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  1. 1. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 1 N° 2• Diciembre 2006 Vol. 11 A S O C I A C I Ó N PA R A E L E S T U D I O D E L A B I O L O G Í A D E L A R E P R O D U C C I Ó N ASEBIR REVISTA Actualidad Artículos La Ética en Nuestro Trabajo: 4Nuevas Perspectivas para el Embriólogo: Reflexiones Bioéticas en Relacción al Diagnóstico Papel en el Banco de Líneas Genético Preimplantatorio Celulares de Andalucía 4Aumento de la Fragmentación del DNA Espermático en los Fumadores tras la Capacitación Mediante SWIM-UP Debates 4 La Ética en la Medicina Reproductiva 4 El Charlatán en la Ciencia y los Medios de Comunicación 4 Ética y Técnicas de Reproducción Asistida 4 Ética Profesional del Embriólogo Clínico en los Programas de Reproducción Asistida 4 Bioética y Reproducción Asistida Humana 4 Ética en el Laboratorio de Reproducción Asistida 4 Ética Moral en Repoducción Asistida 4 El Diagnóstico Genético Preimplantacional a Debate Formación Continuada Polaridad Durante el Desarrollo Embrionario Inicial Noticias Agenda Información a los Autores Boletín de Inscripción
  2. 2. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 2
  3. 3. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 3 Í N D I C E Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 3 ASEBIR A S O C I A C I Ó N PA R A E L E S T U D I O D E L A B I O L O G Í A D E L A R E P R O D U C C I Ó N SUMARIO Pág. Vol. 11 • N° 2 • Diciembre 2006 EDITORIAL 5 M. Boada ACTUALIDAD EDITA. La ética en nuestro trabajo: reflexiones bioéticas Asociación para el Estudio de la en relación al diagnóstico genético preimplantatorio. 7 Biología de la Reproducción (ASEBIR) Fernando Abellán ARTÍCULOS JUNTA DIRECTIVA. Nuevas perspectivas para el embriólogo: papel en el banco Presidente: Antonio L. González-Utor de líneas celulares de Andalucía Vicepresidenta: Carmen Ochoa (nodo central banco nacional de líneas celulares) 11 J. L. Cortés, F. Cobo, C. Cabrera, A.H. Barnie, P. Catalina, A. Nieto, Secretaria: Begoña Arán R. Montes, A. Barroso, A. Concha Tesorero: Manuel Ardoy Vocales: Nieves Cremades, Mark Aumento de la fragmentación del DNA Espermático en los Grossmann, Mª Victoria Hurtado de fumadores tras la capacitación mediante SWIM-UP 15 T. Viloria, N. Garrido, J. L. Fernández, J. Remohí, A. Pellicer, Mendoza, Jorge Cuadros, Juan Manuel L. Muriel, M. Meseguer Moreno, Mª José de los Santos, Fernando Marina y Jorge Ten. DEBATES Introducción al debate 23 La ética en la medicina reproductiva 23 Ernesto Veiga COORDINACIÓN El charlatán en la ciencia y los medios de comunicación 26 DE LA REVISTA. Rafael Bernabeu, Jorge Ten. Ética y técnicas de reproducción asistida 27 Nieves Cremades Cristina Camprubí, Joan Blanco. Mark Grossmann Ética profesional del embriólogo clínico en los programas de reproducción asistida 27 Mª Victoria Hurtado de Mendoza Mª Carmen Gonzalvo, Ana Clavero, Antonio Garrido, María Sánchez, Sonia Calderón, Ana Sánchez, Ana Gallego, Marta Pérez, José Antonio Castilla. PUBLICIDAD Y COLABORACIONES. Bioética y reproducción asistida humana 28 ASEBIR Carmen Ochoa. Ética en el laboratorio de reproducción asisitida 30 Secretaría ASEBIR: Carolina Roméu Ética y moral en reproduccion asistida 31 c/ Cronos , nº 20, Bloque 4 Planta 1º Miguel Ruiz Nº 6 28037 Madrid El diagnóstico genético preimplantacional a debate 32 Esther Velilla asebir@asebir.com Tel. 91 367 89 94 - Fax 91 377 49 65 FORMACIÓN CONTINUADA Polaridad durante el desarrollo embrionario inicial 35 I.Santiago Álvarez-Miguel, E. Maria MIguel -Lasobras, F. Javier Martín - Romero, J. DISEÑO, MAQUETACIÓN e IMPRESIÓN. A. Domínguez - Arroyo, E. González Carrera RECCO Imagen y Desarrollo, S.L.L. NOTICIAS c/ Albarracín, 56 - 28037 Madrid Carta e invitación al IV Congreso ASEBIR 46 Fe de erratas 48 Tel. 91 754 00 26 - Fax 91 754 16 05 AGENDA 48 INFORMACIÓN A LOS AUTORES 50 E-mail: recco@recco-sll.com BOLETÍN DE INSCRIPCIÓN 51 IMAGEN DE PORTADA: Depósito Legal: M-18873-1996 Secuencia de divisiones que sistemáticamente se llevan a cabo para dar origen al embrión de 4 células. Los esquemas se basan en modelos similares de Gilbert, 2003. Imágenes del Instituto ISSN: 1136-4424 Extremeño de Reproducción Asistida (IERA) y Grupo de Investigación en Reproducción y Desarrollo Embrionario (REDES). Universidad de Extremadura. Badajoz Soporte Válido: 78-R-CM
  4. 4. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 4 Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 4
  5. 5. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 5 E D I T O R I A L Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 5 La nueva ley de Reproducción Asistida Montse Boada Jefe de la Sección de Biología del Institut Universitari Dexeus. Vocal de la Comisión Nacional de Reproducción Asistida como representante del Colegio Oficial de Biólogos El pasado 11 de Mayo, el Congreso de los diputados aprobó finalmente la nueva ley de reproducción asistida (Ley 14/2006). El gran debate social que generan algunos aspectos éticamente controvertidos de las técnicas de reproducción asistida (TRAs) hizo que hasta consensuarse el nuevo texto de la ley fuera necesaria la elaboración de distintos borradores, la revisión de varios proyectos y el debate de múltiples enmiendas propuestas por los distintos partidos políticos. A tenor de los cambios normativos acontecidos en los últimos años, era casi impensable esperar una ley como la que se ha publicado. La preocupación generada tras la promulgación de la Ley 45/2003 tanto en los profesionales que nos dedicamos a las TRAs como en el colectivo de usuarias que veían como disminuían sus probabilidades de éxito como consecuencia de las restricciones impuestas por dicha ley, parecía conducirnos a un callejón sin salida. Desde la Comisión Nacional de Reproducción Humana Asistida (CNRHA) se trabajó con rapidez y eficacia consiguiendo en un periodo record, la publicación del Real Decreto 1720/2004 y su gran lista de excepciones que permitió solucionar una parte importante del problema. Sin embargo, seguían coexistiendo dos leyes (Ley 35/1988 y Ley 45/2003) que requerían ser revisadas de acuerdo a las necesidades actuales y modificadas con el fin de resolver los puntos controvertidos y algunos “vacíos legales” existentes. La nueva ley elimina definitivamente la tan discutida limitación a fecundar únicamente tres ovocitos y modifica el período máximo de congelación de embriones dejándolo a criterio médico sin un límite fijo. También otorga a las parejas la facultad de decidir el futuro de sus embriones congelados dándoles por fin las mismas opciones a todas por igual, independientemente de la fecha en que se haya realizado la congelación. La posibilidad de destinar los embriones sobrantes (congelados o no) a proyectos de investigación permitirá que puedan desarrollarse líneas propias de investigación tanto para la mejora de las TRAs como en el ámbito de las células madre. La Ley 14/2006 introduce nuevas opciones terapéuticas como la congelación de ovocitos y tejido ovárico con fines reproductivos y el Diagnostico Genético Preimplantacional (DGP) en combinación con determinación de antígenos de histocompatibilidad con fines terapéuticos para terceros. La utilización de ovocitos congelados podrá ya realizarse fuera de las experiencias controladas reguladas por el Real Decreto 120/2003, aunque con autorización expresa de las autoridades sanitarias correspondientes. En el caso del DGP con HLA maching se requerirá la revisión caso a caso por la CNRHA y la autorización de las autoridades competentes. Esta ley refuerza el papel asesor de la Comisión Nacional de Reproducción Asistida que probablemente deberá variar su composición y estatutos para poder adecuarse a sus nuevas atribuciones. Así mismo, introduce a las comisiones homólogas de las Comunidades Autónomas como comisiones de soporte y referencia de la CNRHA permitiendo que colaboren con ésta en el ejercicio de sus funciones. La nueva ley incorpora distintas sanciones administrativas para los casos de incumplimiento de la norma. Sigue prohibiendo la selección de sexo sin indicación terapéutica, la maternidad por sustitución y la clonación reproductiva. Por fin se establece un tratamiento diferencial entre la clonación reproductiva y la clonación terapéutica o transferencia nuclear, dando paso así a que la futura ley de investigación biomédica autorice esta última. Se amplia el periodo de utilización post mortem del material reproductivo de seis a doce meses y se considera otorgado el consentimiento por parte del varón cuando el proceso de transferencia embrionaria se hubiera iniciado con anterioridad a su fallecimiento. En cuanto a las donaciones, se sigue manteniendo el carácter anónimo, altruista y gratuito, pero se reconoce por primera vez el derecho a la compensación económica por las molestias físicas, gastos de desplazamiento y laborales de los donantes. Uno de los retos importantes de la Ley 14/2006 es la puesta en marcha de un Registro de Actividad que recoja los resultados de los distintos centros de reproducción asistida así como del Registro de Donantes cuya creación ya se postulaba en la primera ley de TRA del año 1988 pero que en la actualidad, aun no se ha creado. La ley actual responsabiliza a los centros de comprobar la identidad de los donantes y de las consecuencias de sus posibles donaciones anteriores. Parece totalmente imposible que los centros puedan gestionar este nuevo imperativo legal sin que el Ministerio de Sanidad ponga a su alcance las herramientas necesarias para ello por lo que la creación del Registro de Donantes se convierte en un proyecto totalmente necesario. Algunos aspectos de la Ley han generado incertidumbre y controversia. La revisión del anexo en el que se detallan las técnicas autorizadas y en el que la microinyección espermática de espermatozoides testiculares ha quedado excluida como por arte de magia, es uno de los puntos principales que requieren una urgente revisión. También es imprescindible desarrollar los requerimientos necesarios para proceder a la destrucción de embriones cuando este ha sido el destino elegido por los progenitores, o precisar las posibilidades de utilización de los embriones congelados por parte del cónyuge en situaciones especiales como por ejemplo tras el fallecimiento de la mujer o en el caso de parejas compuestas por dos mujeres. La publicación de la nueva ley de reproducción asistida se ha valorado muy satisfactoriamente por toda la comunidad médico-científica relacionada con las TRAs sin embargo, se espera que en el transcurso de unos meses se produzca el desarrollo normativo necesario para que puedan dilucidarse entre otros, algunos de los aspectos señalados que ya precisan ser revisados. Así mismo se espera que con el paso del tiempo, la nueva ley pueda irse adecuando a las necesidades que vayan surgiendo sin que los cambios políticos que puedan producirse en un futuro lleguen a modificar sustancialmente el espíritu de la recién estrenada “Ley sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida”.
  6. 6. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 6
  7. 7. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 7 A C T U A L I D A D Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 7 LA ÉTICA EN NUESTRO TRABAJO: REFLEXIONES BIOÉTICAS EN RELACIÓN AL DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTATORIO Fernando Abellán Derecho Sanitario Asesores. e-mail: dchosanitario@wanadoo.es Una reciente encuesta dirigida por el ética (Abellán, 2006). de la adolescencia o al principio de la Genetics and Public Policy Center de edad adulta y que, si no se trata, pue- Estados Unidos, y realizada en un nú- En efecto, el DGP conlleva la utiliza- de terminar en cáncer de colon mero importante de clínicas de fertili- ción de las técnicas de reproducción (Doyma, 1996). La formulación de este dad existentes en dicho país, revela asistida y requiere la manipulación y caso fue del siguiente tenor: “Pareja que entre el 4 y el 6 por ciento de todos selección de embriones por motivos sin antecedentes de infertilidad que los ciclos de FIV incluyen ya genéticos, así como el descarte de los acude por DGP debido a riesgo genéti- Diagnóstico Genético Preimplantarorio que se consideren no aptos, con lo que co de poliposis adenomatosa familiar. A (DGP). Al mismo tiempo, indica que el en cierta medida estamos marcando priori, el 50 % de la descendencia here- 28 por ciento de las clínicas que reali- indirectamente unos estándares de co- dará el gen que les hará susceptibles de zan esta técnica la han proporcionado rrección genética de los individuos. padecer numerosos tumores que debe- para evitar enfermedades que se mani- Hay que tener en cuenta además que, rán ser tratados quirúrgicamente para fiestan en la edad adulta, como corea de contrariamente a lo que trasciende al- no desarrollar cáncer” (simposium Huntington, cáncer de mama heredita- gunas veces a los medios de comuni- FIV-Extreme, 2004). rio o Alzheimer (Baruch et al., 2006). cación, la técnica de DGP no permite evitar hijos libres de enfermedades eli- Un individuo que padezca esta en- La encuesta realiza asimismo un minando la patología del embrión, sino fermedad, autosómica dominante, ten- sondeo acerca de cómo piensan las que a lo que faculta realmente es a se- drá que sufrir múltiples adenomas co- clínicas que evolucionará el DGP en el parar los sanos de los que no lo son, lorrectales a partir de la adolescencia y futuro, encontrándose de acuerdo un descartando a estos últimos para la durante toda su vida habrá de ser tra- 77 por ciento en que los cambios en la transferencia al útero materno. En de- tado periódicamente. finitiva, se seleccionan embriones que tecnología permitirán que se lleve a cabo ya son sanos de por sí y no se cura a Si no se realiza profilaxis existe una un análisis completo del genoma del ninguno de los enfermos. probabilidad muy alta de que su dolen- embrión, como una actuación rutinaria cia degenere en cáncer de colon a la que formará parte de la FIV. Aunque las consideraciones referi- edad de cuarenta años. das, y otras posturas muy críticas con Se constata de esta forma que el la técnica de que estamos hablando, Al estudiar este caso vemos, por tan- DGP está entrando en una nueva fase no tengan que suponer en modo algu- to, que se trata de un supuesto en el de expansión, en la que, a las habitua- no un freno para el avance médico en que el futuro hijo, si recibe el gen mu- les aplicaciones para detectar cromo- este campo, sí considero que deben tado, va a tener un riesgo alto de pade- somopatías o enfermedades monogé- hacernos reflexionar sobre el hecho de cer problemas de salud a partir de la nicas, se le añaden otras utilidades que nuestro trabajo tiene un contenido adolescencia, que le van a implicar cada vez más prometedoras en el cam- ético indudable, al que no debemos molestias importantes pues le obligará po de la detección de enfermedades de ser insensibles si no queremos incurrir a hacerse revisiones cada dos años aparición tardía, multifactoriales y/o de en la denominada omnipotencia tecno- como mínimo y también a extirparse expresión fenotípica variable. científica, que se olvida con frecuencia quirúrgicamente los adenomas con la de la máxima bioética de que todo lo frecuencia necesaria. Lo anterior va a suponer que el pro- que es científicamente posible no tie- fesional sanitario adquirirá a medio ne por qué ser necesariamente ética- Sin embargo, al mismo tiempo, pue- plazo herramientas diagnósticas más mente admisible. Veamos a continua- de decirse que si finalmente padece la potentes, con las que va a poder ayu- ción algunos casos clínicos reales de enfermedad pero realiza los cuidados dar a las parejas a evitar hijos con gra- DGP que plantean dudas éticas. pertinentes, no necesariamente habrá ves enfermedades. Pero, al mismo de padecer cáncer de colon y que, tiempo, hay que decir que las ventajas El primero de ellos guarda relación además, se ignora por completo en de tipo médico y científico que ello con la patología conocida como polipo- este momento el avance de la ciencia comporta no le deben hacer olvidar la sis adenomatosa familiar, que consiste médica en los próximos veinte años, repercusión social de su trabajo y, en en un trastorno hereditario caracteriza- que será cuando surja realmente el pro- este sentido, que técnicas como el DGP do por el desarrollo de abundantes pó- blema. A partir de aquí ¿justifica esta si- no son ajenas a una gran controversia lipos en el colon, que comienza al final tuación la realización de un DGP a los
  8. 8. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 8 A C T U A L I D A D Fernando Abellán. La Ética en Nuestro Trabajo... 8 progenitores para seleccionar unos em- lización del DGP para llevar a cabo una briones en los que esté descartada la Por último, citamos un caso clínico selección genética de los embriones. transmisión de esta patología a sus futu- de una paciente con antecedentes fa- Lo cierto es que en los casos clínicos ros hijos? La Autoridad británica de miliares de cáncer de mama, que de- analizados podríamos establecer una Fertilidad y Embriología Humana ha en- sea utilizar el DGP para la detección de graduación de situaciones en función tendido que sí al permitir expresamente un oncogén predisponente a dicha en- de su gravedad, siendo más factible el el DGP en este caso concreto (HFEA). fermedad y descartar a los embriones consenso favorable a la realización de que presenten dicha alteración. El caso la selección embrionaria en aquellos Otro caso clínico interesante sería el se describe así: “Tenemos una pacien- de aparición de la enfermedad más de la Neurofibromatosis, patología de ex- te cuya familia tiene antecedentes de probable y con consecuencias más le- presión fenotípica variable, expuesto así: cáncer, ya que la mayoría de los miem- sivas para la salud. “De entre las consultas recibidas solici- bros son portadores de un oncogén y tando DGP de enfermedades monogé- muchos de ellos han desarrollado la en- En principio, cabría pensar que el nicas, algunas de ellas se deben a enfer- fermedad. DGP debe emplearse en el diagnóstico medades con expresión fenotípica varia- de enfermedades hereditarias graves, ble. Ni siquiera el contexto familiar pue- Dado que nuestra paciente quiere pero ¿qué es una enfermedad grave? o de predecir los síntomas de la futura someterse a un tratamiento de fertili- ¿cómo definiríamos lo que es la salud? descendencia en caso de heredar el gen dad, la consulta jurídica que hacemos Aunque hay algunas propuestas doc- alterado. Es el caso de una pareja que es si se pueden someter los embriones trinales para arrojar luz en esta mate- acude por antecedentes familiares de a un DGP para transferir aquel o aque- ria, lo cierto es que se trata de una Neurofibromatosis de tipo 1 en la familia llos que no sean portadores del onco- cuestión compleja. Hay quienes pien- del varón (padre afectado, dos herma- gén. La duda surge porque la paciente san que la decisión final sobre el DGP nos también afectados, uno fallecido por no tiene la enfermedad, sólo el gen. En ha de recaer en los progenitores, ya la enfermedad). La pareja tiene un hijo caso de poder realizar el DGP, ¿es nece- que quién mejor que ellos para cono- sano de un primer embarazo y ha pasa- sario alguna autorización especial o úni- cer la trascendencia de cualquier pa- do recientemente por dos interrupciones camente comunicárselo a la autoridad decimiento de origen familiar; otros con- voluntarias de embarazo consecutivas. sanitaria a final de año?” (Fundación sideran que ha de existir un control pú- Acuden a la clínica de reproducción so- Salud 2000 & Derecho Sanitario blico estricto en esta materia, estable- licitando DGP ¿Debemos ofrecer DGP Asesores, septiembre, 2006). ciéndose normativamente un listado ce- aún sabiendo que no podemos predecir rrado de patologías autorizadas; no fal- los futuros síntomas de los embriones Aquí hay que tener en cuenta que no tan tampoco quienes abogan por prote- que hereden la mutación, pero sabien- hablamos de la posible transmisión de ger a ultranza la identidad genética de do que algunos padecerán síntomas una enfermedad hereditaria (el cáncer los individuos. graves y otros, un número importante, como tal no se hereda), sino de la no verán reducida su calidad de vida transmisión de una predisposición a Lo cierto es que la corriente que se significativamente?” (simposium FIV- padecerla, lo que hace más incierto to- va imponiendo hoy día en países como Extreme, 2004). davía si afectará o no el problema al Francia o Reino Unido, y que ha que- futuro hijo, ya que además se ignora dado introducida en España a raíz de La Neurofibromatosis es un trastor- igualmente el estado de la ciencia la ley de reproducción asistida (Ley no congénito caracterizado por nume- cuando el hijo se convierta en un adul- 14/2006 de 26 de Mayo), sería aquella rosos fibromas en nervios y piel, man- to. que se apoya, no tanto en contemplar chas de café con leche en la piel y, en situaciones genéricas sino casos con- algunos casos, anomalías del desarro- De los casos relatados se deduce fá- cretos y en que, con independencia llo de músculos, huesos y vísceras. cilmente que la utilización del DGP del control último de la autoridad ad- para la prevención de enfermedades Como puede observarse, el paciente genéticas de aparición tardía o multi- ministrativa, intervengan comités éti- afectado de Neurofibromatosis tiene la factoriales es objeto de especial debate cos multidisciplinares que estudien la particularidad de que, además de no desde el punto de vista bioético, ya que problemática particular (personal, fa- ser seguro el padecimiento de la enfer- a la postre plantea el problema de de- miliar) que subyace respecto de cada medad por la descendencia, en el su- terminar cuándo una vida es digna de solicitud de DGP sobre patologías del puesto de desarrollar su sintomatología ser vivida y, en consecuencia, dónde tipo de las que nos estamos refirien- podrá ser grave o no, dependiendo poner los límites a la selección genéti- do. Sería una perspectiva ecléctica también de factores multifactoriales ca de embriones. Lógicamente, en la respecto de las anteriores citadas que influirán a lo largo de su vida (la medida en que es más remota la posi- que pretende combinar un control HFEA autoriza el DGP en el caso de la bilidad de que los hijos padezcan una público con el análisis bioético por- Neurofibromatosis tipo 2, pero no en la enfermedad grave pierde contunden- menorizado de cada situación. de tipo 1, como el analizado aquí). cia también la decisión proclive a la uti-
  9. 9. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 9 Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 9 BIBLIOGRAFÍA Doyma. Diccionario Mosby de la Salud, Baruch S, Kaufman D, Hudson KL. Genetic 1996.Simposium FIV-EXTREME «Foro de testing of embryos: practises and perspecti- debate científico, ético y legal a partir de casos ves of U.S. IVF clinics. Fertility and Sterility clínicos. ¿Hasta dónde podemos llegar en 2006 [en prensa]. Técnicas de Reproducción Asistida?», Reus, 12-14 de Noviembre de 2004. Abellán, F Aspectos bioéticos y legales del diag- nóstico genético preimplantatorio (DGP). The Human Fertilisation and Embryology Authority Revista Iberoamericana de Infertilidad, 2006; (HFEA) www.hfea.gov.uk (Home>How we Vol. 23, nº. 2:123-130. Regulate>Policy>Policy reviews).
  10. 10. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 10
  11. 11. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 11 A R T Í C U L O S Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 11 NUEVAS PERSPECTIVAS PARA EL EMBRIÓLOGO: PAPEL EN EL BANCO DE LÍNEAS CELULARES DE ANDALUCÍA (NODO CENTRAL BANCO NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES) New perspectives for the embryologist: role in the Andalusian Stem Cell Bank (Spanish Central Node) José Luis Cortés*, Fernando Cobo, Carmen Cabrera, Angela Helen Barnie, Purificación Catalina, Ana Nieto, Rosa Montes, Alicia Barroso, Ángel Concha Banco de Líneas Celulares de Andalucía (Nodo Central Banco Nacional de Líneas Celulares). * Banco de Líneas Celulares de Andalucía. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Avda Fuerzas Armadas 2, 18014 Granada. E-mail: josel.cortes.sspa@jun tadeandalucia.es RESUMEN: Un banco de líneas celulares troncales tiene como funciones la elaboración, el almacenamiento, la conservación y la gestión de líneas celulares de diverso tipo, de acuerdo con las normas y estándares que determina la legislación nacional e internacional. Dentro de los tipos de líneas celulares se encuentran las de origen embrionario, obtenidas a partir de la masa celular interna de blastocistos procedentes de preembriones sobrantes de ciclos de FIV, donde la figura de un embriólogo que manipule los preembriones es necesaria. Para poder definir aspectos en cuanto al perfil de este tipo de profesional, debemos buscar las similitudes con los centros de reproducción asistida. Mediante este trabajo se pretenden describir las funciones de un embriólogo dedicado a la derivación de líneas celulares embrionarias humanas dentro del Banco de Líneas Celulares de Andalucía. PALABRAS CLAVE: Banco de líneas celulares troncales, blastocisto, célula troncal embrionaria, embriólogo, FIV, masa celular interna. SUMMARY: The functions of a stem cell bank are the elaboration, storage, conservation and management of all the cell line types, according to national and international regulations currently in force. One of these cell lines is the embryonic stem cell line, which is obtained from the inner cell mass of blastocysts of IVF spare embryos, where the figure of an embryologist who manipulates the embryos is necessary. To be able to define some aspects about the profile of this type of professional, we must look for the similarities with the Assisted Reproduction Centres. A description of the functions of the embryologist who derives human embryonic stem cell lines in the Andalusian Stem Cell Bank has been carried out. KEY WORDS: Stem cell bank, blastocyst, embryonic stem cell, embryologist, IVF, inner cell mass.
  12. 12. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 12 A R T Í C U L O S José Luis Cortés. Nuevas Perspectivas... 12 INTRODUCCIÓN La creación de bancos de líneas celu- poder regenerativo de las células tron- ya formado. lares troncales públicos es un hecho cales embrionarias, numerosos cen- reciente en Europa (aproximadamen- tros de investigación han iniciado pro- La ASMR 2004, en la guía para labo- te 5 años), siendo España pionera en yectos de derivación de hESCs, don- ratorios de embriología y andrología, este sentido, con la inauguración del de la figura del embriólogo adquiere enumera los servicios que ofrecen en Banco de Líneas Celulares de otra perspectiva. concreto los laboratorios de embriolo- Andalucía (BLCA), en Granada, el 23 gía clínica: de Enero de 2004. Tanto la derogada Aún así, para poder definir aspectos reforma de la Ley 35/1988 (Ley referentes a la figura del embriólogo - Preparación de los medios de cul 45/2003, de 21 de Noviembre), como en un centro de investigación debe- tivo y control de calidad la actual Ley 14/2006, de 26 de Mayo, mos buscar las “homologías” con el - Identificación de ovocitos mediante sobre Técnicas de Reproducción papel desempeñado en los centros de examen del líquido folicular Asistida, así como la Directiva Europea reproducción asistida. - Evaluación de la madurez y calidad (European Union, 2004), permiten a los ovocitaria bancos de líneas celulares españoles ASEBIR ha publicado en el año - Preparación del esperma: recolec- derivar líneas celulares embrionarias 2006, dentro del programa de ción y análisis del semen, lavado y ca- humanas (siglas inglesas hESCs hu- Cuadernos de Embriología Clínica, unas pacitación espermática man embryonic stem cells) a partir de Recomendaciones sobre Recursos - Inseminación de los ovocitos preembriones sobrantes de ciclos de Humanos y Físicos para el Laboratorio - Determinación de la fertilización FIV, siempre bajo el consentimiento in- de Reproducción Asistida Humana. En y evaluación de la calidad del zigoto formado de los progenitores. estas recomendaciones, el embriólogo - Cultivo embrionario y evolución sería el encargado de tomar las decisio- de la calidad embrionaria Algo novedoso en la Ley es la elimi- - Transferencia embrionaria nes clínicas dentro del laboratorio de nación de las diferencias en la consi- - Crioconservación, almacenaje y acuerdo con los protocolos estableci- deración de los preembriones crio- descongelación de esperma, ovocitos dos, y realizaría la mayor parte de la conservados con anterioridad a la en- y embriones labor asistencial del laboratorio de an- trada en vigor de la Ley 45/2003, y los - Micromanipulación de ovocitos drología y embriología. que pudieran generarse posterior- humanos y/o embriones mente, en cuanto a sus posibles des- Respecto a la formación del embrió- tinos, siempre supeditados a la volun- Es obvio que en los centros de inves- logo, éste deberá haber obtenido el tigación en los que se deriven hESCs, la tad de los progenitores. Es decir, cual- grado de Licenciado en Ciencias función del embriólogo será diferente a quier preembrión crioconservado, sea Biomédicas, como hemos expuesto las descritas anteriormente, pero pen- cual fuere su tiempo de crioconserva- anteriormente, poseer conocimientos samos que la persona encargada de de- ción, podría ser utilizado para fines de de fisiología humana, endocrinología rivar estas líneas sí debe de haber ad- investigación siempre y cuando los reproductiva, genética, técnicas de la- quirido anteriormente una amplia expe- progenitores firmen el consentimiento boratorio de andrología y embriología, riencia en este campo, lo que le otorga- y estén asociados a un proyecto con- y conocimientos de cultivo celular. rá propiedad a la hora de manipular los creto que deberán autorizar posterior- Además deberá poseer una experien- preembriones destinados a generar una mente los Comités Éticos correspon- cia de al menos 2 años y acreditar la línea celular. dientes. realización de 100 ciclos de FIV con ICSI y 200 preparaciones de semen De esta manera, las funciones del pro- PERFIL Y FUNCIONES DEL para inseminación artificial, supervi- fesional responsable del Área de EMBRIÓLOGO sados por el coordinador del laborato- Embriología dentro del BLCA son rio en cuestión, o por otro embriólogo (Figura 1): Aunque no es aún un título oficial, el embriólogo es aquel Licenciado en Ciencias Biomédicas (Medicina, Veterinaria, Farmacia, Biología o Química) con experiencia en Biología de la Reproducción. Según el R.D. 413/1996, de 1 de Marzo, para que un centro esté autorizado en la aplicación de las técnicas de reproducción asisti- da deberá estar dotado de una perso- na que cumpla los requisitos anterio- res. Hasta ahora, la figura del embrió- logo ha estado siempre relacionada con las clínicas de reproducción asis- tida, pero con el descubrimiento del
  13. 13. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 13 A R T Í C U L O S Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 13 - Descongelación de preembriones rios métodos que consisten en el Medical Research (ICMR-DBT, crioconservados. Como los preem- aislamiento de la MCI y la elimina- 2006) expone que el profesional briones provienen de distintos cen- ción de las células del trofoectoder- que realice el tratamiento de fertili- tros, es competencia de esta área mo de los blastocistos. En nuestro dad y el investigador que derive la el conocimiento de todos los proto- centro hemos experimentado dos línea celular o que trabaje con ellas colos de congelación/descongela- métodos para realizar el aislamiento no sean la misma persona. Además ción utilizados para optimizar los de la MCI dependiendo de la cali- explica que la decisión sobre el des- resultados en cuanto a la obtención dad blastocitaria. Por un lado, un tino de los preembriones debe estar de hESCs. método mecánico, bien por micro- libre de la influencia de los investi- manipulación o por empleo del di- gadores que podrían alentar a los -Clasificación de preembriones sector láser, cuando los blastocistos progenitores hacia su uso con fines crioconservados descongelados, si- son de buena calidad con una MCI de investigación. guiendo criterios morfológicos bastante distinguible y con tamaño (Calderón et al., 2002): adecuado. En cambio, nosotros pensamos que el embriólogo del banco de cé- o Ritmo de división de las blastómeras El empleo del láser es un nuevo lulas troncales sí debe ser parte ac- o Apariencia del citoplasma de las método de aislamiento de la MCI tiva en el proceso de entrevista, ex- blastómeras probado en modelo murino por va- plicación y firma del consentimien- o Contacto entre las blastómeras rios grupos, dando buenas tasas de to informado por parte de la pareja, o Aspecto de la zona pelúcida derivación de líneas celulares em- o la mujer en su caso, estando dis- o Fragmentación de las blastómeras brionarias murinas (mESCs) ponible para realizar las entrevistas o Multinucleación de las blastómeras (Tanaka et al., 2006; Cortés et al., cuando sea necesario, ya que es o Evaluación de la calidad blasto 2006). Consiste en ir aplicando el experto en cuanto a cualquiera de citaria láser a las células del trofoectoder- los destinos propuestos por la Ley mo destruyéndolas, siendo sola- española (Ley 14/2006). Aunque algunos autores no rela- mente las células de la MCI las que cionan la calidad embrionaria y blas- se adhieren a la superficie de culti- El BLCA es un centro multidiscipli- tocitaria con la tasa de obtención de vo elegida (Fibroblastos murinos y nario donde varias áreas interaccio- líneas celulares (Mitalipova et al., humanos, MatrigelTM). nan para una adecuada coordina- 2004), desde nuestro centro pensa- ción, con el objetivo de elaborar, al- mos que esta clasificación sí es im- Para los blastocistos con una pe- macenar, conservar y gestionar to- portante a la hora de elegir el méto- queña o nada visible MCI, utiliza- dos los tipos de líneas celulares, de do de aislamiento de la masa celu- mos el método de cultivo directo del acuerdo a las actuales normativas lar interna (MCI) y posterior deriva- blastocisto sobre la superficie de nacionales e internacionales. Estas ción de la línea celular (Ver abajo). cultivo elegida (Kim et al., 2005). áreas o secciones son las siguientes Así, tanto las células del trofoecto- (Figura 1): Área de calidad; área de - Cultivo y evolución de los preem- dermo, como las de la MCI se ad- trazabilidad; área de embriología; briones hasta estadio de blastocis- hieren a dicha superficie. Pasados área de cultivo celular; área de cito- to, donde se encuentra la MCI, unos días, los dos tipos celulares genética y biología molecular; área compuesta por las células tronca- sufren un crecimiento, y mecánica- de microbiología y área de investi- les, que darán lugar a las hESCs. mente se separa la MCI. Aparte gación. Para evaluar la calidad blastocitaria existe otro método de aislamiento atendemos al modelo propuesto de la MCI mediante inmunocirugía CONCLUSIÓN por el Instituto Cornell (Veeck and (Solter and Knowles, 1975), pero Zaninovic, 2004), donde se valora que está en desuso debido a que los En el BLCA pensamos que existe el grado de expansión del blastocis- medios utilizados contienen produc- una nueva figura de embriólogo in- to, así como el aspecto del trofoecto- tos de origen animal, con el riesgo de vestigador especializado en la ma- dermo y la MCI, quedando estable- contaminación cruzada. nipulación de preembriones huma- cidas tres categorías: nos destinados a generar nuevas - Coordinador entre los centros de re- hESCs. Este embriólogo debe haber o Blastocistos de buena calidad producción y el banco para la perfec- acreditado experiencia previa en con una MCI bastante distingui ta interlocución en la donación de embriología clínica, y debe de estar ble y con tamaño adecuado. preembriones para fines científicos. en contacto con las clínicas de re- o Blastocistos con una pequeña - Coordinador de la labor de obten- producción para la perfecta coordi- pero distinguible MCI. ción de los consentimientos infor- nación en la donación de preem- o Blastocistos de mala calidad con mados. La Guía para la Investigación briones con fines de investigación. una MCI poco definida. y Terapia con Células Troncales pro- Además, el área de embriología al - Derivación de hESCs. Existen va- puesta por la Indian Council of que estará integrado el embriólogo
  14. 14. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 14 A R T Í C U L O S José Luis Cortés. Nuevas Perspectivas... 14 formará parte del Banco de Células en blastocistos de ratón para obten- Stem Cells 2003;21:521-526.Real Troncales, con un stock propio de ción de células troncales embriona- Decreto 413/1996, de 1 de marzo, por líneas celulares embrionarias, para rias: cultivo directo vs. láser. IX el que se establecen los requisitos téc- su distribución a centros de investi- Congreso de la Asociación Española nicos y funcionales precisos para la gación que las puedan utilizar para de Bancos de Tejidos; 2006 May 17- autorización y homologación de los investigación básica y futuras apli- 19; Oviedo, España. P. 73-4. centros y servicios sanitarios relacio- caciones clínicas. nados con las técnicas de reproduc- European Union 2004. Directive ción humana asistida. BOE núm 72: AGRADECIMIENTO 2004/23/EC of the European 11256-11260. Parliament and of the Council of 31 Al Dr. José Antonio Castilla por su March 2004 on setting standards of Solter D, Knowles BB . Immunosurgery asesoramiento en la elaboración de quality and safety for the donation, of mouse blastocysts. Proc Natl Acad este artículo. procurement, testing, processing, pre- Sci USA 1975;72:5099-5102. servation, storage, and distribution of BIBLIOGRAFÍA human tissues and cells. Official Tanaka N, Takeuchi T, Neri QV, Sills ES, Journal of the European Union, L Palermo GD. Laser-assisted blastocyst ASEBIR, Recomendaciones sobre recur- 102/48. dissection and subsequent cultivation sos humanos y físicos para el laborato- of embryonic stem cells in a rio de reproducción. Cuadernos de ICMR-DBT. Indian Council of Medical serum/cell free culture system: appli- Embriología Clínica. Ed. Asociación Research. Guidelines for Stem Cell cations and preliminary results in a para el Estudio de la Biología de la Research and Therapy. 2006. murine model. J Transl Med. 2006. In Reproducción, 2006. www.icmr.nic.in. press DOI:10.1186/1479-5876-4-20. ASRM. American Society for Kim HS, Oh SK, Park YB, Anh HJ, Sung Veeck, LL, Zaninovic N. Human blas- Reproductive Medicine. Reviewed gui- KC, Kang MJ, et al. Methods for deriva- tocyst in vitro. En Veeck LL, Zaninovic delines for human embryology and an- tion of human embryonic stem cells. N, editors. An atlas of human blas- drology laboratories. 2004. Stem Cells 2005;23:1228-1233. tocysts. New York:The Parthenon www.asrm.org. Ley 45/2003, de 21 de noviembre, por Publishing Group; 2003. p. 99-137. Calderón G, Prados N, Caligara C, la que se modifica la Ley 35/1988, de Mantuana E, Navarro J, Pellicer A, 22 de noviembre, sobre Técnicas de Figura 1. Funciones del Área de Remohí J. Calidad embrionaria. Reproducción Asistida. BOE núm Embriología dentro del organigrama del Indicadores predictivos de vitalidad. 280:41458-41463. Banco de Líneas Celulares de En: Remohí J, Pellicer A, Simón C, Andalucía. Navarro J, editors. Reproducción Ley 14/2006, de 26 de mayo, sobre Humana. 2º ed. Madrid: McGraw-Hill- Técnicas de Reproducción Humana Interamericana de España; 2002. p. Asistida. BOE núm 126: 19947-19956. 463-468. Cortés JL, Cobo F, Catalina P, Cabrera Mitalipova M, Calhoum J, Shin S, CM, Nieto A, Montes RM, Sánchez L, Wininger D, Schulz T, Noggle S, et al. et al. Comparación de dos métodos de Human Embryonic Stem Cell Lines aislamiento de la masa celular interna derived from discarded embryos.
  15. 15. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 15 A R T Í C U L O S Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 15 AUMENTO DE LA FRAGMENTACIÓN DEL DNA ESPERMÁTICO EN LOS FUMADORES TRAS LA CAPACITACIÓN MEDIANTE SWIM-UP. Sperm selection by swim-up in terms of DNA fragmentation as measured by the Sperm Chromatin Dispersion test (SCD) is altered in heavy smokers. 1 1 2 1 1 2 Thamara Viloria, Nicolás Garrido , José Luis Fernández, José Remohí, Antonio Pellicer, Lourdes Muriel, Marcos Meseguer 1 1 2 IVI Valencia, Universidad de Valencia. Sección de Genética y Unidad de Investigación, Hospital "Teresa Herrera," Complejo 3 Hospitalario Universitario Juan Canalejo, A Coruña, España. Departamento de Obstetricia y Ginecología Hospital Dr. Peset, Valencia, España. Peticiones de reimpresión: Dr. Thamara Viloria, IVI Valencia - Universidad de Valencia, e-mail: tviloria@ivi.es. Resumen: los hábitos tóxicos y su relación con la infertilidad masculina, ha sido objeto de investigación en los últimos años y dentro de los hábitos tóxicos más comunes dentro de la población está fumar el cigarrillo. Por otro lado, la fragmentación del DNA espermático ha sido relacionada con la infertilidad y disminución de la calidad embrionaria en trabajos previos. Este estudio se ha llevado a cabo con la finalidad de investigar la asociación entre el tabaco y la fragmentación del DNA espermático en muestras de semen fresco y capacitado en hombres infértiles que asisten para un tratamiento de reproducción. Un total de 99 pacientes proporcionaron una muestra de semen; se descartaron previamente otras causas de fragmentación del DNA mediante un cuestionario y se establecieron 3 grupos de acuerdo al consumo de tabaco: no fumadores, fumadores moderados (1-19 cigarrillos/día) y muy fumadores (≥20 cigarrillos /día). El análisis de la fragmentación se llevó a cabo mediante la prueba de la Dispersión de la Cromatina (SCD) antes y después del swim-up. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la fragmentación del DNA según el hábito de fumar en las muestras en fresco; sin embargo, hubo un incremento significativo de células espermáticas con el DNA fragmentado en los hombres fumadores respecto a los no fumadores en las muestras luego del swim-up. Por lo que podemos concluir que el análisis de la fragmentación del DNA espermático después del capacitado es el que puede realmente detectar el efecto perjudicial producido por el tabaco sobre el espermatozoide. Este efecto nocivo altera el proceso de selección del swim-up en los fumadores, sin embargo, las bases moleculares y celulares de este fenómeno no han sido elucidadas, por tanto es recomendable que los hombres que buscan descendencia eviten el consumo de tabaco. Palabras clave: Fragmentación del DNA / Prueba de Dispersión de la Cromatina (SCD) / fertilización in vitro / cigarrillo/ espermatozoide Abstract: Toxic habits and its relation with male infertility has been a matter of investigation in the recent years and smoking is one of the commonest life-style toxic exposures to harmful substances. Sperm DNA fragmentation has been previously linked to infertility and low embryo quality in several works. This cross-sectional study was carried out to investigate the association between cigarette smoking and sperm DNA fragmentation in raw and capacitated sperm from infertile males undergoing assisted reproduction treatments (ART). A total number of 99 infertile males provided one semen sample, other causes of DNA fragmentation was discarded by a previous questionnaire and three groups were established according to the cigarette consumption: non-smokers, light smokers(1-19 cigarettes/day) and heavy smokers (≥20 cigarettes/day), then analyses of the sperm DNA fragmentation was carried out by the Sperm Chromatin Dispersion (SCD) test before and after swim-up treatment. We could observed no differences in the sperm DNA fragmentation in the raw semen samples regardless the smoking habits; nevertheless there is a significant increase in the incidence of sperm cells with DNA strand breaks in male smokers compare to non smokers after the evaluation of post swim-up samples. And we concluded that the analysis of sperm DNA fragmentation after capacitation can really detect the detrimental effect produced by tobacco. This deleterious effect alters the sperm swim-up selective process in smokers but molecular and cellular basis of this phenomenon remain to be elucidated, but based on these evidences, leaving smoking is advisable in males attending to reach parenthood. Key words: DNA fragmentation / sperm chromatin dispersion test (SCD) / In vitro Fertilization / cigarette smoking / sperm
  16. 16. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 16 A R T Í C U L O S Thamara Viloria et al. Aumento de la Fragmentacion del DNA... 16 INTRODUCCIÓN 1982). El tabaco consiste en su mayo- dios serios, objetivos y completos que ría de carbohidratos y proteínas (aprox revelen la acción que estos ejercen en El término “Infertilidad” se define 50%). Otro constituyente significante el espermatozoide, principalmente en como la incapacidad de una pareja de son alcaloides (0,5-5%) con la nicoti- población con deseos de gestación. conseguir un embarazo luego de rela- na como compuesto predominante ciones sexuales regulares no protegi- (90-95% de los alcaloides totales), po- Con este fin, hemos aprovechado el das. Aproximadamente un 15% de las lifenoles (0,5-4,5%), fitoteroles (0,1- conocimiento ganado en los trata- parejas con deseo de gestación tienen 2,5%), ácidos carboxílicos (0,1- mientos de reproducción asistida dificultad de concebir tras este perío- 0,7%), hidrocarbonos aromáticos, al- (TRA) después de la introducción de do. El factor masculino es por sí solo dehídos, cetonas, aminas, pesticidas, diversos análisis como la prueba de la el causante de esa infertilidad en un etc (0,01-5%) y más de 30 compues- Dispersión de la Cromatina (SCD) para 20% de los casos y contribuye en otro tos metálicos (Wynder and Hoffmann, estudiar el efecto del tabaco sobre la 30-40%, siendo las alteraciones en el 1967; Internacional Agency for integridad del DNA de los espermato- semen el origen de la misma Research on Cancer, 1986). zoides antes y después del swim-up (Rodríguez et al., 2005). en parejas que consultan por infertili- La nicotina, el principal alcaloide del dad. El sistema reproductivo es bastante tabaco, está presente en los cigarrillos complejo, sin embargo, los diseños en una cantidad que varía desde 0,8- Este estudio introduce nuevos avan- experimentales de pruebas in vitro e 1,8 mg/cigarrillo, dependiendo de la ces respecto a las consecuencias del in vivo nos pueden ser útiles para de- marca y tamaño del mismo (Benowitz tabaco en la reproducción humana. tectar algunas alteraciones. Por tanto, et al., 1983; Rosa et al., 1992). Tanto la reproducción asistida nos brinda un como 1mg de nicotina puede ser ab- Fragmentación del DNA y tabaco: espacio ideal para estudiar algunos sorbido al fumar 1 solo cigarrillo. Este Se estima que un 25% de las cau- factores que podrían estar afectando es un alcaloide muy tóxico que se ab- sas de infertilidad son de origen idio- la calidad seminal y sus implicaciones sorbe rápidamente por el tracto respi- pático y la etiología de algunas de es- a nivel reproductivo. ratorio, la mucosa bucal y la piel tas causas podría estar relacionada (Gandini et al., 1997). con daño en el DNA de los esperma- A lo largo de los años, muchos han tozoides. sido los factores relacionados a la in- La cotinina, su mayor metabolito, es fertilidad masculina, como: infeccio- un compuesto más estable que la ni- La fragmentación de DNA en el es- nes, varicocele (Pomerol, 2002), obs- cotina, con un tiempo de vida media permatozoide está siendo cada vez trucciones y alteraciones en la pro- de aproximadamente 20h (la vida me- más reconocida como una importante ducción espermática (Ballescá, dia de la nicotina es de unas 2h) y su causa de infertilidad, y aunque el ori- 2002), causas genéticas (Egozcue, concentración no se ve influenciada gen del daño a nivel del DNA no es 2002) y muchas veces la causa es por otros factores como por ejemplo la claro (Muratori et al., 2000; Sergerie desconocida y pueden afectar en ma- dieta. En el hombre, la nicotina y/o co- et al., 2005), se han propuesto algu- yor o menor medida a la calidad semi- tinina ha sido detectada en plasma se- nos mecanismos como: defectos en la nal. Sin embargo, su relación con los minal de acuerdo al consumo de ciga- compactación de la cromatina duran- hábitos tóxicos ha sido motivo de in- rrillos (Pacifi et al., 1993, 1995; Vine te la espermiogénesis, inducción de la vestigación en los últimos años, de et al., 1993; Zenzes et al., 1999), lo apoptosis durante el proceso de es- sus resultados se han descrito algunos que indica el paso de estos metaboli- permatogénesis e inducción de daño agentes ambientales tóxicos que pue- tos a través de la barrera hemato-tes- de DNA en espermatozoides diferen- den deteriorar la espermatogénesis, ticular. ciados maduros por espermatozoides ejerciendo efectos nocivos a nivel pre- inmaduros que producen niveles ele- testicular, testicular o post-testicular Esto sugiere que ciertos componen- vados de radicales libres (ROS) (Oliva et al., 2001; Pflieger-Bruss et al., tes del tabaco interactúan, directa o (Garrido et al., 2004). 2004). Uno de estos agentes es el con- indirectamente, afectando la función sumo del tabaco; el cual está amplia- y viabilidad de los gametos; y el meca- Una causa potencial de la fragmen- mente reconocido como un problema nismo que envuelve este resultado tación de DNA es la exposición a toxi- de salud pública y una de las mayores aún necesita ser elucidado. nas ambientales; sin embargo, pocos causas de muertes prevenibles. datos apoyan el concepto de un im- Aproximadamente una tercera parte de El incipiente incremento del interés pacto negativo extenso de contami- la población mundial mayor de 15 años público respecto al declive del poten- nantes ambientales en los resultados es fumadora (World Health cial fértil masculino, y sobre todo, el del análisis del semen (Sun et al., Organization, 1997). Así mismo, el taba- deseo de conocer el efecto que tienen 1997). Algunas de estas toxinas se co afecta la salud reproductiva. los componentes medioambientales y podían relacionar con el consumo de El cigarrillo contiene algunos cientos ocupacionales, y los hábitos de la so- tabaco. de compuestos (Dube and Green, ciedad actual, hacen necesarios estu-
  17. 17. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 17 A R T Í C U L O S Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 17 La relación entre el cigarrillo y la Se les realizó el test de SCD, sin co- Posteriormente, el sobrenadante (0,1- fragmentación del DNA del esperma- nocer, si eran fumadores o no. 0,5ml) fue separado en otro tubo. tozoide ha sido establecida por algu- Posteriormente a los análisis, se pro- Luego, para la determinación de la nos autores (Sun et al., 1997; cedió a hacer una encuesta a los pa- fragmentación del DNA se tomaron Muratori et al., 2000; Zenzes, 2000). cientes acerca de sus hábitos tabáqui- alícuotas (entre 10 y 100µl) con con- No obstante, Sergerie et al. (2005) cos en el momento en el cuál fue rea- centraciones entre 5-10 millones de han reportado una no asociación en lizado el ciclo y los 3 meses anterio- spz/ml de cada muestra de semen an- hombres sanos fumadores y no fuma- res. Se estipularon tres grupos según tes y después del swim-up para ser dores; y Belcheva et al. encontraron el consumo diario de cigarrillo en los procesadas como describe Fernández que el daño en el DNA de los esper- varones: no fumadores (n= 51), fuma- et al. (2003). matozoides de los fumadores estaba dores moderados: de 1-19 cigarrillos incrementado con respecto al de los por día (n= 21) y varones muy fuma- Se establecieron 5 patrones de SCD: no fumadores, pero esta diferencia no dores: más de 19 cigarrillos por día a) Células espermáticas de halo gran- resultaba estadísticamente significati- (n= 27); y se analizaron los datos. de (CHG): su anchura es similar o va. más grande que el diámetro menor Aquellos pacientes que hubieran del nucleoide; b) Células espermáti- Uno de los mecanismos sugeridos consumido drogas o alcohol en los 3 cas de halo mediano (CHM): su halo podría estar relacionado con la inter- meses previos a la realización del es- está entre aquellos con halo grande y ferencia nicotínica sobre la organiza- tudio, fueron incluidos. También éstos halo muy pequeño. Células espermá- ción de la membrana espermática y fueron excluidos, si tenían historia re- ticas sanas (CS): este subgrupo inclu- por lo tanto en la reacción acrosómica ciente de fiebre o exposición a gona- ye las HG y HM, es decir, aquellas sin (Arabi, 2004) inducida por ZP3, una dotoxinas como quimioterapia, radio- fragmentación de DNA; c) Células es- proteína de la zona pelúcida que des- terapia, pesticidas o exposición ocu- permáticas de halo muy pequeño empeña un papel fundamental duran- pacional a metales pesados. Además, (CHP): su espesor es similar o más te la fertilización, funcionando como se investigó acerca de la presencia de pequeño que la tercera parte (1/3) del un receptor específico para el esper- varicocele, torsión testicular, etc., para diámetro menor del nucleoide; d) matozoide (Hinsch et al., 2005). no incluirlos en los mismos. Células espermáticas sin halo (CSH); e) Células espermáticas degradadas El propósito en este estudio es in- Fragmentación del DNA espermático. (CD): son similares al grupo “d”, pero vestigar la asociación entre el taba- Prueba de Dispersión de la Cromatina además están débilmente o irregular- quismo y la fragmentación de DNA del (SCD) mente teñidas. Las células espermáti- espermatozoide en parejas infértiles cas de halo pequeño, sin halo y degra- sometidas a tratamientos de repro- El SCD (Halosperm® kit, INDAS la- dadas contienen DNA fragmentado. ducción asistida, utilizando el SCD an- boratories, España) es una prueba Finalmente los nucleoides que no co- tes y después del procedimiento de desarrollada recientemente, descrita rresponden a células espermáticas swim-up como técnica de capacita- por Fernández et al., (2003), basada fueron separados del recuento. ción espermática en hombres fuma- en el hecho de que en los espermato- dores y no fumadores. zoides con las cadenas de DNA intac- Análisis estadístico: Las compara- tas se produce una descompactación ciones de la fragmentación del DNA MATERIALES Y MÉTODOS de los bucles de DNA, empaquetados con respecto a los 3 grupos estudia- en la matriz nuclear, tras haber sido dos antes y después del swim-up, se Población: La población objeto de expuesto a un tratamiento ácido, se- realizaron por la prueba de análisis de estudio son pacientes infértiles que guido a un tratamiento con agentes varianzas (ANOVA) cuando los datos asisten a tratamientos de reproduc- reductores y detergentes. Esta des- seguían una distribución normal, ción asistida en nuestro centro, del compactación produce un halo alre- mientras que cuando estas seguían cual se seleccionaron aleatoriamente dedor de la matriz nuclear que se una distribución anormal se utilizó la las muestras de semen de los maridos puede visualizar por microscopía de prueba de Kruskal-Wallis (prueba no de parejas que asisten al laboratorio campo claro usando tinciones habi- paramétrica). El análisis estadístico de andrología del IVI para un trata- tuales como el Diff-Quick. Por el con- fue llevado a cabo usando el miento de infertilidad con previo con- trario, si una de las cadenas de DNA Statistical Package for the Social sentimiento de los pacientes, ya que está dañada, no se produce halo, ob- Sciences (SPSS Inc., Chicago, IL, son pruebas que no se realizan de ru- servándose núcleos condensados. USA). La significancia estadística se tina en el laboratorios. Un total de 99 ha definido como P<0,05. hombres proporcionaron 99 muestras Para el análisis de las muestras se de semen para ser analizadas. El ran- realizó el estudio macro y microscópi- RESULTADOS go de edad fue de 26 a 49 años, con co del semen según lo descrito ante- una media de 36. riormente. Todas las muestras fueron Los resultados de la fragmentación procesadas por swim-up. del DNA de espermatozoides en las
  18. 18. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 18 A R T Í C U L O S Thamara Viloria et al. Aumento de la Fragmentacion del DNA... 18 muestras de los pacientes antes de ficativas. nificativamente luego del swim-upen ser procesadas por swim-up de acuer- los fumadores moderados y muy fuma- do al número de cigarrillos fumados De igual forma, en los porcentajes de dores (Phb=0,001 y Pic<0.001 respec- por los varones, no revelaron diferen- CSH y CD se observó que los daños en tivamente) en comparación con aque- cias significativas entre los 3 grupos el DNA de los espermatozoides de los llos hombres sin este hábito, lo que in- estudiados dependiendo de la canti- fumadores moderados estaban incre- dica una positiva selección de esper- dad de cigarrillos por día. Hombres no mentados, pero las diferencias no re- matozoides con DNA fragmentado lue- fumadores, fumadores moderados y sultaron estadísticamente significativas. go de la capacitación en los hombres muy fumadores, tuvieron similar pa- fumadores. Particularmente en los trón de distribución entre las diferentes Posteriores comparaciones múltiples hombres muy fumadores este incre- categorías de acuerdo al tamaño del entre la fragmentación del DNA de las mento fue de más del 100%. halo luego de hacer el SCD, es decir, muestras de semen antes y después porcentajes de células con CHG, CHM, del swim-up de acuerdo al número de Incluso, en los hombres no fumado- CS, CHP, CSH y CD (Figura 1a y 2a). cigarrillos fumados (comparaciones en- res se observó una gran disminución de tre figuras 1a con 1b y 2a con 2b res- las CSH y CD (Pjk=0,007 y Plm=0,006 Las Figuras 1b y 2b, muestran los re- pectivamente), mostraron que en los respectivamente), lo cual supone una sultados de la fragmentación del DNA hombres muy fumadores hubo una dis- reducción de espermatozoides con de espermatozoides en las muestras minución significativa (aproximada- DNA fragmentado luego del swim-up luego de ser procesadas por swim-up mente del 50%: 72,8 IC 95% [23,8- en este grupo, sin embargo esta dis- de acuerdo al número de cigarrillos fu- 67,3] y 47,3 IC 95% [9,4-97,4]) de las minución no fue significativa. mados. CHG (Pde=0,020), luego del swim-up. Por tanto, estos hallazgos en las alí- Comparaciones entre esos grupos No se encontraron diferencias signifi- cuotas post swim-up sugieren que el muestran diferencias significativas en cativas en las CHM entre los grupos an- tes y después de la capacitación. tabaco altera selectivamente la habili- las CHP. Los porcentajes de CHP en los fumadores moderados se incrementa- También, en los hombres muy fumado- dad del proceso de selección espermá- ron respecto a aquellos que no fumaban res se encontró una disminución muy tica en los hombres fumadores. (15,0 IC 95% [6,4-46,0] y 12,2 IC 95% marcada en las CS (que son el total de [0,0-32,7]) (Pab=0,020), al igual que en las células no fragmentadas) luego del los hombres muy fumadores compara- swim-up (Pfg<0,001) (78,7 IC 95% do con el grupo de los no fumadores [44,4-95,3] y 60,0 IC 95% [15,4- (19,2 IC 95% [0,9-46,0] y 12,2 IC 95% 98,7]); adicionalmente, se observó un [0,0-32,7]) (Pac=0,013), demostrándo- incremento de este tipo de células es- se así un daño en la calidad del DNA permáticas (CS) en el grupo de hom- entre fumadores en general (modera- bres muy fumadores luego del procesa- dos y muy fumadores) y no fumadores. miento por swim-up, pero este no fue Además, los porcentajes de CHG y CS significativo. se vieron disminuidos en los dos grupos de hombres fumadores comparados Por otra parte, en el mismo gráfico se con aquellos que no fumaban, aunque puede observar, desde otro punto de estas diferencias no llegaron a ser signi- vista que, las CHP incrementaron sig- Figura 1 Resultados de la fragmentación del DNA en muestras de semen antes y después del swim-up de acuerdo a la cantidad de cigarrillos fumados.
  19. 19. ASEBIR:revista manolo junio06 08/02/10 16:49 Página 19 A R T Í C U L O S Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 19 Figura 2 Representación del total de células sanas (no fragmentadas) en muestras de semen antes y después del swim-up de acuerdo a la cantidad de cigarrillos fumados. DISCUSIÓN Aunque muchos trabajos sugieren Sergerie et al. (2005), describieron la no los mejores espermatozoides (mejor que existen agentes físicos y químicos asociación entre tabaco y fragmenta- movilidad y morfología), imitando así en el ambiente, muchos de ellos han ción de DNA espermático en muestras los procesos que ocurren en el tracto sido introducidos y propagados por la de semen en fresco de hombres sanos reproductor femenino en condiciones actividad humana, pudiendo afectar (no infértiles); y Saleh et al. (2002), es- naturales. Muratori et al., (2000) des- la fertilidad masculina (Oliva et al., tudiaron esta asociación en hombres in- cribieron que hasta cierto punto la 2001), sin embargo, el impacto del fértiles y reportaron que las diferencias fragmentación del DNA estaba positi- consumo de tabaco en la fertilidad entre fumadores y no fumadores no era vamente relacionada con una morfo- masculina resulta un tema controver- estadísticamente significativa. logía anormal en el espermatozoide y tido (Vine et al., 1996). asociada con defectos en la cola; No obstante, encontraron que las pero encontraron una correlación ne- Los resultados de este estudio sos- muestras de semen de los hombres gativa entre DNA roto y movilidad tienen que: (i) no hay diferencias en infértiles fumadores tenían altos nive- progresiva. la fragmentación del DNA de los es- les de estrés oxidativo (OS) que en los permatozoides en las muestras de se- no fumadores. Esto fortalece los re- Basándonos en trabajos previos, men en fresco a pesar de los hábitos ta- sultados del presente trabajo y refuer- donde se encontró que las tasas de báquicos; y (ii) hay un incremento sig- za la hipótesis que el efecto ejercido por fecundación y algunos indicadores de nificativo en la incidencia de células es- algunos factores perjudiciales, que calidad embrionaria estaban relacio- permáticas con las hebras de DNA ro- afectan los gametos masculinos, podrí- nados con el alcance de la fragmenta- tas en los hombres fumadores luego de an estar encubiertos en el eyaculado, ción del DNA espermático post swim- evaluar las muestras procesadas por siendo los mismos apreciables solo en up (Muriel et al., 2006); éstos en con- swim-up. la selección de espermatozoides por junto con los resultados del actual es- swim-up. tudio, se puede concluir que la vía Primero se realizó la prueba de SCD para determinar la fragmentación del en las muestras de semen en fresco y Se debe recalcar que las muestras DNA parece evidente que debería ser el resultado de la fragmentación del empleadas en cualquier TRA están evaluando las alícuotas tras el proce- DNA en los 3 grupos de hombres es- previamente procesada en el labora- samiento por swim-up. tudiados, de acuerdo al consumo de torio con la finalidad de eliminar las Con el fin de perfeccionar estos ha- cigarrillos por día, fue comparable. células no espermáticas y seleccionar llazgos, se hicieron comparaciones

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