A R T Í C U L O                                    I

14

     EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA
   ...
A R T Í C U L O                                   I
                                                                      ...
A R T Í C U L O                                  I
     Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la...
A R T Í C U L O                                   I
                                                                      ...
Próxima SlideShare
Cargando en…5
×

EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA EN OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II

1.244 visualizaciones

Publicado el

Publicado en: Salud y medicina
0 comentarios
0 recomendaciones
Estadísticas
Notas
  • Sé el primero en comentar

  • Sé el primero en recomendar esto

Sin descargas
Visualizaciones
Visualizaciones totales
1.244
En SlideShare
0
De insertados
0
Número de insertados
4
Acciones
Compartido
0
Descargas
27
Comentarios
0
Recomendaciones
0
Insertados 0
No insertados

No hay notas en la diapositiva.

EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA EN OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II

  1. 1. A R T Í C U L O I 14 EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA EN OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II EFFECT OF VITRIFICATION PROCEDURE ON SPINDLE AND CHROMOSOME CONFIGURATION IN METAPHASE II HUMAN OOCYTES Cristina Costana Duque*1, Javier Alfonso2, Rita Cervera3, Ana Monzó1,2, Vicente Montañana 1,2, Miodrag Stojkovic3, Alberto Romeu 1,2 1 Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER), Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia. *Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. Av/ Campanar 21, 46009, Valencia. e-mail: cristinacostana@hotmail.com Fecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 3 mayo 2010 RESUMEN El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la técnica de vitrificación utilizando el método del Cryotip™ sobre la integridad del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. La configuración del huso meiótico y de la placa metafásica de los ovocitos frescos (control) y vitrificados se evaluó mediante microscopía confocal. La tasa de supervivencia para los ovocitos desvitrificados fue del 91,6%. La proporción de ovocitos que mostró una configuración normal del huso meiótico y de la placa metafásica fue similar en ovocitos frescos y vitrificados, sugiriendo que la técnica de vitrificación con el Cryotip™ permite mantener el potencial de los ovocitos una vez desvitrificados. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):14-17. Palabras clave: ovocitos metafase II, vitrificación, huso meiótico, organización cromosómica. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification procedure using the Cryotip™ method on spindle and chromosome configurations in metaphase II human oocytes. The meiotic spindle and chromosome configurations in fresh (control) and vitrified oocytes were studied by confocal microscopy. Survival rate for vitrified oocytes was 91.6%. The proportion of oocytes showing normal spindle and chromosome configuration was similar for fresh and vitrified oocytes showing that vitrification with the Cryotip™ method supports oocyte potential after warming. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):14-17. Keywords: metaphase II oocytes, vitrification, meiotic spindle, chromosome configuration INTRODUCCIÓN la sincronización donante-receptora en Los microtúbulos, que conforman el ciclos de donación de ovocitos o, huso meiótico, y los microfilamentos, La criopreservación de ovocitos permite simplemente, en mujeres fértiles que localizados en el córtex ovocitario, son preservar la fertilidad en pacientes que deseen posponer la maternidad. muy susceptibles a la temperatura de por diversas etiologías pueden enfriamiento (chilling) y a la exposición desarrollar un Fallo Ovárico Prematuro La criopreservación ovocitaria utilizando a los crioprotectores (Boiso et al., (FOP). Es el caso de exposición a agentes la técnica de congelación convencional se 2002). Una alteración en estas quimio/radioterápicos, enfermedades considera un procedimiento estructuras podría conducir a una autoinmunes o hematológicas, o experimental, debido a las bajas tasas de alineación cromosómica incorrecta procesos quirúrgicos potencialmente supervivencia y gestación y al limitado previa a la extrusión del corpúsculo esterilizantes. La criopreservación número de recién nacidos logrado (ASRM, polar, a una segregación cromosómica ovocitaria puede emplearse también 2006). Los protocolos de alterada, fecundación anómala y/o a una para evitar la criopreservación de congelación/descongelación elevada incidencia de aneuploidías. embriones, para rescatar ciclos convencionales conllevan una reducción complicados con un síndrome de lenta de la temperatura en el tiempo, La vitrificación combina tasas de hiperestimulación ovárica o con resultando en el daño de estructuras enfriamiento del orden de -15.000º C a - ausencia de muestra seminal el día de la vitales de los ovocitos. 30.000º C por minuto (Liebermann et al., punción-aspiración folicular, para evitar 2003) y concentraciones elevadas de
  2. 2. A R T Í C U L O I Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 15 crioprotectores, aumentando de tal hiperestimulación ovárica controlada compuestas por medio 199 con manera su viscosidad que no cristaliza que incluyó, como frenado hipofisario, concentraciones decrecientes de sino que forma un estado amorfo similar agonistas de la GnRH en protocolo largo sacarosa (1.0M y 0.5M). al vidrio. y como estimulación FSH recombinante. Los ovocitos se recuperaron por punción La supervivencia ovocitaria se evaluó La técnica de vitrificación permite burlar transvaginal ecoguiada, 36-38 horas inmediatamente tras la desvitrificación dos de los factores que limitan el éxito tras la administración de la hCG. Los y tras 4 horas de cultivo in vitro, de la criopreservación: por un lado, el complejos cúmulo-ovocito fueron valorándose la integridad de la zona proceso conocido como chilling injury cultivados en medio IVF (Universal IVF pelúcida, la apariencia del citoplasma y (Vatja and Kuwayama, 2006) y, por otro, Medium, Medicult, Jyllinge, Denmark) la ausencia de lisis celular. la formación de cristales de hielo en el bajo condiciones de cultivo estándar interior de las células (Mazur, 1984). El (37º C y 5% de CO2). Tras al menos 2 Fijación y tinción inmunocitoquímica: primero se define como el daño horas de cultivo in vitro, los ovocitos irreversible tras la exposición de las fueron incubados con 80 IU/mL La fijación de los ovocitos y tinción células a bajas temperaturas (de + 15º C hialuronidasa (Hyadase, Medicult, inmunocitoquímica del huso meiótico se a -5º C) antes de que se produzca la Jyllinge, Denmark) y las células del realizó siguiendo el protocolo descrito enucleación del hielo. En consecuencia, cúmulo fueron eliminadas mediante el por Lin et al. (2008). estructuras celulares como el pipeteado mecánico de los ovocitos. Los citoesqueleto o las membranas celulares ovocitos fueron entonces observados Brevemente, los ovocitos MII se ven claramente afectadas. El utilizando un microscopio invertido desvitrificados y frescos (grupo control) fenómeno del chilling puede minimizarse (x200) y los ovocitos MII se identificaron fueron fijados a 37ºC durante 1 hora en durante el proceso de vitrificación por la presencia del primer corpúsculo una solución de formaldehído al 2% y mediante el empleo de tasas de polar. permeabilizados en una solución de enfriamiento elevadas (Liebermann et Tritón X-100 al 0.5% durante 30 al., 2003). La velocidad de enfriamiento Se vitrificaron un total de 12 ovocitos en minutos a temperatura ambiente. Para de la muestra va a depender del volumen estadio de MII recuperados de pacientes la tinción de la tubulina, los ovocitos se de la solución de vitrificación, así, a incluidas en el Programa de Fecundación incubaron durante 90 minutos a 37ºC en menor volumen, mayor velocidad de in vitro del Instituto de Medicina una solución de anticuerpos primarios enfriamiento, aumentando ésta Reproductiva (IMER) de Valencia que anti-α y anti-β tubulina (1/400), seguido mediante la inmersión directa en firmaron el correspondiente de 3 lavados y se incubaron durante 120 nitrógeno líquido. Para evitar la consentimiento informado. Como grupo minutos a 37ºC en una solución de formación de cristales de hielo, en la control (ovocitos MII no vitrificados), se anticuerpo secundario Alexa 488 técnica de vitrificación se emplean incluyeron 6 ovocitos procedentes de (1/200). Para la tinción de elevadas concentraciones de pacientes pertenecientes al Programa de microfilamentos, los ovocitos se crioprotectores (Liebermann et al., Fecundación in vitro de la Unidad de incubaron en una solución de rodamina- 2003), sin olvidar su efecto tóxico para Reproducción del Hospital Universitario faloidina durante 60 minutos a las células. Sin embargo, una la Fe de Valencia, previa firma del temperatura ambiente. Finalmente, los composición adecuada de consentimiento de participación en un ovocitos fueron montados utilizando crioprotectores puede solventar los Proyecto de Investigación desarrollado en medio de montaje con DAPI y efectos tóxicos y osmóticos debidos a la el Centro de Investigación Príncipe Felipe mantenidos a 4ºC hasta su evaluación. alta concentración de crioprotectores en (CIPF) de Valencia y con licencia por parte la solución de vitrificación. La mezcla de del Instituto de Salud Carlos III. Evaluación del huso meiótico: crioprotectores más utilizada es la formada por etilenglicol (EG), Protocolo de vitrificación: Para la valoración de los microtúbulos, dimetilsulfóxido (DMSO) y sacarosa. microfilamentos y cromosomas, se Para la vitrificación ovocitaria se utilizó utilizó un microscopio confocal con El objetivo de este estudio fue evaluar el el kit comercial de Irvine Scientific con lasser-scanning (Leica DM IRE 2) efecto de la criopreservación ovocitaria el Cryotip™ como contenedor. Los equipado con un láser de argón, mediante la técnica de vitrificación con ovocitos fueron equilibrados en una perteneciente al Servicio de Microscopía un sistema cerrado (Cryotip™) sobre la solución compuesta por 7.5 % (v/v) de Confocal del CIPF de Valencia. integridad del huso meiótico y la DMSO + 7.5% (v/v) de EG + 20% organización cromosómica en ovocitos suplemento sustitutivo de suero en RESULTADOS humanos Metafase II (MII). medio 199. Posteriormente, fueron expuestos a la solución de vitrificación Se vitrificaron y desvitrificaron 12 MATERIAL Y MÉTODOS compuesta por 15 % (v/v) de DMSO + ovocitos MII. La tasa de supervivencia 15% (v/v) de EG + 0.5M de sacarosa + fue del 91,6% (11/12). Todos los Ovocitos MII: 20% suplemento sustitutivo de suero en ovocitos que sobrevivieron a la medio 199 y cargados en el Cryotip™. desvitrificación mostraron una A todas las pacientes que formaron parte Para la desvitrificación, los ovocitos apariencia morfológica normal tras 4 del estudio se les aplicó un protocolo de fueron expuestos a soluciones horas de cultivo in vitro.
  3. 3. A R T Í C U L O I Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico. 16 Se fijaron para tinción correcta segregación cromosómica y AGRADECIMIENTOS inmunocitoquímica 10 ovocitos MII evitar así la posible aparición de desvitrificados y 6 ovocitos MII frescos. aneuploidías en el embrión. Aunque sólo Este estudio ha sido parcialmente La tasa de ovocitos informativos fue del se observaron anomalías en el huso financiado por el Programa de Medicina 100% para el grupo control y del 70% meiótico/cromosomas en el grupo Regenerativa del Instituto de Salud para los ovocitos desvitrificados. Esta de ovocitos desvitrificados, las Carlos III. menor tasa de informatividad para diferencias no fueron estadísticamente ovocitos desvitrificados fue debida a significativas respecto al grupo control REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS problemas acontecidos durante la (frescos). Estos resultados son similares tinción, con independencia de la técnica a los descritos en la bibliografía (Li et Boiso I, Martí M, Santaló J. A confocal de vitrificación. al., 2006; Cobo et al., 2008). microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human En función de la orientación del La vitrificación utilizando el Cryotip™ oocytes cryopreserved at the germinal complejo huso/cromosomas respecto al como contenedor permite la vitrificación vesicle and metaphase II stage. Human plano focal, se consideró una de ovocitos en microvolúmenes (alrededor Reprod 2002; 17: 1885-1891. configuración normal si: a) cuando al de 1 μL), incrementando la tasa de estar orientado de forma paralela al enfriamiento y minimizando el efecto Cobo A, Pérez S, De los Santos MJ, Zulategui plano focal el huso presenta una tóxico de los crioprotectores al disminuir J, Domingo J, Remohí J. Effect of different estructura típica en forma de barril con su concentración. El mantenimiento de la cryopreservation protocols on the los polos ligeramente señalados y los integridad del huso meiótico y de la placa metaphase II spindle in human oocytes. cromosomas dispuestos en el ecuador, metafásica tras la desvitrificación sugiere Reprod Biomed Online 2008; 3: 350-359. b) cuando al estar orientado de forma que dicha técnica de vitrificación permite perpendicular al plano focal el huso preservar la calidad inicial del ovocito y el Li Y, Feng HL, Cao HL, Zheng GJ, Yang Y, presenta una estructura circular con los potencial necesario para soportar el Mullen S, Critser JK, Chen ZJ. Confocal cromosomas orientados en forma de posterior desarrollo embrionario. microscopic analysis of the spindle and círculo y c) cuando al estar orientado de forma oblicua al plano focal el huso presenta una estructura en forma oval (barril acortado) con los cromosomas alineados en el ecuador. Por otro lado, una configuración anómala del complejo huso/cromosomas quedó representada por una desorganización parcial o completa de los microtúbulos o por una dispersión cromosómica o apariencia cromosómica aberrante o poco condensada. En las Figuras 1 y 2 se muestran una configuración normal y una anómala del complejo huso/cromosomas, respectivamente. La proporción de ovocitos con una Figura 1: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa metafásica. configuración normal del huso meiótico y una alineación correcta de los cromosomas fue del 100% para los ovocitos del grupo control y de 85,7% para los ovocitos desvitrificados, sin que se observaran diferencias significativas entre ambos grupos. DISCUSIÓN En este trabajo se evalúa el efecto de la técnica de vitrificación con un sistema cerrado (Cryotip™) sobre la configuración del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en estadio de MII. La integridad de este complejo es imprescindible para que se produzca una Figura 2: Configuración anómala del complejo huso meiótico-placa metafásica.
  4. 4. A R T Í C U L O I Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 17 chromosome configurations of human Committee of the Society for Assisted oocytes matured in vitro. Fertil Steril 2006; Reproductive Technology. Ovarian tissue 85 (4): 827-832. and oocyte cryopreservation. Fertil Steril 2006; 86: S142-7. Liebermann J, Dietl J, Vanderzwalmen P, Tucker MJ. Recent developments in human Vatja G, Kuwayama M. Improving oocyte, embryo and blastocyst vitrification: cryopreservation systems. Theriogenol where are we now? Reprod Biomed Online 2006; 65: 236-244. 2003; 7: 623-633. Lin T, Tsay C, Chen C, Tang P, Ju J. Nuclear and cytoskeletal dynamics during oocyte maturation and development of somatic cell cloned pig embryos injected with membrane disintegrated donor cells. Anim Reprod Sci 2008; 103: 107-119. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol 1984; 247: C125-42. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Practice

×