO DEL EFECTO DE PROLONGAR 1 HORA EL TIEMPO DE INCUBACIÓN EN LA TÉCNICA DE SWIM-UP

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Objetivo: Determinar el efecto del tiempo de incubación prolongado sobre la recuperación de espermatozoides móviles en la técnica de swim-up.

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ESTUDIO DEL EFECTO DE PROLONGAR 1 HORA EL TIEMPO DE INCUBACIÓN EN LA TÉCNICA DE SWIM-UP

  1. 1. A U L A J O V E N Junio 2007 Vol. 12 • Nº1 23 INTRODUCCIÓN A AULA JOVEN En este número de la revista ASEBIR abrimos nuevamente la sección AULA JOVEN que da cabida a los trabajos, en formato breve, de los/las alumnos/alumnas que realicen prácticas en los centros de RA. Desde la vocalía de publicaciones animamos a todos los equipos de biología y de embriología a que “empujen” a sus miembros más jóvenes a realizar sus primeros pasos en la ardua tarea de publicar resultados y a éstos los animamos a compartir con todos nosotros sus primeros resultados. Esperamos que esta sección sea una herramienta útil en su aprendizaje. ESTUDIO DEL EFECTO DE PROLONGAR 1 HORA EL TIEMPO DE INCUBACIÓN EN LA TÉCNICA DE SWIM-UP 2 Núria Alcañiz , Ivan Solvas1, Mark Grossmann1, Francesca Vidal2, MCarme Pons1 1 Unitat de Reproducció Assistida. Centro Médico Teknon (Barcelona) ura@cmteknon.com. 2Unitat de Biologia Cel·lular. Universitat Autònoma de Barcelona RESUMEN Objetivo: Determinar el efecto del tiempo de incubación prolongado sobre la recuperación de espermatozoides móviles en la técnica de swim-up. Ubicación: Laboratorio de la Unitat de Reproducció Assistida de Centro Médico Teknon (Barcelona). Estudio incluido en la asignatura “Prácticas en empresa” de la titulación de Biología de la Universitat Autònoma de Barcelona (NA). Material: 44 muestras de semen con un volumen ≥1,5ml y una concentración y movilidad de espermatozoides que permitiese su preparación mediante la técnica de swim-up. Diseño: Preparar en paralelo dos fracciones de semen según el protocolo de swim-up descrito por la OMS y comparar la recuperación espermática (REM). - Grupo 1 (incubación estándar de 1h): 0,75 ml de semen se reparten en 3 tubos y se cubren con 0,5 ml de medio de cultivo por tubo. Incubación durante 60 min a 37ºC y 6%CO2, en posición inclinada de 45º. -Grupo 2 (incubación prolongado de 2h): Misma preparación pero con un período de incubación de 2h en las mismas condiciones. Medidas principales: Se valora volumen, recuento espermático, movilidad y morfología en cada muestra de semen y REM después del período de incubación. Conclusión: No se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre el REM de los dos grupos, por lo que no se considera útil aumentar el tiempo de cultivo en ninguna muestra. Palabras clave: swim-up, tiempo de incubación y REM ABSTRACT Objective: To assess the effect of incubation time (1h versus 2h) during swim-up technique on motile spermatozoa recovery. Centre: Laboratory of Unitat de Reproducció Assistida (Centro Médico Teknon, Barcelona). This study is included in the Biology degree at Universitat Autònoma de Barcelona of one of us (NA). Material: 44 semen samples with volume ≥1,5ml and appropiate spermatozoa concentration and motility to perfom the swim-up technique. Experimentl design: Two aliquots from the semen sample were processed in parallel as follows: -Method 1 (1h standard incubation period): 0,75 ml from the original semen sample were gently added to fresh medium at the bottom of 3 plastic tubes then placed in 45º angle for incubation during 60 min (37ºC and 6%CO2). -Method 2 (2h incubation period): 3 plastic tubes filled in similar way were incubated during 2h under the same in vitro conditions. Main mesurements: Volume, sperm count, motility and morphology in semen samples and REM in the recovered fractions. Conclusión: There are no statistically significant differences between the 2 groups. So it is useless to extend the period of incubation in any semen sample. Key words: swim-up, period of incubation, sperm count and motility after incubation
  2. 2. A U L A J O V E N Alcañiz, N. et al. Efecto de Prolongar... 24 INTRODUCCIÓN La técnica de preparación del se- A pesar de que el swim-up es men para Reproducción Asistida una técnica que presenta múltiples Las muestras de semen estudia- más utilizada en el laboratorio de re- ventajas, generalmente no se consi- das provinieron de pacientes que producción asistida y la recomenda- dera la técnica de elección en la consultan por esterilidad en la da por la Organización Mundial de preparación de muestras de semen Unidad de Reproducción Asistida la Salud (WHO, 1999) es el Swim- de baja calidad ya que su rendi- de Centro Médico Teknon, durante up o técnica de migración ascen- miento es inferior al obtenido por la el periodo comprendido entre Junio dente. técnica de separación por gradien- y Octubre de 2006. tes de densidad. Este protocolo se recomienda Cada muestra fue recogida en un por su sencillez y rapidez ya que la Por lo tanto, en un intento por frasco estéril entre 48 horas y no selección de los espermatozoides se aprovechar las ventajas que ofrece más de 7 días de abstinencia se- realiza de forma pasiva aprovechan- la técnica de swim-up, nuestro ob- xual, siempre por masturbación y do su capacidad natatoria para mi- jetivo fue valorar la utilidad de pro- sin utilizar lubricantes artificiales grar hacia el medio de cultivo. longar el tiempo de incubación so- (WHO, 1999). bre el rendimiento final, especial- Dicha capacidad natatoria de- mente en muestras de semen de Las muestras fueron analizadas pende de varios factores como el baja calidad. en la primera hora post-recolección porcentaje de espermatozoides mó- siguiendo los criterios de la OMS (WHO, viles y el tipo de movilidad de éstos, Por ello planteamos comparar 1999), con valoración de la concentra- así como de la composición del me- los resultados de incubar una alí- ción espermática mediante Cámara de dio de cultivo y del tiempo de incu- cuota de cada una de las muestras Neubauer Improved y estimación subje- bación (Andolz and Bielsa, 1995). de semen durante una hora (proto- tiva de la movilidad. colo OMS; WHO, 1999), con los re- La técnica de swim-up evita la sultados de incubar una segunda excesiva manipulación de la mues- alícuota de la misma muestra en las En total se aceptaron 44 muestras tra reduciendo el riesgo de contami- mismas condiciones de cultivo aun- cuya clasificación según los parámetros nación externa (Inaudi et al., 2002) que durante un período más largo, seminales OMS se muestra en la Tabla I. así como también reduce la genera- en concreto de dos horas. De cada muestra se utilizaron ción de Especies Reactivas de dos alícuotas que fueron procesa- Oxigeno (ROS) responsables de pro- MATERIAL Y MÉTODOS das independientemente mediante vocar daños en la membrana celu- lar de los espermatozoides (Aitken and Clarson, 1988) y disminuir la función espermática. Según Andolz y Bielsa los esper- matozoides seleccionados mediante la técnica de swim-up presentarían una mayor estabilidad nuclear así como una elevada tasa de penetra- ción en ovocitos de hámster (Andolz and Bielsa, 1995), aunque Sakkas et al. (2000) publicaron conclusio- nes opuestas ya que obtienen ma- yores porcentajes de espermatozoi- des con integridad de DNA usando, como método de capacitación, gra- dientes de densidad.
  3. 3. A U L A J O V E N Junio 2007 Vol. 12 • Nº1 25 la técnica de swim-up, e incubadas podía mejorar la calidad de la durante una o dos horas, respecti- La tabla II muestra las medias de muestra de espermatozoides recu- vamente. los parámetros seminales de las perados prolongando en 1 hora el muestras de semen procesadas y el periodo de incubación en el proto- Las muestras se procesaron se- rendimiento global obtenido con cada colo de swim-up, protocolo de capa- gún el protocolo establecido en uno de los tiempos de incubación. citación con las mínimas manipula- nuestro laboratorio (Solvas et al., ciones posibles. 2002). Brevemente, 1,5 ml de me- Como se ilustra en la tabla III, la dio de cultivo SpermRinse (Vitrolife‚) se repartieron en 3 tubos de fondo cónico (Nunc‚, 347856) y en cada uno de ellos cuidadosamente se de- positaron 0,25 ml de semen. Los tubos se incubaron en posi- ción inclinada a 37ºC y 6% CO2 du- rante el tiempo establecido tras lo cual los 2/3 superiores del sobrena- dante se recogen en un único tubo. Se valoró la muestra recuperada (volumen, recuento y movilidad) y se calculó el REM. Definimos REM como el recuen- to de espermatozoides con movili- dad traslativa que se obtienen tras la técnica de preparación de se- men. Así, REM-1 corresponde al número de espermatozoides móvi- les recuperados de la incubación de una alícuota durante 1 hora y REM- 2 al número de espermatozoides móviles recuperados de la incuba- ción de la otra alícuota durante dos horas. Tras la incubación una persona distinta a la que preparó las mues- tras se encargó de estimar la movili- comparación de las medias de Aunque se sabe que una incu- dad espermática, obteniéndose así REM-1 y de REM-2 analizando el bación prolongada de los esperma- una valoración “a ciegas”. conjunto de todas las muestras no tozoides humanos puede tener dio diferencias estadísticamente efectos deletéreos sobre la función El análisis estadístico se realizó significativas. Tampoco se observa- espermática, nuestro estudio no de- con el programa Instat de GraphPad‚, ron diferencias cuando se analiza- tecta diferencias en el REM, de ma- que comparó los resultados obteni- ron subgrupos en función de la al- nera que concluimos que un tiem- dos en una y dos horas de incuba- teración seminal que presentara la po de incubación de 2 h no es tiem- ción, es decir, se comparó el REM- muestra: oligo-, asteno- y teratozo- po suficientemente largo como para 1 frente al REM-2 con el test U de ospermia severa. disminuir la calidad de los esperma- Mann-Whitney y nivel de significa- tozoides recuperados, pero tampo- ción de P≤0,01. DISCUSIÓN co para mejorarla. RESULTADOS En este trabajo valoramos si se En la literatura científica no he-
  4. 4. A U L A J O V E N Alcañiz, N. et al. Efecto de Prolongar... 26 mos hallado estudios recientes so- tante, no merece la pena una incu- classic swim-up. Hum. Reprod bre el efecto del tiempo de incuba- bación prolongada de la muestra de 2002; 17:1288-91. ción en swim-up. Calamera et al., semen sea cual sea la calidad de publicaron un artículo donde anali- ésta puesto que en este trabajo no Jones R, Mann T, Sherins RJ. zaban el efecto de la incubación encontramos diferencias en la cali- Peroxidative breakdown of phos- prolongada en cuatro tiempos con- dad de la muestra recuperada. pholipids in human spermatozoa, secutivos (a las 1, 5, 23 y 47 horas) spermicidal properties of fatty sobre diferentes variables (movili- BIBLIOGRFÍA acid peroxides and protective ac- dad espermática, hiperactividad, tion of seminal plasma. Fertil Aitken RJ, Clarkson JS. Significance Steril; 31:531-37. niveles de ROS...). Y centrándo- of reactive oxygen species and an- nos en la movilidad espermática en tioxidants in defining the efficacy of Sakkas D, Manicardi GC, Tomlison M, la segunda observación, a las cinco sperm preparation techniques. J Mandrioli M, Bizzarro D, Bianchi horas, ya detectan una disminución Androl 1988; 9:367-76. PG, Bianchi U. The use of two den- del porcentaje de espermatozoides sity gradient centrifugation techni- móviles que se acentúa a lo largo Aitken RJ, West KM. Analisis of the ques and swim-up method to sepa- del tiempo de incubación relationship between reactive oxy- rate spermatozoa with chromatin (Calamera et al., 2001). gen species production and leu- and nuclear DNA anomalies. Hum cocyte infiltration in fractions of hu- Reprod 2000;15:1112-6. Nuestros datos no son compara- man semen separated on Percoll bles con los de Calamera et al., ya gradients. Int J Androl 1990; Solvas I, Grossmann M, Santaló J, que nuestro intervalo de estudio (1 13:4533-51. Pons MC. Estudio comparativo en- y 2 h) queda entre sus dos prime- tre dos métodos de swim-up. ras observaciones (1 y 5 h) en un Andolz P, Bielsa MA. Semen Revista ASEBIR 2002; vol. 7 intervalo en el que no realizan valo- Humano (Atlas y manual). 1ª ed. (2):28-32. raciones. Madrid: Editorial Garrisi; 1995. ISBN:84-7391-271-9. WHO. Laboratory manual for the Podría pues argumentarse que examination for human semen se podría alargar el tiempo de incu- Calamera JC, Fernández PJ, Buffone and sperm-mucus interaction. 4th bación más allá de las 2 h pero me- MG, Acosta AA, Doncel GF. Effects ed. Cambridge University Press; nos de 5 h para obtener mejores of long-term in vitro incubation of 1999. ISBN: 0-521-64599-9.0 rendimientos o bien para detectar human spermatozoa: functional efectos adversos (ya que en nues- parameters and catalase effect tro estudio no observamos diferen- Andrologia 2001; 33:79-86. cias), pero consideramos que esa opción carecería de interés práctico Inaudi P, Petrilli S, Joghtapour A, ya que no podría trasladarse a la ru- Trusso P, Petraglia F. Reduction of tina diaria de un laboratorio de FIV. steps in the preparation of motile sperm for intrauterine insemina- Como conclusión podemos afir- tion does not reduce efficacy of mar que en el laboratorio de FIV, the procedure: simplified one- donde el tiempo es algo muy impor- step swim-up method versus

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