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NUEVOS AVANCES EN EL ESTUDIO DE LA INTEGRIDAD DEL DNA ESPERMÁTICO

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La integridad del genoma paterno es de vital importancia en el inicio y mantenimiento de un embarazo a término tanto in vivo como in vitro. La presencia en el genoma del embrión de roturas en las cadenas del DNA y/o modificaciones a nivel de nucleótidos del DNA provenientes del genoma paterno, que pueden ser reparadas o no por el ovocito tras la fecundación, no es compatible con un desarrollo embrionario y fetal normal. Recientemente se ha demostrado que la fragmentación del DNA esper- mático es una causa potencial de infertilidad de causa desconocida. En esta revisión, los mecanismos responsables de frag- mentación de DNA en espermatozoides humanos, incluyendo la apoptosis en el epitelio de los túbulos seminíferos durante el proceso de espermatogénesis, defectos en el remodelado de la cromatina durante la espermiogénesis, el daño inducido por radi- cales libres (ROS) durante el transporte de los espermatozoides a través del epidídimo, la activación de caspasas y endonucle- asas espermáticas y el daño inducido por la quimio y radioterapia, serán discutidos. Además, los diferentes tipos de tests utili- zados para determinar la fragmentación del DNA espermático y sus aplicaciones al diagnóstico y tratamiento de la infertilidad, serán descritos. Por último, se plantearán preguntas frecuentemente formuladas sobre tests de fragmentación de DNA.

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NUEVOS AVANCES EN EL ESTUDIO DE LA INTEGRIDAD DEL DNA ESPERMÁTICO

  1. 1. A R T Í C U L O S Juan G. Álvarez et al. Nuevos avances en el estudio de.... 14 NUEVOS AVANCES EN EL ESTUDIO DE LA INTEGRIDAD DEL DNA ESPERMÁTICO New advances in the study of sperm nuclear DNA integrity Juan G. Álvarez. Centro de Infertilidad Masculina ANDROGEN, La Coruña. Instituto Marqués, Barcelona. Harvard Medical School, Boston, MA Resumen: La integridad del genoma paterno es de vital importancia en el inicio y mantenimiento de un embarazo a término tanto in vivo como in vitro. La presencia en el genoma del embrión de roturas en las cadenas del DNA y/o modificaciones a nivel de nucleótidos del DNA provenientes del genoma paterno, que pueden ser reparadas o no por el ovocito tras la fecundación, no es compatible con un desarrollo embrionario y fetal normal. Recientemente se ha demostrado que la fragmentación del DNA esper- mático es una causa potencial de infertilidad de causa desconocida. En esta revisión, los mecanismos responsables de frag- mentación de DNA en espermatozoides humanos, incluyendo la apoptosis en el epitelio de los túbulos seminíferos durante el proceso de espermatogénesis, defectos en el remodelado de la cromatina durante la espermiogénesis, el daño inducido por radi- cales libres (ROS) durante el transporte de los espermatozoides a través del epidídimo, la activación de caspasas y endonucle- asas espermáticas y el daño inducido por la quimio y radioterapia, serán discutidos. Además, los diferentes tipos de tests utili- zados para determinar la fragmentación del DNA espermático y sus aplicaciones al diagnóstico y tratamiento de la infertilidad, serán descritos. Por último, se plantearán preguntas frecuentemente formuladas sobre tests de fragmentación de DNA. Palabras clave: fragmentación de DNA, fecundación in vitro, radicales libres, estrés oxidativo, caspasas, endonucleasas, qui- mioterapia, radiación ionizante. Abstract: The integrity of the paternal genome is of paramount importance in the initiation and maintainance of a viable preg- nancy in vivo and in vitro. The presence in the embryonic genome of DNA strand breaks and/or modifications at the level of DNA nucleotides coming from the paternal genome, that have not been repaired by the oocyte after fertilization, is not compatible with normal embryo and fetal development. DNA fragmentation in human spermatozoa has been recently shown to be a potential cause of unexplained infertility. In this review, the mechanisms responsible for DNA fragmentation in human sperm, including apopto- sis in the seminiferous tubules epithelium, defects in chromatin remodeling during the process of spermiogenesis, and oxygen- radical (ROS)-induced DNA damage during sperm migration from the seminiferous tubules to the epididymis, the activation of sperm caspases and endonucleases and damage induced by chymo and radiotherapy, are discussed. Also the different tests used to determine DNA fragmentation in human sperm and their applications to the diagnosis and treatment of infertility, are presen- ted. Finally, answers to frequently asked questions about DNA fragmentation testing are also included. Key words: DNA fragmentation, in vitro fertilization, oxygen radicals, oxidative stress, caspases, endonucleases, chemotherapy, ionizing radiation. Introducción La integridad del genoma paterno radas por el ovocito después de la fer- to, y (ii) del grado de daño en las es de vital importancia en el inicio y tilización), es incompatible con un cadenas de DNA del espermatozoide mantenimiento de un embarazo a tér- desarrollo embrionario y fetal normal. que haya fecundado al ovocito. Dado mino tanto in vivo como in vitro. que la capacidad del ovocito de repa- Espermatozoides con DNA dañado Se estima que un 25% de las cau- rar este tipo de daño disminuye con la pueden fecundar ovocitos en metafa- sas de infertilidad masculina son de edad y que, al mismo tiempo, el nivel se II con la misma eficacia que esper- origen idiopático. La etiología de algu- de fragmentación de DNA en los matozoides con DNA intacto (Aitken nas de estas causas podría estar rela- espermatozoides aumenta, ello podría et al., 1998). Sin embargo, la presen- cionada con daño de DNA en los explicar, al menos en parte, la dismi- cia en el embrión de ciertas modifica- espermatozoides. Sin embargo, este nución significativa en la tasa de ciones a nivel de nucleótidos y/o frag- daño podría ser reparado por el ovoci- embarazo que se observa en parejas mentación en las cadenas del DNA to después de la fecundación. Esto va de edad avanzada. Este tipo de daño procedentes del complemento genó- a depender sobre todo (i) de la calidad en las cadenas de DNA podría encon- mico paterno (que no hayan sido repa- citoplasmática y genómica del ovoci- trarse en embriones con un comple-
  2. 2. A R T Í C U L O S Junio 2006 Vol. 11 • Nº1 15 mento cromosómico normal. Es decir, remodelado de la cromatina que tiene si se ha constatado es que cuando la presencia de daño de DNA no repa- lugar durante el proceso de espermio- existe oligospermia, la probabilidad de rado por encima de un umbral crítico génesis, (iii) fragmentación de DNA a que un espermatozoide con morfolo- en embriones generados tanto in vivo nivel post-testicular inducida por ROS gía normal sea aneuploide es mucho como in vitro, podría explicar el paro y caspasas/endonucleasas durante el mayor que si existe normozoospermia en el desarrollo embrionario que se paso de los espermatozoides a través (Burrello et al., 2004). Esto probable- produce tras la implantación de del epidídimo, (iv) fragmentación de mente esté relacionado con un blo- embriones con un cariotipo normal. DNA inducida por caspasas y endonu- queo madurativo parcial asociado a Estudios recientes sugieren que este cleases espermáticas, y (v) fragmenta- alteraciones meióticas. Por último, el tipo de daño se expresa a partir del día ción de DNA inducida por radio y qui- hecho de que un porcentaje variable 3 de desarrollo embrionario y ha sido mioterapia. De estos cinco mecanis- de espermatozoides en el eyaculado caracterizado como late paternal mos, quizás en el que juega un papel expresan marcadores apoptóticos del effects (Tesarik et al., 2004). más importante sea la fragmentación tipo de Fas, fosfatidilserina, Bcl-XL, de DNA a nivel post-testicular durante p53 (Sakkas et al., 2002) podría uti- Cabría puntualizar que el daño de el transporte de los espermatozoides a lizarse para seleccionar espermatozoi- DNA que pudiera encontrarse en el través del epidídimo. Esto viene avala- des no apoptóticos en muestras de embrión no tiene por qué estar exclu- do por estudios previos que demues- semen. Un método desarrollado sivamente relacionado con el daño de tran que la fragmentación de DNA es recientemente en esta dirección es el DNA en el espermatozoide que haya más alta en espermatozoides del epi- utilizado para separar espermatozoi- fecundado al ovocito. Este daño dídimo (Steele et al., 1999) y eyacu- des apoptóticos de espermatozoides podría provenir también del ovocito ó lados (Greco et al., 2005; Ollero et no-apoptóticos mediante el uso de las de ambos. Sin embargo, dado que (i) al., 2001) que en espermatozoides columnas de ANnexin-conjugated el análisis de fragmentación de DNA testiculares (Greco et al., 2005). MicroBeads (ANMB Microbead Kit, en gametos es destructivo, (ii) este Miltenyi Biotec, Germany). El princi- daño podría variar de un ovocito a 1. Inducción de apoptosis durante pio en el que están basadas estas otro, y (iii) el número de ovocitos es el proceso de espermatogénesis. columnas es que los espermatozoides limitado, esto no nos ha permitido Durante el proceso de espermatogéne- apoptóticos expresan fosfatidilserina estudiar hasta ahora la presencia de sis tiene lugar un screening celular en la hemicapa externa de la membra- esta patología en ovocitos. En cambio, importante que resulta en la induc- na y se unen a la anexina V. Al aplicar el uso de pruebas que permitan el ción de apoptosis en un 50-60% de un campo magnético a las columnas, estudio del grado de fragmentación de las células germinales que entran en los espermatozoides unidos a la anexi- DNA (especialmente cuando se trata la meiosis I. Estas células earmarked na V conjugada con las micropartícu- de daño de DNA de cadena doble) en con marcadores apoptóticos tipo Fas las magnéticas serían retenidos en la blastómeras de embriones obtenidas deberían ser fagocitadas y eliminadas columna, mientras que los no-apoptó- para Diagnóstico Genético por la célula de Sertoli a la cual se ticos pasarían a través de la misma Preimplantacional (DGP), podría apli- encuentran asociadas (Billig et al., (Grunewald et al., 2001). Otro méto- carse al estudio de la integridad de la 1996; Pentikainen et al., 1999; do, quizás más específico, sería la cromatina embrionaria. El uso combi- Sakkas et al., 1999). Sin embargo, selección de espermatozoides apoptó- nado de PCR , de sondas cromosómi- esto no siempre va a ocurrir y un por- ticos por técnicas de inmunoadsorción cas y de tests de fragmentación de centaje variable de estas células ger- fase sólida mediante el uso de anti- DNA nos permitiría estudiar de forma minales entran en el proceso de remo- cuerpos anti-Fas adheridos a placas simultánea la presencia de enferme- delado celular de la espermiogénesis de Petri. dades monogénicas, aneuploidías y el (que es el que determina la morfología grado de fragmentación de DNA en el espermática) apareciendo posterior- 2. Roturas de DNA durante el proce- embrión permitiéndonos así seleccio- mente en el eyaculado. Con relación a so de espermiogénesis. Alteraciones nar los embriones de mejor calidad este proceso de screening fallido, los en el proceso de remodelado de la cro- genómica. resultados de un estudio reciente matina espermática durante la esper- sugieren que existe una disociación miogénesis podrían resultar en frag- Mecanismos de fragmentación de DNA entre la calidad genómica de la célula mentación de DNA. McPherson y en espermatozoides germinal y el remodelado espermático Longo han postulado que la presencia que tiene lugar durante la espermiogé- de roturas en el DNA podría ser indi- ¿Cómo se produce la fragmentación nesis (Burrello et al., 2004). Es decir, cativa de maduración incompleta de DNA en los espermatozoides? El una célula germinal puede tener el durante la espermiogénesis. Para que daño de DNA en los espermatozoides núcleo “pulverizado” por apoptosis o se produzca el empaquetamiento de la puede afectar tanto el DNA mitocon- ser aneuploide y sin embargo el esper- cromatina del espermatozoide, es drial como el nuclear y puede ser matozoide resultante tener una morfo- necesaria la actividad de nucleasas inducido por cinco mecanismos prin- logía normal. De ahí que cuando se endógenas que corten y liguen el DNA cipales: (i) apoptosis durante el proce- microinyecte un espermatozoide de durante su protaminación. Estos cor- so de espermatogénesis, (ii) roturas de morfología normal, esto no nos garan- tes proporcionarían una liberación de DNA o nicks producidos durante el tiza que el genoma sea normal. Lo que estrés torsional ayudando así al empa-
  3. 3. A R T Í C U L O S Juan G. Álvarez et al. Nuevos avances en el estudio de.... 16 quetamiento de la cromatina durante segundo caso este tratamiento carece- espermatozoides eyaculados la tasa el desplazamiento de las histonas por ría de eficacia. Esto viene avalado por de embarazo evolutivo fue del 0% las protaminas (McPherson and los resultados recientemente publica- (Greco et al, 2005). Longo, 1992, 1993a, 1993b). dos por Greco et al., donde el uso de Cabe destacar que la fragmentación Alteraciones en el control de este pro- antioxidantes produjo una reducción de DNA inducida por el radical hidro- ceso podrían resultar en roturas de significativa en los niveles de frag- xilo resulta en la formación de 8-OH- DNA no reparadas. Estas alteraciones mentación de DNA (Greco et al., guanina y 8-OH-2´-deoxiguanosina en se producirían antes de la espermia- 2005). un primer estadio seguido de fragmen- ción. tación de DNA de cadena doble (Cui Probablemente, los espermatozoi- et al., 2000). Mientras que el daño de 3. Fragmentación de DNA a nivel des que expresen un mayor daño de DNA del primer tipo pudiera ser repa- post-testicular. Estudios recientes DNA sean aquellos que adquieran un rado por el ovocito, la fecundación de demuestran que espermatozoides menor grado de crosslinking de puen- un ovocito por un espermatozoide con inmaduros que producen niveles ele- tes disulfuro en la cromatina espermá- fragmentación de DNA de cadena vados de ROS pueden inducir daño de tica durante su maduración en el epi- doble es prácticamente irreversible e DNA en espermatozoides maduros. dídimo. En este sentido, estudios incompatible con el desarrollo de un Este daño se produciría después de la recientes han demostrado que, en embarazo a término. Dado que valores espermiación durante la co-migración general, el grado de fragmentación de de fragmentación de DNA en esper- de espermatozoides maduros e inma- DNA en espermatozoides eyaculados matozoides eyaculados >20%, medi- duros desde los túbulos seminíferos al es más alto que en espermatozoides dos por TUNEL (Sergerie et al., epidídimo (Ollero et al., 2001). Dado testiculares (Greco et al., 2005; 2005), o >30%, medidos por el test que los espermatozoides se encuen- Steele et al., 1999) y que en esper- SCSA (Evenson et al., 1999), están tran en íntimo contacto en el epidídi- matozoides del cuerpo y cabeza del asociados a tasas de embarazo <5%, mo, y que la vida media de los ROS es epidídimo (que es donde se completa la pregunta que surge es que ocurre del orden de nano a microsegundos, el proceso de crosslinking) y que la con el 80% y 70% restante de los esto facilitaría el que los ROS induz- inducción de fragmentación de DNA espermatozoides. En estos casos, la can fragmentación de DNA a nivel del en los espermatozoides a su paso por probabilidad de que un espermatozoi- epidídimo, ya sea actuando directa- el epidídimo podría estar relacionada de con un DNA normal fecunde al ovo- mente sobre el DNA o bien indirecta- con la calidad genómica del esperma- cito debería de ser del 80% y 70%, mente mediante la activación de tozoide. Es decir, además del meca- respectivamente y no <5%. Sin endonucleasas y caspasas espermáti- nismo de screening de la célula de embargo, además de que un 20% y cas. Esto es consistente con el hecho Sertoli, al que hacíamos referencia 30% de los espermatozoides tengan de que la co-centrifugación de esper- antes, existiría otro mecanismo de roturas en la cadena de DNA, el resto matozoides inmaduros (que producen screening a nivel del epidídimo dirigi- de los espermatozoides podrían tener niveles elevados de ROS) con esper- do a eliminar espermatozoides genó- modificaciones en las bases de DNA matozoides maduros resulta en la micamente defectuosos (Suganuma et del tipo de 8-OH-guanina y 8-OH-2´- inducción de fragmentación de DNA al., 2005). deoxiguanosina. Por lo tanto, la proba- en estos últimos, ya que en estas con- bilidad de que un espermatozoide con diciones estos espermatozoides tam- El daño potencial de DNA que los DNA normal fecunde al ovocito sería bién se encontrarían en íntimo contac- espermatozoides pueden experimentar mucho más baja que la esperada con to (Twigg et al., 1998). Esto también a su paso por el epidídimo tiene una un valor de fragmentación de DNA del es consistente con el hecho de que la gran trascendencia clínica, ya que en 20% o 30%, respectivamente. Es exposición in vitro de espermatozoides casos de niveles elevados de fragmen- decir, además de la fragmentación de maduros a ROS resulta en daño signi- tación de DNA en semen y fallo en dos DNA determinada del 20% y 30% ficativo de DNA (Aitken et al., 1998; o más ciclos de FIV/ICSI, podría recu- (daño primario), el 80% y 70% res- Lopes et al., 1998). Por otra parte, el rrirse a la microinyección de esperma- tante de los espermatozoides tendrían mismo epidídimo podría también tozoides testiculares obtenidos otro tipo de daño (daño secundario) jugar un papel activo a la hora de mediante técnica de TESA o TESE que no miden los tests habituales de inducir fragmentación de DNA en los (preferiblemente TESA, dado que es fragmentación de DNA y que, de no espermatozoides a su paso por el menos invasiva y gozaría de una mayor ser reparado, no es compatible con el mismo, ya sea producido por radicales aceptación por parte del paciente y desarrollo de un embarazo a término. libres como el anión superóxido del ginecólogo). Esto viene avalado Este concepto ha sido designado (Britan et al., 2006), el radical hidro- por los resultados obtenidos en un como el “efecto iceberg” (Evenson et xilo o el óxido nítrico, o bien median- estudio publicado por Greco et al., al., 1999). te la activación de caspasas y endonu- donde la microinyección de esperma- cleasas espermáticas por agentes tóxi- tozoides testiculares en pacientes con 4. Activación de caspasas y endonu- cos o por factores epididimarios. En el un nivel de fragmentación de DNA en cleasas espermáticas. La activación primer caso, este tipo de daño podría semen >15%, medido por el test de caspasas y endonucleasas en prevenirse mediante el uso de agentes TUNEL, resultó en una tasa de emba- espermatozoides diferenciados por antioxidantes, mientras que en el razo del 44,4%, mientras que con factores físico-químicos puede inducir
  4. 4. A R T Í C U L O S Junio 2006 Vol. 11 • Nº1 17 también fragmentación del DNA potenciales en la cadena de DNA. De bién resulta en fragmentación de DNA espermático. Estudios previos indican hecho, cuando se observa daño de de cadena doble que puede ser detec- que la exposición de espermatozoides DNA en condiciones de pH ácido o tada por el test TUNEL (Negoescu et de ratón in vitro a 40oC resulta en un alcalino y no en condiciones de pH al., 1998). aumento significativo en el grado de neutro se habla de puntos lábiles de fragmentación del DNA (Sailer et al., rotura al tratamiento ácido o alcalino. El test que más se ha estudiado 1997). Más recientemente, Banks et Por el contrario, el test TUNEL hasta ahora desde el punto de vista al., han demostrado la inducción de (Gorczyca et al., 1993), ISNT clínico es el test SCSA desarrollado fragmentación de DNA en espermato- (Gorczyca et al., 1993) y el COMET a por Evenson et al. (Evenson et al., zoides de ratón in vivo tras haber sido pH neutro (Singh et al., 1988), no 1980; 1983; 1985; 1991; 1994; expuestos los testículos a una tempe- requieren un paso previo de desnatu- 1999a; 1999b). El test SCSA mide la ratura de 42oC (Banks et al., 2005). ralización y miden roturas auténticas susceptibilidad del DNA de los esper- Dado que la fragmentación de DNA se de DNA de cadena sencilla (ISNT, matozoides a la desnaturalización in encontró en espermatozoides aislados TUNEL y COMET) y cadena doble situ tras la exposición a un pH ácido. del epidídimo una hora después del (TUNEL y COMET). Dado que el pH El DNA de espermatozoides con una estímulo, los autores concluyeron que intracelular en el ovocito es de 7.0, cromatina normal no se desnaturaliza, el daño observado tendría que haber- roturas de DNA de cadena sencilla o mientras que si el DNA de los esper- se producido en los espermatozoides a la presencia de puntos lábiles de rotu- matozoides está dañado y contiene su paso por epidídimo y que podría ser ra en el DNA no tendrían mayores con- roturas en sus cadenas, se pueden causado por radicales libres o por acti- secuencias en la formación del pronú- alcanzar diferentes grados de desna- vación de caspasas y endonucleasas cleo masculino, ya que a pH neutro turalización. Para determinar el grado espermáticas. las cadenas de DNA no se disocian y, de desnaturalización del DNA esper- por lo tanto, este tipo de daño sería mático, tras el tratamiento ácido, se 5. Fragmentacion de DNA inducida mucho más fácil de reparar. Por lo tiñen las células con naranja de acri- por radio y quimioterapia Tests de tanto, como una primera aproxima- dina (AO). Dado que el AO es un fluo- fragmentación de DNA ción, podrían considerarse dos tipos rocromo metacromático, éste emite en de tests: (i) tests que miden “daño verde cuando se intercala en cadenas Recientemente se han introducido real” de DNA tales como TUNEL, de DNA dobles (DNA intacto), y en una serie de tests para la determina- ISNT o COMET a pH neutro, y (ii) rojo si son de cadena sencilla (es ción de daño de DNA en los esperma- tests que miden “daño potencial” de decir, DNA fragmentado). El grado de tozoides. Estos tests incluyen TUNEL DNA o puntos lábiles de rotura al tra- daño de DNA, es decir la intensidad (TdT-mediated-dUTP Nick-End tamiento ácido o alcalino y susceptibi- de la fluorescencia verde y/o roja en Labelling, Gorczyca et al., 1993), lidad a la desnaturalización de DNA, los espermatozoides se mide de forma COMET (Hughes et al., 1996), CMA3 tales como el SCSA, SCD, cuantitativa por citometría de flujo y (Manicardi et al., 1995), ISNT (in-situ Chromomycin A3 y COMET a pH ácido se expresa como DFI (DNA nick translation, Tomlinson et al., o alcalino (Singh et al., 1989). Tests Fragmentation Index). Estudios pre- 2001), DBD-FISH (DNA Breakage que miden daño real de DNA deberían vios indican que valores de DFI >27% Detection Fluorescence In Situ tener un mayor valor predictivo que están asociados con fallo de embarazo Hybridization o detección de roturas tests que miden daño potencial de en TRA (Larson et al., 2000; Larson- en el DNA por hibridación in situ, DNA. Esto está avalado por el estudio Cook et al., 2003). Sin embargo estu- Fernández et al., 1998, 2000), SCD publicado por Greco et al., en el que dios recientes ponen en tela de juicio (Sperm Chromatin Dispersion Test, se demuestra que la microinyección el valor predictivo del test SCSA, ya Fernández et al., 2003) y el SCSA de espermatozoides eyaculados con que se han reportado casos de emba- (Sperm Chromatin Structure Assay, valores de TUNEL >15% resultaron en razo en técnicas de reproducción asis- Evenson et al., 1980; 1983; 1985; una tasa de embarazo evolutivo por tida con valores de DFI >27% 1991; 1994; 1999a; 1999b). ciclo del 0% mientras que la microin- (Gandini et al., 2004; Bungum et al., yección de espermatozoides testicula- 2004). Un aspecto importante en la deter- res con valores <6% en un segundo minación la fragmentación de DNA es ciclo de ICSI en estos mismos pacien- Quizás en la mayoría de los casos el el relacionado con el tipo de roturas tes resultó en una tasa de embarazo daño de cadena sencilla detectado en que se produce en las cadenas de por ciclo del 44.4% (Greco et al., el DNA espermático por tests como el DNA (cadena sencilla versus cadena 2005). test SCSA no sea incompatible con doble) y la susceptibilidad a la frag- una descondensación normal de la mentación de DNA. Tests de fragmen- Es importante resaltar que si bien el cromatina durante el proceso de tación de DNA como el SCSA, SCD test TUNEL con frecuencia se utiliza fecundación del ovocito y la formación (Fernández et al., 2003), o COMET a para determinar apoptosis en células, del pronúcleo masculino. En este sen- pH ácido o alcalino (Singh et al., la positividad de TUNEL no es siem- tido, el recién desarrollado test SCD 1988; 1989) requieren un paso ini- pre sinónima de apoptosis, ya que el nos puede ayudar a comprender mejor cial de desnaturalización para detec- daño de DNA inducido por el radical este proceso. El test SCD está basado tar los fragmentos de DNA o roturas hidroxilo y la radiación ionizante tam- en el hecho de que en espermatozoi-
  5. 5. A R T Í C U L O S Juan G. Álvarez et al. Nuevos avances en el estudio de.... 18 des con las cadenas de DNA intactas Dado que más del 90% del genoma las implicaciones del daño de DNA en se produce un desenrollamiento de los humano está compuesto por intrones el diagnóstico y tratamiento de la bucles de DNA, empaquetados en la con secuencias repetitivas que no infertilidad? La fecundación de ovoci- matriz nuclear, tras haber sido codifican por proteínas celulares, lo tos en metafase II por espermatozoi- expuestos a un tratamiento ácido más probable es que de existir daño des con daño de DNA podría conducir seguido de un tratamiento con agen- en las cadenas de DNA, éste no afec- a alteraciones en el desarrollo del tes reductores y detergentes. Esto te a hot spots o secuencias que codi- embrión, fallo en la implantación, o a desenrollamiento produce un halo fican proteínas (exones) que pudieran un aumento en la tasa de aborto alrededor de la matriz nuclear que se comprometer el desarrollo normal del (Genesca et al., 1992; Parinaud, puede visualizar por microscopía de embrión. Sobre este tema volveremos 1993; Twigg et al., 1998; Evenson, campo claro usando tinciones habi- a hablar más adelante en la sección 1999b: Carrell et al., 2003). Ovocitos tuales como el Diff-Quik. Por el con- de preguntas y respuestas. maduros con los mecanismos de repa- trario, si una de las cadenas de DNA ración de DNA intactos tienen la capa- está dañada, no se produce el halo, Dadas las limitaciones de tests cidad de reparar un daño moderado de observándose núcleos condensados. como el SCSA y SCD, que miden sus- DNA en los espermatozoides (Brandiff Sin embargo, si los espermatozoides ceptibilidad del DNA a la desnaturali- and Pedersen, 1981; Matsuda and no se exponen a este tratamiento zación in vitro, en la predicción de Tobari, 1988). Sin embargo, ovocitos ácido previo, se produce el desenrolla- tasas de fecundación y embarazo en inmaduros u ovocitos cuyos mecanis- miento de los bucles de DNA, inde- técnicas de reproducción asistida, en mos de reparación no funcionen de pendientemente de que el DNA esté la actualidad se recomienda el uso de forma adecuada (p.e., mujeres de fragmentado o no. Dado que, como ya tests como TUNEL o in-situ nick edad avanzada) o que hayan sido indicamos antes, el pH intracelular translation que miden “daño real” de dañados por factores tóxicos endóge- del ovocito es del orden de 7.0, un DNA. La presencia de daño de cadena nos (p.e., radicales libres) o exógenos espermatozoide con DNA fragmentado doble en el espermatozoide podría (p.e., radiación, tóxicos ambientales) que haya fertilizado el ovocito, podría interferir de forma significativa con la no serían capaces de reparar este desenrollar sus bucles de DNA permi- descondensación de la cromatina daño. Esto es consistente con la tiendo que se produzca la desconden- espermática. Esto es consistente con observación de que la inseminación sación de la cromatina y la formación los resultados de estudios que de ovocitos de mujeres de edad avan- del pronúcleo masculino. Sin embar- demuestran la existencia de bajas zada -que previamente habían sido go, todavía cabría preguntarse ¿qué tasas de fecundación asociadas a inseminados in vitro en varios ciclos ocurre con ese pronúcleo masculino niveles de fragmentación de DNA con espermatozoides de baja calidad en el cual existen cadenas de DNA >10% medidos por el test TUNEL de su cónyuge y cuya transferencia potencialmente dañadas? ¿va a afec- (Lopes et al., 1998; Benchaib et al., resultó en fallo repetido de embarazo- tar el desarrollo posterior del embrión? 2003). Sin embargo, como cabría con espermatozoides de donante, fre- Obviamente, la respuesta a esta pre- esperar, el test SCSA no se correlacio- cuentemente resulta en un aumento gunta va a depender de varios factores na con las tasas de fecundación in significativo en la calidad embrionaria entre los que cabe destacar el número vitro (Larson et al., 2000; Larson- y en la tasa de embarazo (Genescá et de ovocitos obtenidos, la capacidad Cook et al., 2003). al., 1992; Obasaju et al., 1999). Por del ovocito de reparar este daño, si consiguiente, los tests de fragmenta- existe daño real o daño potencial y de Aplicaciones al diagnóstico y trata- ción de DNA podrían potencialmente si están afectados intrones o exones. miento de la infertilidad¿Cuáles son utilizarse en el diagnóstico de fallo Tabla I. Valores del análisis de semen y fragmentación de DNA en muestras obtenidas en un período de tres meses y resultados clínicos obtenidos con tres de estas muestras. ANÁLISIS DE SEMEN & FRAGMENTACIÓN DE DNA FECHA DE IAC/ICSI FECHA MUESTRA CONCENTRACIÓN* % MOT MORFOLOGÍA† % DFI TRA EMBARAZO ‡§ 18/4/01 10/12/00 56,0 45,0 8 18.5 ICSI Gemelar 18/3/01 10/03/01¶ 53,0 49,0 9 36.9 ICSI NO 26/2/01 26/02/01¶ 58,7 61,6 9 32.6 IAC NO ‡ - 14/01/01 59,4 65,5 8 18.8 - - ‡ - 04/02/01 55,6 59,1 7 30.6 - - *millones/ml †% formas normales por criterios estrictos de Kruger (normal >4%) (Mortimer and Menkveld, 2001). ‡muestras recogidas entre ciclos de TRA. Alícuotas de 0,2 ml fueron congeladas directamente en nitrógeno líquido para análisis por el test SCSA y alícuotas de 0,5 ml fueron criopreservadas en TEST-yolk buffer. §muestra criopreservada el 10/12/00 y usada en el último ciclo de TRA el 18/4/01. ¶muestras recogidas el dia del ciclo de TRA. Alícuotas de 0,2 ml fueron congeladas en nitrógeno líquido para análisis por el test SCSA TRA: técnica de reproducción asistida
  6. 6. A R T Í C U L O S Junio 2006 Vol. 11 • Nº1 19 repetido de embarazo y abortos de límites de la normalidad. Es decir, la antes de hacer una vasectomía repetición en TRA. causa de infertilidad de esta pareja 7. Cuando se va a congelar semen pre- pasaría de ser idiopática a ser de fac- vio a tratamientos de quimio/radioterapia Sin embargo, no todas las muestras tor masculino. de semen que se obtengan de un 2. ¿Si una muestra de semen de un paciente van a tener el mismo nivel de Otro aspecto importante de las paciente tiene un valor de fragmenta- fragmentación de DNA. En un trabajo implicaciones clínicas del estudio de ción elevado, es ésta una condición reciente, se ha encontrado que existe la integridad del DNA espermático permanente o pudiera ser que otras gran variabilidad en el grado de frag- está relacionado con el grado de frag- muestras tuviesen valores más bajos? mentación de DNA en muestras de mentación de DNA que se encuentra semen obtenidas de un mismo pacien- en espermatozoides testiculares vs. Si bien en donantes fértiles los valo- te en diferentes ciclos espermatogéni- espermatozoides del epidídimo en oli- res de fragmentación suelen ser relati- cos (Álvarez et al., 2004). Los resulta- gospermias y azoospermias obstructi- vamente bajos y la variación en el dos que se muestran en la Tabla I vas (Steele et al., 2003). En este grado de fragmentación de DNA en corresponden a muestras de semen estudio, Steele et al., demostraron muestras de semen obtenidas en dife- obtenidas de un mismo paciente en que el grado de fragmentación de rentes ciclos espermatogénicos es un período de tres meses. En esta DNA en espermatozoides testiculares también baja (Evenson et al., 1991), pareja, alícuotas de las muestras de de pacientes con procesos obstructi- en pacientes de infertilidad, el grado semen utilizadas en sus ciclos de vos es significativamente inferior al de de fragmentación puede mostrar fluc- reproducción asistida, fueron congela- espermatozoides del epidídimo obte- tuaciones significativas (Álvarez et al., das con TEST-yolk buffer/glicerol y alí- nidos de esos mismos pacientes. 2004). Estas fluctuaciones pudieran cuotas de 0,2 ml de estas mismas Estudios previos sugieren que factores estar relacionadas con alteraciones en muestras, así como de otras tres tóxicos medioambientales, radicales el control de la espermiogénesis (p.e., muestras que se obtuvieron antes de libres producidos por espermatozoides varicocele, proceso inflamatorio sub- empezar sus ciclos de reproducción inmaduros, o bien derivados de un clínico, proceso febril) o con factores asistida, fueron congeladas directa- varicocele testicular o producidos por desencadenantes físico-químicos que mente en nitrógeno líquido y enviadas el propio epidídimo (p.e., óxido nítrico induzcan apoptosis o activen endonu- a un laboratorio de referencia para el producido por iNOS epididimaria), y/o cleasas espermáticas (p.e., proceso análisis de fragmentación de DNA por la presencia de factores proinflamato- febril, tóxicos medioambientales) que el test SCSA. Como muestran los rios, p.e., IL-6, IL-8) podrían resultar podrían inducir fragmentación del resultados, de las cinco muestras que en la inducción de fragmentación de DNA en los espermatozoides después se analizaron, tres tuvieron valores de DNA. Por lo tanto, en lugar de obtener de la espermiación (Evenson et al., DFI >27% (las tres que resultaron en espermatozoides de los túbulos epidi- 2000). Una vez que haya cesado el fallo de embarazo) y dos <27% (una dimarios en casos de procesos obs- estímulo desencadenante, el grado de de ellas resultó en un embarazo geme- tructivos, donde se pueden acumular fragmentación de DNA se normalizaría lar). Dado que en esta pareja no se estos factores y también se puede pro- en el ciclo espermatogénico siguiente. produjo embarazo tras dos ciclos de ducir una obstrucción iatrogénica, se Por ello, en aquellos casos en los que TRA, se decidió utilizar una de las recomienda obtener espermatozoides la muestra de semen analizada tenga muestras que había sido previamente testiculares, ya sea por la técnica de un valor por encima del umbral de criopreservada con TEST-yolk TESA o TESE. normalidad del test utilizado, deberí- buffer/glicerol y que tenía un valor de an recogerse varias muestras de DFI por debajo de 27%. El uso de esta Preguntas frecuentes sobre tests de semen, analizar el grado de fragmen- muestra en un ciclo posterior de ICSI fragmentación de DNA tación de DNA, criopreservarlas, y uti- resultó en un embarazo gemelar a tér- lizar únicamente aquellas muestras mino. 1. ¿A qué pacientes se les debería con valores de fragmentación dentro hacer el test? de la normalidad. Esto sería particu- Si bien estos resultados son todavía larmente útil en aquellos casos en los muy preliminares y habría que confir- El análisis de fragmentación del que las muestras de semen se vayan a marlos en un mayor número de casos, DNA espermático estaría indicado congelar, p.e., pacientes que van a ser sugieren que los tests de fragmenta- solicitarlo en los siguientes casos: sometidos a quimio o radioterapia. ción de DNA espermático podrían uti- lizarse no sólo para el diagnóstico sino 1. Fallo repetido de FIV 3. ¿Qué factores pueden causar también para el tratamiento de la 2. Abortos de repetición (Carrell et al., fragmentación de DNA? infertilidad. Es importante destacar 2003) que a pesar de que la fragmentación 3. Edad del varón >40 años (Singh et al., Una gran variedad de factores han de DNA varió de forma significativa en 2003) sido asociados con la inducción de los dos ciclos espermatogénicos estu- 4. Varicocele (Smith et al., 2006) daño de DNA en los espermatozoides. diados, los parámetros estándar de 5. Episodio de fiebre alta en los últi- Estos factores incluyen procesos infla- semen no mostraron una variación sig- mos tres meses (Evenson et al., 2000) matorios agudos y crónicos, el estrés nificativa y estuvieron dentro de los 6. Cuando se va a congelar semen oxidativo, varicocele, fiebre alta, expo-
  7. 7. A R T Í C U L O S Juan G. Álvarez et al. Nuevos avances en el estudio de.... 20 sición del testículo a temperaturas El valor predictivo de un test de dos y de su capacidad de reparar daño >36oC (Banks et al., 2005), tóxicos fragmentación de DNA va a depender de DNA en el espermatozoide. Si se medioambientales, quimioterapia, de varios factores. Estos factores dispone de seis ovocitos en metafase radiación ionizante, edad >40 años, incluyen: II (Fig. 1), la probabilidad de que se consumo excesivo de cafeína (= o > 1. Fragmentación de DNA de cadena produzca un embarazo va a ser mayor tres tazas de café al día) (Schmid et sencilla vs. cadena doble. En general que si se dispone de tan sólo tres ovo- al., Hum Reprod 2006, in press). el daño de cadena sencilla es más citos (Fig. 2). En este último caso, la fácil de reparar por ovocito que el de probabilidad de que un espermatozoi- 4. ¿Si el valor del test es normal, cadena doble. de con el DNA intacto fecunde un garantiza esto un alto nivel de fertili- 2. Porcentaje de espermatozoides que óvulo normal o de que un espermato- dad? están afectados. Cuanto más alto sea zoide con DNA fragmentado fecunde el porcentaje de espermatozoides con un óvulo con una alta capacidad repa- No necesariamente. La calidad del DNA fragmentado menor la probabili- radora va a ser mucho menor que en DNA pudiera ser óptima y sin embar- dad de que un espermatozoide con el primer caso. Si bien en el primer go otros parámetros espermáticos u DNA intacto pueda fecundar al ovoci- caso, como se indica en la Fig. 1, ovocitarios podrían estar también to. podrían producirse dos embriones afectados. Como se ha indicado ante- 3. Grado de fragmentación de DNA grado I, que podrían dar lugar a un riormente, los tests de fragmentación por espermatozoide. Cuanto mayor sea embarazo, ello no quiere decir de que pueden tener un alto valor predictivo el grado de fragmentación del DNA la fragmentación de DNA no esté aso- negativo pero no positivo. Las tasas de nuclear del espermatozoide, menor la ciada a un mal pronóstico en TRA, ya fecundación e implantación, además probabilidad de que el ovocito lo que de haber menos ovocitos como en de depender de la calidad genómica pueda reparar. el caso ilustrado en la Fig. 2, podría del espermatozoide que haya fecunda- 4. Si existe únicamente daño primario no producirse ningún embrión viable do al ovocito, van a depender también o si existe daño combinado primario y y, por lo tanto, no se produciría un de otros parámetros como son la cali- secundario. Por ejemplo, en casos de embarazo. Por lo tanto, el número de dad citoplasmática y genómica del apoptosis durante la espermatogéne- ovocitos disponibles es un factor ovocito y la receptividad del endome- sis o roturas de DNA producidas importante que va a influir en el valor trio. durante la espermiogénesis, general- predictivo de tests de fragmentación mente este tipo de daño no suele estar de DNA. Esto mismo se aplicaría a 5. ¿Qué se hace cuando los valores asociado a daño secundario. Por el ciclos de coito dirigido e IAC, donde el de fragmentación de DNA obtenidos contrario, en casos de daño post-testi- número de ovocitos que se obtienen en varias muestras de semen son con- cular inducido por el radical hidroxilo habitualmente es de uno y dos, res- sistentemente altos? ¿tendría que o en casos de exposición a radiación pectivamente. Aquí las tasas de recurrirse a semen de donante? ionizante, el daño primario (que suele embarazo serían más bajas cuando el ser de cadena doble) casi siempre grado de fragmentación es relativa- No. Muestras de semen con un valor está asociado a daño secundario. mente alto, ya que habitualmente se de fragmentación por encima del 5. Si el daño afecta intrones o exones. desarrollan de uno a dos folículos. Por umbral de normalidad pueden produ- Más del 90% del DNA está formado lo tanto, uno esperaría que el valor cir embarazos a término, independien- por intrones. Por lo tanto, la probabili- predictivo negativo de tests de frag- temente de la edad de la mujer. Esto dad de que el daño de DNA afecte a mentación, especialmente aquellos es particularmente cierto cuando se exones, que son las secuencias del que miden daño real como el test utilizan tests con una valor predictivo DNA que codifican proteínas, es rela- TUNEL, sea más alto en ciclos de IAC. bajo. Estudios recientes muestran que tivamente baja. Esto ha sido confirmado en un estudio muestras de semen con valores de 6. Capacidad del ovocito de reparar donde se encontró una correlación sig- fragmentación relativamente altos daño de DNA en el espermatozoide nificativa entre el grado de fragmenta- medidos por el test SCSA (Gandini et que lo ha fecundado. Esta capacidad ción de DNA en semen medido por el al., 2004; Bungum et al., 2004) o puede variar de un ovocito a otro en test TUNEL y las tasas de embarazo por el test SCD (Muriel et al., 2006) cohortes de ovocitos obtenidos en en ciclos de IAC (Duran et al., 2002). pueden resultar en embarazos viables ciclos de in vitro. Desdichadamente, a término. De ahí que se recomiende la capacidad de reparación del ovoci- Para concluir, podríamos decir que el uso de tests de fragmentación que to no se puede determinar in vitro, ya el valor predictivo de un test de frag- miden daño real, como el test TUNEL, que esto afectaría su viabilidad. mentación, IItest, es el sumatorio de en combinación con tests que miden 7. Número de ovocitos. En ciclos de in daño secundario de DNA como la pre- vitro en parejas donde el nivel de frag- varios factores: IItest = II(1) + II(2) + sencia de 8-OH-2´-deoxiguanosina. mentación de DNA en semen, medido II(3).......+II(n). Algunos de estos facto- por TUNEL, es relativamente alto, la res pueden medirse y otros no como, 6. ¿Por qué muestras de semen con probabilidad de que se produzcan por ejemplo, si el daño afecta a intro- valores de fragmentación relativamen- embriones viables y un embarazo a nes o exones o la capacidad reparado- te altos pueden dar lugar a un emba- término va a depender, al menos en ra del ovocito. razo a término? parte, del número de ovocitos obteni-
  8. 8. A R T Í C U L O S Junio 2006 Vol. 11 • Nº1 21 FIGURA 1: Resultado hipotético de un caso de ICSI donde seis ovocitos fueron microinyec- tados con espermatozoides provenien- tes de un semen con un nivel de frag- mentación de DNA del 40% medido por TUNEL. La calidad de reparación de los ovocitos se indica mediante el símbolo +. Cuanto mayor sea la capacidad de reparación del ovocito mayor el número de símbolos + y viceversa. Cuanto mayor sea el grado de fragmentación de DNA en el espermatozoide mayor la intensidad de fluorescencia. De los seis embriones obtenidos, dos fueron de buena calidad (2 x G1) y cuatro de cali- dad deficiente (G2, G4, G4). La trans- ferencia de los dos embriones Grado I resultó en un embarazo. La calidad de los embriones se representa en día 3 por razones puramente didácticas ya que, en general, el efecto de la fecun- FIGURA 2: dación de ovocitos por espermatozoides Resultado hipotético de un caso de ICSI donde tres ovocitos fueron microinyec- con DNA fragmentado sobre la calidad tados con espermatozoides provenientes de un semen con un nivel de fragmen- embrionaria pudiera expresarse en esta- tación de DNA también del 40% medido por TUNEL. Todos los embriones obte- díos más tardíos (late paternal effects) nidos fueron de mala calidad (G2, G4, G4). Se transfirieron los tres embriones (Tesarik et al., 2004). y no se produjo embarazo. Evenson DP. Selecting cryopreserved plained recurrent pregnancy loss. Arch 7. ¿Qué test de fragmentación de semen for assisted reproductive tech- Androl 2003; 49:49-55. niques based on the level of sperm Duran EH, Morshedi M, Taylor S, DNA es el más recomendable? nuclear DNA fragmentation resulted Oehninger S. 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