ARQUITECTURA SUBCELULAR DEL GRUPO I DE
RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO EN LAS
SINAPSIS DE LAS FIBRAS MUSGOSAS DEL H...
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
GLUTAMATO COMO NEUROTRANSMISORGLUTAMATO COMO NEUROTRANSMISOR
Principal neurotransmisor excitador del sistema nervioso
cent...
Despolarización de la
membrana plasmática
Canal iónico central
RECEPTORES IONOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (iGluRs)RECEPTORES ION...
Clase C de la superfamilia de receptores
acoplados a proteínas G (GPCRs)
1 única cadena peptídica
dominio N-terminal (ext)...
RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs)RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs)
INTRODUCCIÓN
GRUPO I
· mGlu...
RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs)RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs)
INTRODUCCIÓN
RESPONSABLE DE LA DIMERIZACIÓN
DE LOS mGluRs
RESPONSABLE DE LA DIMERIZACIÓN
DE LOS mGluRs
2 lóbulos enfrentados
Cierre tra...
DOMINIO TRANSMEMBRANA
DOMINIO C-Terminal
Región desestructurada
Longitud variable
Splicing / modificaciones
postraducciona...
IP3
DAG
CANAL K+CANAL K+
PLC
PKC
Ca2+Ca2+
mGluRs GRUPO I. MECANISMO DE TRANSDUCCIÓNmGluRs GRUPO I. MECANISMO DE TRANSDUCCI...
DISTRIBUCIÓN mGluRsDISTRIBUCIÓN mGluRs
mGluR1
mGluR5
mGluR2
mGluR3
mGluR3
mGluR4
mGluR7
mGluR8
GRUPO IGRUPO I
GRUPO IIIGRU...
HIPOTÁLAMO
HIPOCAMPO, TÁLAMO,
SUSTANCIA NEGRA, GLOBO
PÁLIDO, CEREBELO Y BULBO
OLFATORIO
HIPOCAMPO, TÁLAMO,
SUSTANCIA NEGRA...
IMPLICACIONES DE LOS mGluRsIMPLICACIONES DE LOS mGluRs
INTRODUCCIÓN
Mutaciones de mGluR1 y Ataxia Cerebelosa
mGluR1 implic...
Estructura del
sistema límbico
LA FORMACIÓN HIPOCAMPALLA FORMACIÓN HIPOCAMPAL
INTRODUCCIÓN
Progresión unidireccional
de la...
EL CIRCUITO TRISINÁPTICO EXCITADOREL CIRCUITO TRISINÁPTICO EXCITADOR
INTRODUCCIÓN
VÍA PERFORANTE
FIBRAS MUSGOSAS
COLATERAL...
CORTEZA
ENTORRINAL GIRO
DENTADO CA3 CA1
SUBÍCULO
AFERENCIA
SENSORIAL
TÁLAMO
ANTERIOR
POSTSUBÍCULO
Conexiones retrógradas d...
FASCIA DENTADA
Formación de la memoria
episódica
Patrón de separación
Formado por tres estratos
Formación de la memoria
ep...
FIBRAS MUSGOSASFIBRAS MUSGOSAS
INTRODUCCIÓN
Axones de células granulares del
giro dentado, no mielinizados
establecen cont...
Estructura laminar dividida
en tres regiones
CA1 CA2 CA3
sin diferencia
celular clara
Sinapsis FM sólo en estrato
lúcido d...
ANTECEDENTES: DISTRIBUCION mGluRs EN CA3ANTECEDENTES: DISTRIBUCION mGluRs EN CA3
INTRODUCCIÓN
mGluR1b
mGluR1a
Ferraguti y ...
HIPÓTESIS DE TRABAJOHIPÓTESIS DE TRABAJO
mGluR1 y mGluR5 como elementos
postsinápticos en sinapsis FM-CA3
¿Co-localización...
OBJETIVOSOBJETIVOS
1. Analizar la co-localización subcelular de mGluR1a y mGluR5 en las sinapsis de las fibras
musgosas con las neuronas pira...
MATERIALES Y
MÉTODOS
MATERIALES Y
MÉTODOS
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓNANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
RATAS SPRAGUE DAWLEY
mGluR1a/b – mGluR5 - WT
P...
1. Anestesia
2. Perfusión
transcardíaca
3- Preparación
de bloques de
lowicryl
5- Inmunocitoquímica
post-inclusión
4- Secci...
Anticuerpo
secundario
Anticuerpo
primario
Nanopartícula de oro
Antígeno
mGluR
INMUNOCITOQUÍMICA POST-INCLUSIÓN PARA
MICROS...
Anticuerpo
secundario
Anticuerpo
primario
Oro 10 nm
Anticuerpo
secundario
Anticuerpo
primario
Antígeno
Antígeno
Oro 20 nm
...
TÉCNICAS INMUNOCITOQUÍMICASTÉCNICAS INMUNOCITOQUÍMICAS
VENTAJAS
INCONVENIENTES
PREINCLUSIÓN
- Mayor sensibilidad
- Correla...
ANTICUERPOS UTILIZADOSANTICUERPOS UTILIZADOS
ANTICUERPO REFERENCIA ESPECIE CONCENTRACIÓN
mGluR1a
Frontier Science Co. Ltd
...
RESULTADOSRESULTADOS
mGluR1a y mGluR5
EN SECCIONES CONSECUTIVAS
mGluR1a y mGluR5
EN SECCIONES CONSECUTIVAS
mGluR1a (10nm)
mGluR5 (20nm)
mGluR1a (10nm)
mGluR5 (20nm)
mGluR1a (10nm)
mGluR5 (20nm)
mGluR1a (10nm)
mGluR5 (20nm)
mGluR1b (10nm)
mGluR5 (20nm)
mGluR1b (10nm)
mGluR5 (20nm)
mGluR1b (10nm)
mGluR5 (20nm)
mGluR1b (10nm)
mGluR5 (20nm)
DISCUSIÓNDISCUSIÓN
Mateos y cols., 2000
Preinclusión para ME
DISCUSIÓN
SINAPSIS FIBRAS PARALELAS-CÉLULAS DE PURKINJE vs. FM-CA3SINAPSIS FIBRA...
DISCUSIÓN
mGluR1b
mGluR1a
Ferraguti y cols., 1998
Microscopía de Luz
Anti-pan-mGluR1
anti-mGluR1a/anti-mGluR1b
mGluR5mGluR...
Hunt y cols., 2013
DISCUSIÓN
PLASTICIDAD BIDIRECCIONAL MEDIADA POR NMDARs Y mGluRsPLASTICIDAD BIDIRECCIONAL MEDIADA POR NM...
DISCUSIÓN
ESPINA DENDRÍTICA
POSTSINÁPTICA
E
E
E
Ca2+
Ca2+
Ca2+
E
E
EE
E
E
EE
LTPLTP
mGluR5
mGluR1
NMDARs
DAG
IP3
TERMINAL ...
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
1. Las isoformas mGluR1a y mGluR1b del receptor metabotrópico 1 de glutamato, al
igual que mGluR5...
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
5. Los subtipos mGluR1b y mGluR5 co-localizan en ~37% de las excrecencias dendríticas
de las neur...
MUCHAS GRACIAS POR
SU ATENCIÓN
Próxima SlideShare
Cargando en…5
×

presentacion_Tesis_definitiva

617 visualizaciones

Publicado el

0 comentarios
0 recomendaciones
Estadísticas
Notas
  • Sé el primero en comentar

  • Sé el primero en recomendar esto

Sin descargas
Visualizaciones
Visualizaciones totales
617
En SlideShare
0
De insertados
0
Número de insertados
9
Acciones
Compartido
0
Descargas
12
Comentarios
0
Recomendaciones
0
Insertados 0
No insertados

No hay notas en la diapositiva.
  • El glutamato es el principal NT del SNC de mamíferos, y ejerce su acción excitadora mediante su liberación ,previa fusión de las vesículas donde se acumula en la preterminal sináptica, con la membrana plasmática, a la hendidura sinaptica, tras la llegada de un potencial de acción a la terminal sinaptica, y su unión a receptores específicos, tanto pre como postsinapticos, lo que conlleva la apertura de canales ionicos y la propagacion del PA, con la consigunete propagacion del impulso nervioso
  • El glutamato ejerce su funcion excitadora en la neurona postsinaptica a través de receptores altamente específicos, de dos tipos, los iGluRs y los mGluRs, cuya acción se complementa para un ajuste preciso de la respuesta nerviosa. Los iGluRs son un grupo de receptores, clasificados en función de (…), en cuatro familias, siendo todos ellos (HOMO y HETERO?) tetrámeros funcionales (aunque recientemente se esta empezando a describir alguna estructura pentamérica). Básicamente constan de 3 dominios: una región amino terminal extracelular (con el ATD, amino terminal domain, responsable de la oligomerización para alcanzar la forma activa, y conservado en los iGluRs, con posible funcion reguladora, y el LBD, conservado), la región transmembrana, formada por tres segmentos transmembrana y un segmento en cis, que forma el canal iónico central en su forma activa (oligomerica), y la region carboxilo terminal, de longitud y secuencia variable, y que interacciona con diversas proteinas celulares. La union del agonista provoca un cambio conformacional que resulta en la apertura de la región membranosa en forma de canal iónico, lo que provoca la despolarización de la membrana y la transmisión del PA. Esta respuesta a la union del glutamato ocurre en un breve lapso de tiempo, por lo que este tipo de receptores median la transmision rápida del impulso nervioso.
    PREOTEINS TRUNCADAS SOLO CON EL ATD PUEDEN FORMAR DIMEROS ESTABLES EN SOLUCION. EL LBD ESTA MUY CONSERVADO ENTRE LOS RECEPTORES DE GLU. EL ATD PODRIA TENER UN PAPEL REGULADOR, NO ESENCIAL, QUE QUE PROT TRUNCADAS SIN ATD FUNCVIONAN COMO LAS WT
    comentar que los receptores delta no unen glutamato pero diversos estudios indican que son importantes en el mantenimiento de las sinapsis
  • Los receptores metabotrópicos de glutamato, cuya disposición en la sinapsis de las FM del GD con las cels piramidales de CA3, en el estrato lucido hipocampal es el objeto de esta Tesis Doctoral, pertenecen a la clase C (o III) de GPCR (receptores acoplados a proteínas G). Se trata de homo o heterodimeros, cuya unidad estructural básica esta formada por una única cadena polipeptidica, con tres dominios diferenciados: el dominio amino terminal, extracelular, que constituye el Venus Flytrap Domain, donde tiene lugar la union del agonista (Glu), y que esta formado por dos lobulos enfrentados, y que es ademas responsable de la dimerizacion de los mGluRs mediante interacciones electrostaticas y puentes disulfuro a traves de cisteinas conservadas, como veremos posteriormente con mas detalle, el dominio membranoso, formada por 7 segmentos transmembrana, unidos por bucles extra e intracelulares, y que es donde se da la modulación alostérica de los mGluRs, y el dominio carboxilo terminal, intracelular, responsable de la transduccion de la señal del receptor mediante su interacción con proteínas G, así como de su union a otros tipos de proteinas celulares, que su actividad.
  • Se clasifican en tres familias en funcion de su mecanismo de transducción, su grado de homologia y su perfil farmacológico. Los mGluRs 1 y 5, objeto de esta Tesis Doctoral, pertenecen al grupo I, caracterizado por compartir un mecanismo de transducción que implica la apertura de canales de Ca a traves de la produccion de IP3 y DAG como segundos mensajeros, lo que favorece el estado hiperpolarizado de la membrana al bloquear los canales de potasio, propagando el PA, y por su localización postsináptica, y como veremos posteriormente, eminentemente perisinpatica, rodeando las especializaciones sinápticas.
    Como he mencionado, los mGluRs 1 y 5 pertenecen al grupo I de mGluRs. Los grupos II y III comparten ruta de transduccion, encaminada a la reducción de los niveles de AMPc mediante la inhibición de la adenilato ciclasa, lo que conlleva una reducción de la liberación de glutamato. Además tienen un papel neuroprotector debido a su papel como autorreceptores, captando el exceso de glutamato de la hendidura sináptica, y bloqueando los canales de calcio, reduciendo de igual manera la liberación de glutamato, evitando así el efecto neurotoxico que puede tener un exceso de glutamato.
  • En la presente diapositiva presento la estructura tridimensional de el dominio amino terminal de un mGluR 1, complejado con glutamato, en la que se puede apreciar la alternancia de helices alfa (coloreadas en azul) con laminas beta (coloreadas de violeta). El glutamato queda unido a la parte central del dominio, mediante interacciones especificas conservadas con ciertos aminoacidos. La unión del glutamato provoca que el dominio extracelular se pliegue sobre si mismo a modo de bisagra, como la planta atrapamoscas a la que debe su nombre, trasladando dicho cambio conformacional, en ultima intsancia, a la region carboxilo terminal.
  • A continuación voy a detallar detalles estructurales de las mGluRs con mayor precisión. Como ya hemos mencionado, la union de al menos una molécula de Glu en uno de los VFD que conforman el dimero funcional en los mGluRs provoca el plegamiento de un lobulo sobre el otro. Este cambio conformacional se transmite, via dominios ricos en cisteina del VFD (porque al contactar en estas zonas con el otro monomero el cambio conformacinal se contagia) a traves de la region transmembrana, a la region carboxilo terminal.
    El VFD de los mGluRs es el responsable de la dimerización de los receptores para alcanzar su estado activo. Formas truncadas del receptor formadas unicamente por el dominio amino terminal son capaces de dimerizar. Esta dimerización se lleva a cabo a traves de puentes disulfuro y de interacciones hidrofóbicas. En el mGluR5, son las cisteinas 57 y 99 las que estan implicadas en el establecimiento de puentes disufluro intramoleculares, que manietienen la estructura del receptor, pero que no intervienen en la dimerizacion, mientras que la Cys 129 forma puentes disulfuro intermoleculares. Su deleción o mutacion no implica la perdida de la dimerizacion, ya que esta se mantiene adicionalmente por interacciones hidrofobicas entre los dominios extracelulares. Sin embargo, el tratamiento con DTT asi como la delecion o mutación de esta region rica en cisteinas provoca la formacion de mGluRs laxos, cuya funcionalidad depende de la capacidad de dimerizar gracias a las interacciones hidrofóbicas.
    De forma paralela, en mGluR1 las cisteinas implicadas en estos procesos son las C67 y 109, y la 140 para los enlaces intermoleculares.
    En la imagen, presento la formacion de puentes disulfuro intramoleculares en el mGluR1. Cabe destacar que la distancia entre las cadenas laterales estos resíduos están en el entrono de 2 angstroms, distancia que permite tal interacción.
  • En cuanto a la region transmembrana, como hemos visto antes, consta de 7 segmentos, con baja homología respecto a otros miembros de las GPCRs, y unidos a traves de bucles extracelulares e intracelulares. Es precisamente el bucle i2 (entre los segmentos III y IV) el que regula la especificidad de unión a las proteinas G, a diferencia del resto de GPCRs, en los cuales es el bucle i3. Estructuralmente es una región no del todo conocida, sobre todo a nivel de dímero. Sin embargo, sabemos que es A TRAVES DEL DOMINIO 7TM donde SE MODULA LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR MEDIANTE la unión con MAP Y MAN: Se ha visto que en receptores truncados formados unicamente por la region 7TM, la unión de MAP es capaz de desencadenar la activacion de la ruta de transduccion encaminada a producir PLC, mientras que en el receptor salvaje solo intensifica la acción del glutamato. Así, esta región es la responsable de transmitir el cambio conformacional tras la unión del glutamato a la región c-terminal. EL ESTADO INACTIVO SE ESTABILIZA CON ANTAGONISTAS, Y EL ACTIVADO, CON AGONISTAS
    Finalmente, LA REGION C TERM, muy variable en cuanto a longitud y secuencia debido a modificaciones post-traduccionales y splicing alternativo en la síntesis del receptor, interacciona con proteínas G desencadenando la respuesta celular a la unión del glutamato. Esta región esta típicamente desestruturada en estado inactivo, lo que le permite una mayor flexibilidad a la hora de interaccionar con las proteínas celulares. Además de las proteínas G, interacciona con diversas proteinas, COMO QUINASAS Y FOSFATASAs, que regulan su actividad, y con proteinas de ensamblaje, como la proteina Homer, que presento en la siguiente imagen, a la que se unen mediante una secuencia rica en prolina del C-terminal, y que regulan la actividad de mGluR1 y 5 modulando su union a MAP quinasas, o regulando sus canales iónicos asociados.
  • Presentamos un mecanismo de transduccion propuesto para los mGluRs del grupo I. En ellos, la proteina G heterotrimérica (del tipo Gq/G11), asociadas (no unidas) a la membrana, y en forma inactiva, une GDP. Cuando el glutamato se une al VFD, este sufre un cambio conformacinal que se transmite , via dominios ricos en cisteina (por aquello de la dimerización), a traves del dominio transmembrana, al domini C-terminal, el cual, flexible, desestructurado, contacta con ella proteina G la cual se activa, y cambia el gdp por GTP mediante las proteinas GEF (guanine factor exchange). En ese momento, la sububidad alfa une el GTP y se disociaq de beta y gamma
  • En cuanto a la localización de los receptores, los mGluRs se expresan preferentemente, pero no de manera exclusiva, en células nerviosas, ya que podemos encontrarlos en otros tipos celulares como hepatocitos u osteoblastos. Los mGluRs del grupo I se expresan preferentemente en cels nerviosas, estando el mGluR1 restringido a posiciones sinapticas, mientras que el mGluR5 puede encontrarse tambien en células de la glia. Dentro de las celulas nerviosas, ambos son exclusivamente postsinpaticos, y como hemos comentado anteriormente, eminentemente, aunque no exclusivamente, perisinapticos. Tambien pueden expresarse en otros tejidos: mGluR1 se expresa en osteoblastos, timocitos y cels de testiculo de rata, mientras que mGluR5 , lo hace en ademas en hepatocitos, celulas pancreaticas y melanocitos. mGluR1a se expresa a altos niveles en melanocitos procedentes de biopsias de melanoma, mientras que no se expresa en melanocitos sanos.
    Los mGluR del grupo II, de forma general, son tanto pre como postsinpaticos, aunque en el hipocampo presentan una diferenciacion respecto a otras areas cerebrales, ya que mGluR2 es presinaptico, y mGluR3, postsinaptico. Adicionalmente, mGluR3 tambien puede encontrarse en las celulas gliales. Finalmente, los mGluRs del grupo III son presinpaticos, con la excepcion del mGluR6, que unicamente se expresa en las células bipolares de la retina.
  • En la siguiente imagen presento la localizacion de los mGluRs del grupo I en el cerebro de rata. mGluR1 se encuentran principalmente en hipocampo, talamo, sustancia negra, globo palido, cerebelo y bulbo olfatorio, mientras que mGluR5 se localiza en el hipocampo, el bulbo olfatorio y el cortex. Por otra parte, las variantes de mGluR generadas por splicing alternativo (mGluR1a y b) presentan diferencias en su lugar de expresión. mGluR1a se expresa en las celulas de purkinje, interneuronas hipocampales y neruronas talamicas, y estando la expresion de mGluR1b localizada en las celulas piramidales de CA3, celulas granulares del giro dentado e hipotálamo. Esta diferente expresión de las variantes generadas por splicing alternativo no se da en mGluR5, donde mGluR5a y b tienen un patrón de expresión similar, apareciendo en las células piramidales y granulares del hipocampo.
  • La amplia distribucion a traves del SNC de los mGluRs implica su contribución a diversos procesos. Como podemos observar en una seleccion de articulos publicados recientemente, son varios los procesos en los cuales los mGluRS del grupo I estan involucrados, muchos de ellos relacionados con la plasticidad sinaptica subyacente a los procesos de formacion de la memoria, y el aprendizaje. Incluso los ratones knock out para los mGluRs 1 y 5 muestran un modelo de comprtamiento relacionado con la esquizofrenia.
    Por otro lado, los mGluRs de los grupos II y III, ademas de regular la trasmision nerviosa, estan implicados en procesos como la regulacion metabolica y la transcripcion genica, y estan implicados en el desarrollo de patologías como la ansiedad y la depresión.
  • La formación hipocampal es una estructura del sistema limbico constituida por 6 regiones citoarquitectónicamente diferenciadas, agrupadas bajo un denominador común debido a la unidireccionalidad de las conexiones, como veremos próximamente. Las estructuras que constituyen dicha formación son el giro dentado, la corteza entorrinal, el hipocampo, el subiculo, parasubículo y presubículo.
  • Una caracteristica clave para definir la formacion hipocampal es la progresión unidireccional de la activación sináptica. Asi, el circuito trinináptico describe una ruta unidireccional y transversal respecto al eje mayor del hipocampo, que conecta todas las regiones de la formacion hipocampal secuencialmente. Asi, los estíumulos recogidos y canalizados en otras areas corticales, llegan a la corteza entorrinal, la cual a través de la via perforante, proyecta a las células granulares del giro dentado. A continuación, las células granulares del giro dentado proyectan, a traves de las fibras musgosas, hasta las dendritas proximales de las células piramidales de la region CA3 hipocampal. Estas células piramidales proyectan a su vez, a traves de las colaterales de Schaffer, a neuronas de la region CA1 del hipocampo. Finalmente, el campo CA1 se proyecta sobre el complejo subicular, el cual, para completar el circuito, se proyecta sobre la corteza entorrinal.
    A pesar de que en principio no hay conexiones de retroalimentacion, todas las regiones de la formacion hipocampal tienen proyecciones extrinsecas, excepto el giro dentado.
    EL CE RECOPILA INFORMACION DE DISTINTAS AREAS corticales Y LA ENVIA AL GD A TRAVES DE LA VP Y AL HIPOCAMPO (VIA ALVEOLAR)
  • Sin embargo, la unidireccionalidad no es definitiva dentro de la formacion hipocampal, y observamos que existen ciertas conexiones retrógradas (comentarlas): asi las celulas piramidales de CA3 conectan con el giro dentado, interneuronas de CA1 proyectan a CA3, y el subiculo a CA1. Ademas existen conexiones bidireccionales entre CE y subículo, y conexiones colaterales en CA3.
  • A continuación voy a dar algunos detalles de las subestructuras de la formación hipocampal relacionadas con la sinapsis de las FM-CA3, objeto de este trabajo de Tesis Doctoral. En primer lugar, el giro dentado, implicado en procesos como la formación de la memoria episódica y el patrón de separación (distinción entre sucesos similares), como ya hemos comentado anteriormente, recoge la información que la corteza entorrinal recopila de las distintas áreas corticales y que proyecta hacia esta estructura a través de la via perforante. Estructuralmente está constituído por tres capas, denominadas en función del tipo celular principal que la forman, siendo, de mas externa a mas interna, la capa molecular, la capa granular (que constiyuyen la fascia dentada) y la capa polimórfica o hilus.
    LA MAYOR PARTE DE Las CELS GRANULARES ESTAN EN ESTA CAPA (CAPA GRANULARES)
  • Cada cel granular origina un unico axon no mielinizado, , de 0,2 um de diametro y hasta 3 mm (si, 3 mm) de longitud. Este axin origina multiples coleteralizaciones que inervan las celulas de CA3 y las interneuronas de CA3 y del hilus. Tienen tres tipos de terminaciones, las terminales gigantes, las extensiones de filopodias, y las pequenas var5icosidades. Las terminales gigantes, con sinaptan con las FM, tienen hasta 35 lugares de liberacion de Glu.
  • El hipocampo, implicado en la formación de la memoria y la percepción espacial, presenta de la misma manera, una estructura trilaminar, con tres regiones definicas como CA (de cuerno de ammon) 1, 2 y 3. La separacion entre CA2 y 3 ha generado controversia, pero podemos establecer tal separación en base a dos criterios:
    Las cels piramidales de CA2 no presentan las excrecencias espinosas que presentan las dendritas de dichas celulas en CA3
    2. Las cels piramidales de CA2 no reciben sinapsis de las FM procedentes del GD
    Ademas, presentan diferente patron de expresion genica.
    Los estratos en los que se divide el hipocampo, definidos en funcion de sus tipos celulares principales, son, de mas interno a mas pegado a la fisura hipocampal (a mas externo), la capa de células piramidales, consituida por celuls piramidales fuertemente empaquetadas, cuyos arboles dendriticos basales forman en estrato oriens, y que esta recubierta por el alveus, una fina capa de fibras aferentes y eferentes mielinizadas. En la region CA3, recubriendo el estrato de celulas piramidales, encontramos una capa acelular, denominada estrato lucido, ocupado por las fibras musgosas que se originan en el giro dentado y que sinaptan con las celulas piramidales de CA3 (tambien ocupan esta capa las fibras de las colaterals de Schaffer). Cubriendo el estrato lucido, e inmediatamente por encima del estrato piramidal en las rgiones CA1 y 2, se encuentra el estrato radiado, donde se encuentran parte de las dendritas apicales de las celulas piramidales. Finalmente, limitando la fisura hipocampal y el giro dentado se localiza el estrao lacunoso molecular, donde se encuentran parte de las terminales axonicas de las celulas piramidales, y de celulas de la corteza entorrinal y talamo, y donde se establecen las sinapsis que conectan la corteza entrorrinal con la region CA1 hipocampal, y tambien alberga fibras procedentes del talamo Este estrato es de relevancia en ciertos desordenes nerológicos, como la enfermedad de Alzheimer, ya que las neuronas de la corteza entorrinal que conectan con la region CA1 son las primeras en degenerarse en este enfermedad.
    LAS NEURONAS QUE CONECTAN LA CE CON CA1 SON LAS PRIMERAS EN DEGENERARSE EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
    ALVEUS: FINA CAPA DE FIBRAS AFERENTES Y EFERENTES MIELINIZADAS
    ESTRATO ORIENS: DENDRITAS BASALES DE LAS CELULAS PURAMIDALES DEL ESTRATO PIRAMIDAL
    ESTRATO LUCIDO: EN LA REGION CA3, POR ENCIMA DE LAS CELULAS PIRAMIDALES, SE LOCALIZA ESTA CAPA ACELULAR DONDE TERMINAN LAS FM Y COMIENZAN LAS COLATERALES DE SCHAFFER
  • En base a estos antecedentes, y teniendo en cuenta que las caracteristicas fisiologicas y anatómicas de las fibras musgosas (comentarlas) les permiten actuar como una siunapsis detonante, de alta eficiencia, es decir, con capacidad de activar fuertemente la region CA3 con pequeños incrementos en la frecuencia presinaptica de disparo), y conociendo el diferente papel que juegan los mGluRs del grupo I en la induccion de la LTP y LTD postsinaptica (mGluR5 clave en la LTP, y mGluR1 clave en la LTD), nos planteamos determinar si ambos tipos de receptores son expresados simultáneamente en la misma sinapsis que establecen las fibras musgosas con las celulas piramidales en la region CA3 hipocampal, asi como determinar si una posible diferencia en su topología podria ser la base del papel selectivo que juegan estos receptores en el contro de la potenciacoin y depresion a largo plazo.
    Implicaciones funcionales. Puede una distinta topologia celular de los mGluR1 y 5 contribuir al `papel distinto que tienen los receptores en la activacion de la Ltd. Y LTP?veremos que no, no hay distinta topologia, luego ha de haber algun otro tipo de mecanismo, por ejemplo, que el ca del re que libera mGluR5 inhiba la ruta desencadenada por mGluR1 produciendo una LTP.
  • En base a estos antecedentes, y teniendo en cuenta que las caracteristicas fisiologicas y anatómicas de las fibras musgosas (comentarlas) les permiten actuar como una siunapsis detonante, de alta eficiencia, es decir, con capacidad de activar fuertemente la region CA3 con pequeños incrementos en la frecuencia presinaptica de disparo), y conociendo el diferente papel que juegan los mGluRs del grupo I en la induccion de la LTP y LTD postsinaptica (mGluR5 clave en la LTP, y mGluR1 clave en la LTD), nos planteamos determinar si ambos tipos de receptores son expresados simultáneamente en la misma sinapsis que establecen las fibras musgosas con las celulas piramidales en la region CA3 hipocampal, asi como determinar si una posible diferencia en su topología podria ser la base del papel selectivo que juegan estos receptores en el contro de la potenciacoin y depresion a largo plazo.
    Implicaciones funcionales. Puede una distinta topologia celular de los mGluR1 y 5 contribuir al `papel distinto que tienen los receptores en la activacion de la Ltd. Y LTP?veremos que no, no hay distinta topologia, luego ha de haber algun otro tipo de mecanismo, por ejemplo, que el ca del re que libera mGluR5 inhiba la ruta desencadenada por mGluR1 produciendo una LTP.
  • Por lo tanto, en este trabajo de Tesis Doctoral nos planteamos los siguientes objetivos
  • En este trabajo de Tesis Doctoral hemos utilizado 3 lotes de 5 ratas de la raza Sprague Dawley como animales de experimentación, salvajes, con un patrón normal de expresión de los mGluRs del grupo I. Las normativa utilizada para el cuidado y uso de los animales de experimentacion ha sido aprobada por el Comité de Etica y Bienestar Animal de la UPV.
    Con el fin de determinar la colocalizacion en la sinapsis de las FM-CA3 en el hipocampo, hemos utilizado 5 lotes de 3 ratas adultas, cantidad suficiente para obtener un alto numero de muestras que nos den resultados significativos, cumpliendo de esta manera con las directrices de la Union Europea, fomentando la cultura de las 3 erres (reduccion, refinamiento y reemplazo).
  • Dres. Danbolt y Lehre del instituto de ciencias medicas basicas de la universidad de oslo
  • En este trabajo hemos utilizado la tecnica de inmuno oro post inclusion para microscopia electronica. Esta tecnica inmunocitoquímica, como el resto, tiene como objetivo de las tecnicas inmunocitoquimicas es la determinación de la cantidad y localización de estructuras moleculares en los tejidos, basándose en las reacciones antigeno anticuerpo. En la técnica de inmuno oro post inclusión, al contrario de la técnica preinclusion, las muestras son primero fijadas, incluidas en bloques de resina o lowicryl, y posteriormente inmunomarcadas. El uso de las tecnicas de postinclusion presenta ventajas, como la ausencia de difusion de los inmunoagentes en el tejido, y que todos los antigenos tienen la misma probabilidad de ser inmunomarcados, con la posibilidad de realizar varios marcajes simultaneoas y y realizar analisis cuantitativos
    En primer lugar, como estudio preliminar, realizamos un marcaje simple en secciones consecutivas de tejido, de los mGluR1a, mGliuR1b y mGluR5. Para tal fin, incubamos la muestra con un anticuerpo primario sintetizado frente a la proteína que se quiere detectar. En este caso hemos utilizado anticuerpos anti mGluR1a, anti mGluR1b y anti mGluR5, todos ellos producidos en conejo. Sobre este anticuerpo se aplica un anticuerpo secundario, producido frente al animal en el que se ha producido el anticuerpo primario (por tanto, anti conejo), y que reconoce la fracción constante de los anticuerpos primarios, a los que se une. El anticuerpo secundario esta conjugado a una partícula de oro, de 10 nm de diámetro, fácilmente contrastable al microscopio electrónico, y que nos revelará la posición del anticuerpo, y por tanto, del antígeno, en este caso, los mGluRs, asi como permitirá una análisis semicuantitativo de la presencia de estos receptores, debido a la relación lineal existente entre el numero de partículas de oro observadas y el numero de antígenos.
    Finalmente,mencionar que en nuestro caso esta tecnica ha tenido una extraordinaria resolucion y nos ha permitido localizar los epitopos con una precisin definida por el tamaño de los anticuerpos y sus particulas de oro coloidal conjugadas. Teniendo en cuenta el tamaño de los anticuerpos (8 nm, 4 para la fraccion Fab del anticuerpo secundario) y el radio de las inmuparticulas, esta resolucion sera de de 17 nm para la localizacion de mGluR1a, b y mGluR5 y 26 nm para mGluR5, lo que es fundamental a la hora de interpretar la localizacion de estos receptores, ya que por efectos como el propio relieve de la muestra, la orientacion del corte, su grosos…podemos observar inmunoparticulas en regiones donde en principio no deberian estar, como la hendidura sinaptica. Para hacernos una idea de la alta resolucion de esta tecncia,comentar que el area media de una densidad sinaptica es de 1740 nm cuadrados aprox.
  • A continuación, y con el fin de determinar la colocalización de los mGluRs1a-mGluR5 y mGluR1b-mGluR5 en la misma sinapsis, realizamos un marcaje doble, basándonos en el mismo principio de reacción antígeno anticuerpo presentado en la diapositiva anterior, pero que requiere alguna especificidad como veremos a continuación.
    Para ello, utilizamos anticuerpos primarios anti mGluR1a y b (producidos en conejo), mientras que usamos anticuerpo anti mGluR5 producido en cobaya. Esto se debe a que el anticuerpo secundario reconocería igualmente la fracción constante del anticuerpo primario, y por eso utilizaremos también un anticuerpo secundario anticobaya para determinar la localización del mGluR5. Además, el anticuerpo anticobaya esta conjugado con una nano partícula de oro coloidal de 20 nm de diámetro, lo que permite diferenciar claramente al microscopio electrónico del anticuerpo conjugado a una partícula de 10 nm (que localizara los mGluR1). Asi, el uso de anticuerpos secundarios conjugados con partículas de diversos tamaños permite la localización simultánea de varios antígenos.
  • En esta diapositiva quiero mostrar las ventajas que nos aporta la utilización de la técnica de inmuno oro postinclusion para microscopia electrónica, fundamentalmente realizar análisis cuantitativos, y la posibilidad de realizar múltiples marcajes en una misma muestra
    El objetivo de las tecnicas inmunocitoquimicas es la determinación de la cantidad y localización de estructuras moleculares en los tejidos, basándose en las reacciones antigeno anticuerpo. En la técnica de inmuno oro post inclusión, al contrario de la técnica preinclusion, las muestras son primero fijadas, incluidas en bloques de resina o lowicryl, y posteriormente inmunomarcadas. El uso de las tecnicas de postinclusion presenta ventajas, como la ausencia de difusion de los inmunoagentes en el tejido, y que todos los antigenos tienen la misma probabilidad de ser inmunomarcados, con la posibilidad de realizar varios marcajes simultaneoas y y realizar analisis cuantitativos
    En primer lugar, como estudio preliminar, realizamos un marcaje simple en secciones consecutivas de tejido, de los mGluR1a, mGliuR1b y mGluR5. Para tal fin, incubamos la muestra con un anticuerpo primario sintetizado frente a la proteína que se quiere detectar. En este caso hemos utilizado anticuerpos anti mGluR1a, anti mGluR1b y anti mGluR5, todos ellos producidos en conejo. Sobre este anticuerpo se aplica un anticuerpo secundario, producido frente al animal en el que se ha producido el anticuerpo primario (por tanto, anti conejo), y que reconoce la fracción constante de los anticuerpos primarios, a los que se une. El anticuerpo secundario esta conjugado a una partícula de oro, de 10 nm de diámetro, fácilmente contrastable al microscopio electrónico, y que nos revelará la posición del anticuerpo, y por tanto, del antígeno, en este caso, los mGluRs, asi como permitirá una análisis semicuantitativo de la presencia de estos receptores, debido a la relación lineal existente entre el numero de partículas de oro observadas y el numero de antígenos.
    Finalmente,mencionar que en nuestro caso esta tecnica ha tenido una extraordinaria resolucion y nos ha permitido localizar los epitopos con una precisin definida por el tamaño de los anticuerpos y sus particulas de oro coloidal conjugadas. Teniendo en cuenta el tamaño de los anticuerpos (8 nm, 4 para la fraccion Fab del anticuerpo secundario) y el radio de las inmuparticulas, esta resolucion sera de de 17 nm para la localizacion de mGluR1a, b y mGluR5 y 26 nm para mGluR5, lo que es fundamental a la hora de interpretar la localizacion de estos receptores, ya que por efectos como el propio relieve de la muestra, la orientacion del corte, su grosos…podemos observar inmunoparticulas en regiones donde en principio no deberian estar, como la hendidura sinaptica. Para hacernos una idea de la alta resolucion de esta tecncia,comentar que el area media de una densidad sinaptica es de 1740 nm cuadrados aprox.
  • En esta diapositiva presento los anticuerpos primarios y secundarios utilizados en este trabajo de Tesis Doctoral. Como podemos observar, los anticuerpos primarios reconocen una pequeña fracción del segmento C-terminal, inracelular de los mGluRs.
    A su vez, como hemos comentado anteriormente, los anticuerpos secundarios son producidos para reconocer la fraccion constante del anticuerpo primario del animal en el que ha sido sintetizado (el primario). Para reconocer a los mGluR1, utilizamos la fraccion F(ab)2 de la IgG, mienras que para reconocer a los mGluR5, usamos la IgG completa.
    Comentar algo de la resolucion de la técnica al decir que se reconcoe la fraccion intracelular
  • A continuacion voy a mostrar los resultados que hemos obtenido en este trabajo de Tesis Doctoral
  • En primer lugar, en esta diapositiva presento dos imágenes de tinciones simples en secciones consecutivas del estrato lucido de la region CA3 hipocampal. Como ya he mencionado anteriormente, en este estudio, como aproximación preliminar, analizamos la localizacion ulraestructural de los receptores metabotrópicos mGluR1a y mGluR5 mediante el método simple de inmuno oro post inclusion para microscopia electronica inmunomarcado simple de los receptores, por separado, en secciones consecutivas de tejido. Las fibras musgosas, facilmente reconocibles por su altísimo contenido en vesiculas (de neurotransmisor) contactan con la misma espona dendritica en ambas imágenes. En ambos casos observamos como las particulas de oro se distribuyen a nivel postsináptico, en la membrana de las espinas dendriticas donde sinaptan las FM. En concreto, en la espina inferior, ambos subtipos de receptor aparecen en la misma excrecencia dendrítica.
  • Una vez demostrada la expresion de ambos tipos de receptores (mGluR1a y mGluR5 en secciones consecutivas), el siguiente paso es estudiar la colocalizacion de ambos tipos de receptores en la misma sinapsis de una seccion del CA3 hipocampal. Para ello utilizamos la tecnica del doble marcado de inmuno oro postinclusion para microscopia electronica. Observamos que tanto las inmunoparticulas que detectan mGluR1a (de 10 nm, mas pequeñas) como las que detectan mGluR5 (de 20 nm) de localizan en la membrana dendritica postsinpatica, a nivel de excrecencia dendrítica. Ambos receptores comparten localizaciónen las mismas espinas, estando mas o menos alejadas de la zona de especializacoin sinaptica.
  • Una vez demostrada la expresion de ambos tipos de receptores (mGluR1a y mGluR5 en secciones consecutivas), el siguiente paso es estudiar la colocalizacion de ambos tipos de receptores en la misma sinapsis de una seccion del CA3 hipocampal. Para ello utilizamos la tecnica del doble marcado de inmuno oro postinclusion para microscopia electronica. Observamos que tanto las inmunoparticulas que detectan mGluR1a (de 10 nm, mas pequeñas) como las que detectan mGluR5 (de 20 nm) de localizan en la membrana dendritica postsinpatica, a nivel de excrecencia dendrítica. Ambos receptores comparten localizaciónen las mismas espinas, estando mas o menos alejadas de la zona de especializacoin sinaptica.
    Palabras a decir. Distribucion, expresion, localizacion.
  • Seguidamente,y para demostrar la coexistencia, en una misma sinapsis de las fibra musgosas con las Cels piramidales en CA3 hipocampal, de mGluR1b y mGluR5, hemos usado directamente la técnica del doble marcado de inmuno oro postinclusion para microscopia electronica . Las inmunoparticulas de menor tamaño, asociadas a mGluR1b, se encuentran, junto a las inmunoparticulas de mayor tamaño, asociadas a mGluR5, en las espinas dendríticas de las células piramidales.
  • Llevamos a cabo el correspondiente analisis estadistico de de las imágenes y observamos que el 24,5% de las espinas sobre las cuales sinaptan las FM presentan unicamente inmunomarcado para mGluR1b, mientras que solo el 8,3% lo presentan unicamente para mGluR5. La mayor parte de las espinas (el 37,24%) cuentan con ambos tipos de receptores simultaneamente en su membrana, y el 28,53% no expresa ninguno de ellos. En lo referente a su distribución respecto de la densidad postsinaptica, la mayoria de las inmunoparticulas (32 y 33% de mGluR1b y 5 respectivamente) se localizan en los primeros 60 nm desde la sinapsis, es decir, en posicion perisinaptica, y este porcentaje aumenta al 64,3% de mGluR1b y 60,4% de mGluR5 en los primeros 180 nm.
  • La bibliografia existente nos indica que los mGluRs se expresan por todo el SNC. Asi, se ha encontrado mRNA de mGluR5 en las celulas principales de todas las regiones hipocampales, si bien la region CA1 es donde mas abunda. Por otro lado, tambien se ha demostrado la presencia de mRNA de mGluR1 en distintas regiones del SNC (talamo, hipocampo). Históricamente si se han encontrado en este caso diferencias en su localizacion, asi mGluR1a estaría en interneuronas, mientras que mGluR1b/c estarian en celulas piramidales (mas abundante en CA3, ausente en CA1). En cualquier caso, las interneuronas hipocampales muestran fuerte marcaje para mGluR1 y mGluR5. En definitiva, mGluR1 y mGluR5 se loocalizan en CA3 hipocampal, quedando por determinar si colocalizan.
    La bibliografia (Abe, Shigemoto), indica que las cels ppales del hipocampo expresan mRNA de mGluR5 y 1. Las principales celulas del hipocampo expresan mGluR5, y en el caso de mGluR1, se ha visto que es expresa tambien por todo el SNC, siendo 1b y c, mas abundante en las cels piramidales de CA3 y ausente en CA1, estando mGluR1a solo en interneuronas. Ambos mGluRs 1 y 5 son abundantes en interneuronas del hipocampo, y podemos decir que su distribucion es similar en la región CA3 (en celulas piramidales, postsinapticos), PERO SIN SABER AUN SI COLOCALIZAN.
    Estudios realizados en nuestro laboratorio, mediante técnicas inmunocitoquimicas para microscopia de luz, indicaron una distribucion diferencial de las isoformas de mGluR1 (a/b/c) en las celulas de Purkinje cerebelares: a y b estarian dispuestas en soma, dendritas y espinas, mientras que c estaria unicamente en soma y dendritas ppales, concluyendo ademas que esta distribucion diferencial estaria extendida en otras regiones.
    Cuadro azul: lo ve Mateos. Estudios posteriores de nuestro grupo determinan la localizacion de mGluR1a y b en la sinapsis que establecen las fibras paralelas con las celulas de Purkinje, mediante un método inmunocitoquímico de pre inclusion para microscopia electronica. Un 37-25% de mGluR1a/b se localizan en posicion perisnináptica en las espinas de las cels de Purkinje, mientras que este porcentaje aumenta hasta el 62-60% en posicion exrasináptica. Estos datos complementan a los anteriores, ya que ahora no solo sabemos que mGluR1a y b estan en las espinas dendriticas, sino que en un porcentaje alto, son perisinapticos y extrasinápticos.
    Cuadro azul sin relleno: Luján ve que en las espinas dendriticas de celulas piramidales de CA1 y en las espinas dendriticas de celulas de PURKINJE, existe localizacion perisinaptica de mGluR5 y 1a en un 50%, bajando este porcentaje en nuestro estudio al 33 y 34% respectivamente.
    Cuadro rojo: visto por nosotros . Los resultados obtenidos en las sinapsis de fibras paralelas y celulas de purkinje coinciden con los resultados obtenidos por nosotros, en los que mGluR1a y b , en sinapsis de FM-CA3 son perisinapticos y extrasinápticos en porcentajes muy similares a los anteriores.
    Las diferencias, no sustanciales, se deben al uso de distintos anticuerpos y distinto procesamiento (y no porque son distintas células?)
    En resumen, la distribucion de mGluR1a/b y mGluR5 en la sinapsis de las cels de purkinje y las FM-CA3 sigue el mismo patron.
  • En base a estos antecedentes, y teniendo en cuenta que las caracteristicas fisiologicas y anatómicas de las fibras musgosas (comentarlas) les permiten actuar como una siunapsis detonante, de alta eficiencia, es decir, con capacidad de activar fuertemente la region CA3 con pequeños incrementos en la frecuencia presinaptica de disparo), y conociendo el diferente papel que juegan los mGluRs del grupo I en la induccion de la LTP y LTD postsinaptica (mGluR5 clave en la LTP, y mGluR1 clave en la LTD), nos planteamos determinar si ambos tipos de receptores son expresados simultáneamente en la misma sinapsis que establecen las fibras musgosas con las celulas piramidales en la region CA3 hipocampal, asi como determinar si una posible diferencia en su topología podria ser la base del papel selectivo que juegan estos receptores en el contro de la potenciacoin y depresion a largo plazo.
    Implicaciones funcionales. Puede una distinta topologia celular de los mGluR1 y 5 contribuir al `papel distinto que tienen los receptores en la activacion de la Ltd. Y LTP?veremos que no, no hay distinta topologia, luego ha de haber algun otro tipo de mecanismo, por ejemplo, que el ca del re que libera mGluR5 inhiba la ruta desencadenada por mGluR1 produciendo una LTP.
  • A diferencia de la LTP presinaptica, la LTP de FM-CA3 dependiente de NMDAr es postsinaptica. Además, en comparación con otros lugares, en esta sinapsis hay poco NMDA, y la respuesta sináptica mediada por NMDAr es debil, lo que es coherente con el hecho de que la sinapsis FM-CA3 expresa formas de plasticidad independientes de NMDAr, pero plantea el papel de estos receptores en esta sinapsis.
    Parece ser que el tiempo entre disparos de activación (en definitiva, los patrones de actividad) activa la polaridad de la plasticidad sináptica, por ejemplo, si se estimula la neurona a intervalos de 100 ms, se dispara solo la LTP. La literatura ita que la polaridad de la plasticidad (LTD o LTP) esta determinada por la amplitud y/o la evolución temporal del incremento de Ca intracelular. La activación de los mGluRs del grupo I típicamente ocurre con intensa actividad, y desencadenan la plasticidad a largo plazo de la transmisión sináptica.
    La LTD se da porque los mGluR1 provocan la entrada de Ca del exterior, , lo que induce la produccion de la LTD.
    La LTP dependiente de NMDArs, no se induce con los protocolos que inducen la LTP dependiente de AMPARs o KainatoRs, de lo que se deduce que esta LTP dependientye de NMDArs se de porque se recopilan mas NMDArs, y no por liberarse mas glutamato como ocurre en la LTP presinaptica.
    Vermos ademas que mGluR5 y 1 controlan la palsticidad dependiente de NMDArs de forma distinta, mGluR1 regula la Ltd, y mGluR5, la LTP.
    Como mGluR1 y 5 colocalizan en la sinapsis FM-CA3, el glutamato se une a ellos con la misma probabilidad
    En la sinapsis de las coletarelas de schaffer con las piramidales de CA1, hay una Ltd. Que se da porque los NMDArs difunden del area sinaptica, se van. En la sinapsis FM-CA3, se da porque se internalizan los NMDArs en una endocitosis dependiente de dinamina.
    LTD dependiente de NMDArs requiere activacion de mGluR1, y un influjo de Ca del exterior celular. Se produce por la endocitosis de los NMDArs.
    LTP dependiente de NMDArs requiere activacion de mGluR5, y un influjo de Ca del interior celular.
    mGluR1 y mGluR5 son activados por igual en los protocolos de induccion. La concurrencia de Ca de los depositos celulares puede suprimir la cascada de mGluR1, que originaria una LTD., y permitir que se de la LTP. Esto ocurre ademas porque en hipocampo parece ser que mGluR-LTD se da porque se activa una ruta se senalizacion con las proteinas Gq, pero distinta a la habitual (Luscher).
  • presentacion_Tesis_definitiva

    1. 1. ARQUITECTURA SUBCELULAR DEL GRUPO I DE RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO EN LAS SINAPSIS DE LAS FIBRAS MUSGOSAS DEL HIPOCAMPO BORJA OCHOA DE ERIBE LIZARRALDE Directores: Dr. Pedro Rolando Grandes Moreno Dra. Leire Reguero Acebal 19/09/2013 Dpto. Neurociencias Universidad del País Vasco (UPV/EHU)
    2. 2. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
    3. 3. GLUTAMATO COMO NEUROTRANSMISORGLUTAMATO COMO NEUROTRANSMISOR Principal neurotransmisor excitador del sistema nervioso central (SNC) y periférico de mamíferos INTRODUCCIÓN Acumulación vesículas de neurotransmisor en la preterminal sináptica Fusión con la membrana tras la llegada de un potencial de acción Liberación del neurotransmisor a la hendidura sináptica Unión del neurotransmisor a receptores presinápticos y postsinápticos específicos Propagación del impulso nervioso
    4. 4. Despolarización de la membrana plasmática Canal iónico central RECEPTORES IONOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (iGluRs)RECEPTORES IONOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (iGluRs) INTRODUCCIÓN Transmisión rápida del impulso nervioso en el SNC de mamíferos Transmisión rápida del impulso nervioso en el SNC de mamíferos
    5. 5. Clase C de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) 1 única cadena peptídica dominio N-terminal (ext): venus flytrap domain (VFD) dominio C-terminal (intracelular) dominio de membrana (7 segmentos, 7TM) Mecanismo de transducción Homología en la secuencia (70/45%) Perfil farmacológico RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs)RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs) INTRODUCCIÓN
    6. 6. RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs)RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs) INTRODUCCIÓN GRUPO I · mGluR1 · mGluR5 · Activación PLC · ↑ Ca2+ GRUPO II · mGluR2 · mGluR3 · Inhibición AC · ↓ Ca2+ GRUPO III · mGluR4 · mGluR6 · mGluR7 · mGluR8 · Inhibición AC · ↓ Ca2+
    7. 7. RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs)RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs) INTRODUCCIÓN
    8. 8. RESPONSABLE DE LA DIMERIZACIÓN DE LOS mGluRs RESPONSABLE DE LA DIMERIZACIÓN DE LOS mGluRs 2 lóbulos enfrentados Cierre tras la unión del glutamato Cambios conformacionales Se transmiten a la región C-terminal mGluRs. VENUS FLYTRAP DOMAINmGluRs. VENUS FLYTRAP DOMAIN INTRODUCCIÓN Puentes disulfuro intra-intermoleculares Interacciones hidrofóbicas
    9. 9. DOMINIO TRANSMEMBRANA DOMINIO C-Terminal Región desestructurada Longitud variable Splicing / modificaciones postraduccionales Flexibilidad Interacción con proteínas reguladoras Regulación actividad receptor (HOMER) mGluRs. ESTRUCTURA GENERALmGluRs. ESTRUCTURA GENERAL INTRODUCCIÓN Proteínas G (i2)Proteínas G (i2) Regulan la actividad de mGluR1 y mGluR5, modulando la unión a MAP quinasas Canales iónicos asociados a los mGluRs Interacciona con secuencias ricas en prolina del C-terminal (PPSPF) 7 segmentos transmembrana Transmisión cambio conformacional a C-terminal Modulación de la actividad: MAP / MAN
    10. 10. IP3 DAG CANAL K+CANAL K+ PLC PKC Ca2+Ca2+ mGluRs GRUPO I. MECANISMO DE TRANSDUCCIÓNmGluRs GRUPO I. MECANISMO DE TRANSDUCCIÓN INTRODUCCIÓN γ β GDP α GTP
    11. 11. DISTRIBUCIÓN mGluRsDISTRIBUCIÓN mGluRs mGluR1 mGluR5 mGluR2 mGluR3 mGluR3 mGluR4 mGluR7 mGluR8 GRUPO IGRUPO I GRUPO IIIGRUPO IIIGRUPO IIGRUPO II mGluR6 mGluR3 mGluR5 Terminal presináptica Neurona postsináptica Glía INTRODUCCIÓN
    12. 12. HIPOTÁLAMO HIPOCAMPO, TÁLAMO, SUSTANCIA NEGRA, GLOBO PÁLIDO, CEREBELO Y BULBO OLFATORIO HIPOCAMPO, TÁLAMO, SUSTANCIA NEGRA, GLOBO PÁLIDO, CEREBELO Y BULBO OLFATORIO HIPOCAMPO TÁLAMO SUSTANCIA NEGRA GLOBO PÁLIDO CEREBELO BULBO OLFATORIO mGluR1 HIPOCAMPO, BULBO OLFATORIO Y CÓRTEX HIPOCAMPO, BULBO OLFATORIO Y CÓRTEX mGluR5 LOCALIZACIÓN mGluRs GRUPO ILOCALIZACIÓN mGluRs GRUPO I CÓRTEX mGluR1a: CELS DE PURKINJE INTERNEURONAS HIPOCAMPALES NEURONAS TALÁMICAS mGluR1b: CELS PIRAMIDALES CA3 CELS GRANULARES GD HIPOTÁLAMO PATRÓN SIMILAR mGluR5a y mGluR5b: CELS PIRAMIDALES Y GRANULARES DEL HIPOCAMPO mGluR1a: CELS DE PURKINJE INTERNEURONAS HIPOCAMPALES NEURONAS TALÁMICAS mGluR1b: CELS PIRAMIDALES CA3 CELS GRANULARES GD HIPOTÁLAMO PATRÓN SIMILAR mGluR5a y mGluR5b: CELS PIRAMIDALES Y GRANULARES DEL HIPOCAMPO mGluR1a mGluR1b mGluR5 INTRODUCCIÓN
    13. 13. IMPLICACIONES DE LOS mGluRsIMPLICACIONES DE LOS mGluRs INTRODUCCIÓN Mutaciones de mGluR1 y Ataxia Cerebelosa mGluR1 implicado en percepción del dolor en córtex prefrontal mGluRs y progresión del cáncer… mGluR5 y enfermedades sinápticas… mGluRs en la enfermedad de Alzheimer... Modulación de mGluR5 en la memoria contextual... mGluR5 intensifica el aprendizaje adaptativo… Implicaciones de mGluR1, mGluR5 en la ansiedad… Mutaciones en GRM1 en cáncer alteran la localización de mGluR1 mGluRs implicados en la enfermedad de Parkinson… mGluR1-KO doble-KO Dificultades en el aprendizaje Memoria Dificultades en el aprendizaje Memoria mGluR5-KO Modelo para estudiar los procesos de aprendizaje, memoria, adicciones y obesidad Comportamiento antidepresivo Trastornos de ansiedad Modelo para estudiar los procesos de aprendizaje, memoria, adicciones y obesidad Comportamiento antidepresivo Trastornos de ansiedad Modelo de comportamiento de la esquizofreniaModelo de comportamiento de la esquizofrenia
    14. 14. Estructura del sistema límbico LA FORMACIÓN HIPOCAMPALLA FORMACIÓN HIPOCAMPAL INTRODUCCIÓN Progresión unidireccional de la activación sináptica CORTEZA ENTORRINAL GIRO DENTADO HIPOCAMPO SUBÍCULO PRESUBÍCULO PARASUBÍCULO CORTEZA ENTORRINAL GIRO DENTADO HIPOCAMPO SUBÍCULO PRESUBÍCULO PARASUBÍCULO Memoria espacial y contextual Procesos de aprendizaje Regulación estados de ánimo Neurogénesis Memoria espacial y contextual Procesos de aprendizaje Regulación estados de ánimo Neurogénesis Desordenes neurológicos relacionados con alteraciones en esta región Desordenes neurológicos relacionados con alteraciones en esta región DESARROLLO DE ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS
    15. 15. EL CIRCUITO TRISINÁPTICO EXCITADOREL CIRCUITO TRISINÁPTICO EXCITADOR INTRODUCCIÓN VÍA PERFORANTE FIBRAS MUSGOSAS COLATERALES DE SCHAFFER CÓRTEX ENTORRINAL ESTÍMULO GIRO DENTADO VÍA PERFORANTE CA3 FM CA1 COLATERALES DE SCHAFFER COMPLEJO SUBICULAR Ruta unidireccional que conecta todas las regiones de la formación hipocampal de manera secuencial
    16. 16. CORTEZA ENTORRINAL GIRO DENTADO CA3 CA1 SUBÍCULO AFERENCIA SENSORIAL TÁLAMO ANTERIOR POSTSUBÍCULO Conexiones retrógradas de cels piramidales CA3 con el hilus y el GD y de interneuronas CA1 a CA3, y del subículo a CA1 Conexiones retrógradas de cels piramidales CA3 con el hilus y el GD y de interneuronas CA1 a CA3, y del subículo a CA1 Conexiones bidireccionales entre la corteza entorrinal, subículo y CA1Conexiones bidireccionales entre la corteza entorrinal, subículo y CA1 Conexiones colaterales en CA3Conexiones colaterales en CA3 EL CIRCUITO TRISINÁPTICO EXCITADOREL CIRCUITO TRISINÁPTICO EXCITADOR INTRODUCCIÓN Modificado de http://nba.uth.tmc.edu/homepage/jknierim/research
    17. 17. FASCIA DENTADA Formación de la memoria episódica Patrón de separación Formado por tres estratos Formación de la memoria episódica Patrón de separación Formado por tres estratos Capa molecular Capa de células granulares Capa de células polimórficas (hilus) GIRO DENTADOGIRO DENTADO INTRODUCCIÓN Imágenes extraídas de Paxinos & Watson, 2005
    18. 18. FIBRAS MUSGOSASFIBRAS MUSGOSAS INTRODUCCIÓN Axones de células granulares del giro dentado, no mielinizados establecen contactos excitadores con células piramidales de CA3 (espinas dendríticas, sólo en CA3) contactos sinápticos con interneuronas GABA-érgicas del hilus y de CA3 (ratio10:1) RED SINÁPTICA MUY INTENSARED SINÁPTICA MUY INTENSA CONTROL PRECISO DE LA ACTIVIDAD CA3 CONTROL PRECISO DE LA ACTIVIDAD CA3
    19. 19. Estructura laminar dividida en tres regiones CA1 CA2 CA3 sin diferencia celular clara Sinapsis FM sólo en estrato lúcido de CA3 Diferente patrón de expresión génica Sinapsis FM sólo en estrato lúcido de CA3 Diferente patrón de expresión génica Alv EL HIPOCAMPOEL HIPOCAMPO INTRODUCCIÓN Memoria Percepción espacial Memoria Percepción espacial Estrato de células piramidales Estrato radiado: por encima de las células piramidales en CA1 y CA2, y cubriendo el estrato lúcido en CA3 Estrato lacunoso molecular: terminales axónicas originadas en la CE (vía alveolar) y fibras de otras regiones cerebrales (tálamo) Alveus Estrato oriens Estrato lúcidoImágenes extraídas de Paxinos & Watson, 2005
    20. 20. ANTECEDENTES: DISTRIBUCION mGluRs EN CA3ANTECEDENTES: DISTRIBUCION mGluRs EN CA3 INTRODUCCIÓN mGluR1b mGluR1a Ferraguti y cols., 1998, M.Luz mGluR5mGluR5 Luján y cols., 1996, Shigemoto y cols., 1997 ME, preinclusión
    21. 21. HIPÓTESIS DE TRABAJOHIPÓTESIS DE TRABAJO mGluR1 y mGluR5 como elementos postsinápticos en sinapsis FM-CA3 ¿Co-localización en una misma sinapsis? ¿Implicaciones funcionales? HIPÓTESIS DE TRABAJO Células piramidales CA3 expresan mGluR1 y mGluR5
    22. 22. OBJETIVOSOBJETIVOS
    23. 23. 1. Analizar la co-localización subcelular de mGluR1a y mGluR5 en las sinapsis de las fibras musgosas con las neuronas piramidales de la región CA3 hipocampal 2. Investigar asimismo la co-distribución topográfica de mGluR1b y mGluR5 en las sinapsis de las fibras musgosas con las neuronas piramidales de CA3 del hipocampo 3. Finalmente, realizar un análisis cuantitativo de la expresión de estos receptores en una misma sinapsis de la terminal musgosa sobre las excrecencias dendríticas de las neuronas piramidales de CA3 OBJETIVOSOBJETIVOS
    24. 24. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS
    25. 25. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓNANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN MATERIALES Y MÉTODOS RATAS SPRAGUE DAWLEY mGluR1a/b – mGluR5 - WT PATRÓN NORMAL DE EXPRESIÓN DE mGluRs PATRÓN NORMAL DE EXPRESIÓN DE mGluRs
    26. 26. 1. Anestesia 2. Perfusión transcardíaca 3- Preparación de bloques de lowicryl 5- Inmunocitoquímica post-inclusión 4- Secciones semifinas y ultrafinas 6- Observación al microscopio electrónico PREPARACIÓN DE LAS MUESTRASPREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS MATERIALES Y MÉTODOS
    27. 27. Anticuerpo secundario Anticuerpo primario Nanopartícula de oro Antígeno mGluR INMUNOCITOQUÍMICA POST-INCLUSIÓN PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA INMUNOCITOQUÍMICA POST-INCLUSIÓN PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA MATERIALES Y MÉTODOS
    28. 28. Anticuerpo secundario Anticuerpo primario Oro 10 nm Anticuerpo secundario Anticuerpo primario Antígeno Antígeno Oro 20 nm mGluR5 mGluR1a mGluR1b DOBLE INMUNOCITOQUÍMICA POST-INCLUSIÓN PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DOBLE INMUNOCITOQUÍMICA POST-INCLUSIÓN PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA MATERIALES Y MÉTODOS
    29. 29. TÉCNICAS INMUNOCITOQUÍMICASTÉCNICAS INMUNOCITOQUÍMICAS VENTAJAS INCONVENIENTES PREINCLUSIÓN - Mayor sensibilidad - Correlación microscopía de luz y electrónica - No requiere equipamiento especial - Buen mantenimiento de la ultraestructura - No cuantitativo - No permite visualizar proteínas sinápticas - No permite múltiples marcados POSTINCLUSIÓN - Permite visualizar proteínas sinápticas - Análisis cuantitativo - No hay difusión de los inmunoagentes - Posibilidad de múltiples marcados - Sensibilidad moderada - Muchos anticuerpos no funcionan - Equipamiento muy costoso - No permite correlación entre microscopía de luz y electrónica MATERIALES Y MÉTODOS
    30. 30. ANTICUERPOS UTILIZADOSANTICUERPOS UTILIZADOS ANTICUERPO REFERENCIA ESPECIE CONCENTRACIÓN mGluR1a Frontier Science Co. Ltd Cat.# mGluR1a-Rb-Af811-1 Conejo 10 μg/ml mGluR1b Suministrado generosamente por el Dr. Rainer Kuhn Conejo 2 μg/ml mGluR5 Frontier Science Co. Ltd Cat.# mGluR5-GP-Af270-1 Cobaya 20 μg/ml mGluR5 Chemicon/Millipore Cat.# AB5675 Conejo 3,4 μg/ml ANTICUERPO REFERENCIA ESPECIE CONCENTRACIÓN F(ab)2 IgG unida a oro 10nm anti-conejo British Biocell International Cat.# EM.GFAR10 Cabra 1:20 IgG unida a oro 20nm anti- cobaya British Biocell International Cat.# EM.GAG20 Cabra 1:20 P R I M A R I O S P R I M A R I O S S E C U N D A R I O S S E C U N D A R I O S MATERIALES Y MÉTODOS
    31. 31. RESULTADOSRESULTADOS
    32. 32. mGluR1a y mGluR5 EN SECCIONES CONSECUTIVAS mGluR1a y mGluR5 EN SECCIONES CONSECUTIVAS
    33. 33. mGluR1a (10nm) mGluR5 (20nm) mGluR1a (10nm) mGluR5 (20nm)
    34. 34. mGluR1a (10nm) mGluR5 (20nm) mGluR1a (10nm) mGluR5 (20nm)
    35. 35. mGluR1b (10nm) mGluR5 (20nm) mGluR1b (10nm) mGluR5 (20nm)
    36. 36. mGluR1b (10nm) mGluR5 (20nm) mGluR1b (10nm) mGluR5 (20nm)
    37. 37. DISCUSIÓNDISCUSIÓN
    38. 38. Mateos y cols., 2000 Preinclusión para ME DISCUSIÓN SINAPSIS FIBRAS PARALELAS-CÉLULAS DE PURKINJE vs. FM-CA3SINAPSIS FIBRAS PARALELAS-CÉLULAS DE PURKINJE vs. FM-CA3 FIBRAS PARALELAS-CELULAS DE PURKINJE (CEREBELO) Localización perisináptica de mGluR1a/b (37/25%) Localización extrasináptica de mGluR1a/b (62/60%) Localización perisináptica de mGluR5 (células piramidales CA1) y mGluR1a (cels. de Purkinje) (50%) FIBRAS MUSGOSAS-CÉLULAS PIRAMIDALES (CA3 HIPOCAMPAL) Mismo patrón de distribución Uso de distintos anticuerpos Procesado de las muestras Localización perisináptica de mGluR5 (33%) y mGluR1a (34%) en células piramidales de CA3 Localización perisináptica de mGluR1a/b (34/32%) Localización extrasináptica de mGluR1a/b (64,5/64,3%) Luján, 1996, 1997 Preinclusión para ME Postinclusión para ME
    39. 39. DISCUSIÓN mGluR1b mGluR1a Ferraguti y cols., 1998 Microscopía de Luz Anti-pan-mGluR1 anti-mGluR1a/anti-mGluR1b mGluR5mGluR5 Luján y cols., 1996, Shigemoto y cols., 1997 ME, preinclusión Anti-pan-mGluR1 anti-mGluR1a/anti-mGluR5 SINAPSIS FM-CA3SINAPSIS FM-CA3 Hunt y cols., 2013 ME, postinclusión anti-mGluR1a/anti-mGluR1b Anti-mGluR5 mGluR1b mGluR1a mGluR5mGluR5 mGluR1b mGluR1a Sin diferencias topográficas en la distribución de mGluR1a/b y mGluR5 en espinas dendríticas donde se da la sinapsisFM-CA3 ¿Implicaciones funcionales? ¿Implicaciones funcionales? Colocalización perisináptica de mGluR1b y mGluR5 (~40%) de FM-CA3 Colocalización perisináptica de mGluR1a y mGluR5 (~40%) de FM-CA3
    40. 40. Hunt y cols., 2013 DISCUSIÓN PLASTICIDAD BIDIRECCIONAL MEDIADA POR NMDARs Y mGluRsPLASTICIDAD BIDIRECCIONAL MEDIADA POR NMDARs Y mGluRs La liberación de Ca2+ intracelular podría vetar la activación de la ruta iniciada por mGluR1 promoviendo una LTP sinapsis FM-CA3sinapsis FM-CA3 LTPLTP Clásica, presinaptica, mayor liberación de glutamato Postsináptica, dependiente de NMDARs, Ca2+ , mGluR5 Sin diferencias topográficas en la distribución de mGluR1a/b y mGluR5 en FM-CA3 ¿Mecanismo adicional que regule el papel diferencial en la plasticidad? mGluR5 mGluR1 LTP LTD
    41. 41. DISCUSIÓN ESPINA DENDRÍTICA POSTSINÁPTICA E E E Ca2+ Ca2+ Ca2+ E E EE E E EE LTPLTP mGluR5 mGluR1 NMDARs DAG IP3 TERMINAL FIBRA MUSGOSA PLASTICIDAD BIDIRECCIONAL MEDIADA POR NMDARs Y mGluRsPLASTICIDAD BIDIRECCIONAL MEDIADA POR NMDARs Y mGluRs mGluR2
    42. 42. CONCLUSIONESCONCLUSIONES
    43. 43. CONCLUSIONESCONCLUSIONES 1. Las isoformas mGluR1a y mGluR1b del receptor metabotrópico 1 de glutamato, al igual que mGluR5, tienen una distribución postsináptica en las excrecencias espinosas dendríticas de las neuronas piramidales de CA3 que reciben las sinapsis excitadoras de las fibras musgosas. 2. No se han detectado diferencias en la topografía de mGluR1a y mGluR1b respecto a mGluR5 en estas excrecencias dendríticas piramidales dispuestas en el estrato lúcido de CA3 del hipocampo. 3. Alrededor del 41% de los elementos dendríticos de las neuronas piramidales de CA3 con contactos sinápticos de las fibras musgosas presentan los subtipos mGluR1a y mGluR5. 4. Aproximadamente un 60% de las inmunopartículas de mGluR1a (64,5%) y mGluR5 (56,8%) se distribuyen en los primeros 180 nm desde el borde de la densidad postsináptica.
    44. 44. CONCLUSIONESCONCLUSIONES 5. Los subtipos mGluR1b y mGluR5 co-localizan en ~37% de las excrecencias dendríticas de las neuronas piramidales de CA3 que reciben sinapsis de las fibras musgosas. 6. Más del 60% de las inmunopartículas de localización de mGluR1b (64,3%) y mGluR5 (60,4%) están distribuidas en los primeros 180 nm desde el borde de la densidad postsináptica. 7. Finalmente, la co-localización y distribución perisináptica de los subtipos mGluR1 y mGluR5 constituyen la base anatómica de la potenciación y depresión sináptica a largo plazo dependientes de NMDA de las sinapsis excitadoras de las fibras musgosas- células piramidales de CA3 del hipocampo.
    45. 45. MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN

    ×