Massimo Pisu (CRS4) L’ingegneria tissutale ha dato impulso allo sviluppo della tecnica di coltivazione in vitro delle cellule che possono essere fatte crescere, espandere e differenziare su adatti terreni di coltura e con l’impiego di specifici fattori di crescita. La coltivazione delle cellule/tessuto può avvenire con l’ausilio di bioreattori di una certa semplicità costruttiva (stirrer flask) o di maggiore complessità (perfusion bioreactor, horizontal rotating wall bioreactor). In linea teorica la coltura cellulare può essere effettuata con cellule già specializzate (cardiomiociti, condrociti, cellule epiteliali, endoteliali, etc.) o con cellule staminali indifferenziate. Queste ultime sono attualmente oggetto di intenso studio nei laboratori di tutto il mondo, sia per l’individuazione dei meccanismi di base dello sviluppo cellulare, sia per la messa a punto di terapie innovative. I trattamenti medici per la riparazione di tessuti/organi necessitano di numerose cellule che però sono disponibili solo in quantità esigue richiedendo, pertanto, lo sviluppo di efficienti tecniche di coltivazione in vitro. Nel corso del seminario sarà presentata l’attività di ricerca svolta dai ricercatori del Programma di Bioingegneria del CRS4 nel recente passato, con particolare riferimento ai modelli di simulazione e codici di calcolo sviluppati per descrivere la crescita, espansione e differenziazione di cellule con tecniche di coltivazione in vitro.

1. Modellazione matematica e codici
di simulazione per la
proliferazione, crescita e
differenziazione in vitro di cellule
Massimo Pisu
CRS4 - Programma Bioingegneria - Settore Biomedicina
massimo@crs4.it

2. Indice degli argomenti
• Breve introduzione all’Ingegneria tissutale
• Coltivazioni cellulari e bioreattori
• Modellazione matematica e simulazione
• Risultati ottenuti: alcuni esempi
• Potenziali applicazioni

3. Ingegneria Tissutale: Definizione
«L’Ingegneria Tissutale è un campo
interdisciplinare della bioingegneria che applica
diversi principi dell’ingegneria e delle scienze
biologiche allo scopo di ripristinare, mantenere o
migliorare funzioni di tessuti o organi»
R. Langer and J.P. Vacanti, Science (1993)

4. Causa patologie e terapie correnti
• L’organo/tessuto può essere danneggiato per
patologie, anomalie congenite, incidenti,
interventi chirurgici
• Attualmente, per la cura di questi difetti del
tessuto, si procede col trapianto d’organo o
inserimento di altro tessuto dello stesso
paziente, inserimento di dispositivi artificiali e
trattamento farmacologico

5. Paradigma dell’Ingegneria Tissutale
cellule
coltivazione in vitro tessuto ingegnerizzato
scaffold

6. Esempio di ingegneria tissutale
P. Bianco, Nature, 2001

7. Stato dell’arte
J. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010

8. Stato dell’arte-2
Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010

9. Cellule: classificazione
Autologhe
Cellule
Singeniche per Allogeniche
impianto
Xenogeniche

10. Tipi di cellule
Condrociti
Osteoblasti
Specializzate Endoteliali
Cellule
Non specializzate
Epatociti
(Staminali)
……..

11. Cellule staminali
• TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di
cellule.
• PLURIPOTENTI: possono specializzarsi in tutti i tipi di
cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in
cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.
• MULTIPOTENTI: sono in grado di specializzarsi
unicamente in alcuni tipi di cellule.
• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo
cellulare.

12. Matrice extracellulare (ECM)
Nei tessuti connettivi
• Glicoproteine
• Proteoglicani
• Acido ialuronico
• Minerali
Proteine (collagene, elastina, fibrina), Glicosaminoglicani (GAG),
Minerali (idrossiapatite)
L’ECM può fungere da deposito di fattori di crescita. Svolge la
funzione di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e di
divisione tra i diversi tessuti

13. Scaffold
È un supporto (impalcatura) di tipo organico o
inorganico, naturale o artificiale, polimerico o
non.
Funzioni principali dello scaffold
• Conferire la forma 3D desiderata del tessuto
• Stimolare la proliferazione cellulare e quindi di ECM
• Mantenere le proprietà meccaniche del tessuto
impiantato prima della biodegradazione in vivo.

14. Scaffold: caratteristiche ideali
Bio-
compatibilità
Bio-
degradabilità
Porosità Proprietà in vivo
controllata
Garantire
adesione
cellulare

15. Scaffold: morfologia
Fibroso Spugnoso Gelatinoso

16. Coltivazione in vitro
Fasi
• Prelievo (biopsia)
• Isolamento (washing, filtrazione, centrifuga)
• Seeding su scaffold
• Espansione/crescita/differenziazione
Analisi e caratterizzazione
• Preparazione cellule da analizzare (trypsina/EDTA)
• Conta cellulare attraverso Emocitometro (Camera di Burker)
• Distribuzione/conta cellulare con Coulter Counter
• Caratterizzazione del fenotipo con Citofluorimetro a flusso

17. Sistemi di coltivazione in vitro
• Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well
plates, flask)
• Sistemi di espansione in dinamico (bioreattori di vari
tipi)
I bioreattori consentono il raggiungimento di alte
densità cellulari (108/cm3) rispetto a quelle dei sistemi
statici (106/cm3)

18. Vantaggi di un bioreattore
Un bioreattore consente di:
• Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno
della coltura
• Produrre degli stimoli fisico-chimici necessari
• Monitorare e regolare i parametri fisico-
chimici in tempo reale
• Produzione su larga scala di cellule e tessuti

19. Stirred Flask Bioreactor

20. Rotating wall Bioreactor

21. Direct Perfusion Bioreactor

22. Modellazione matematica
La modellazione matematica e la simulazione
computazionale hanno lo scopo di:
• Riduzione dei costi della sperimentazione
• Progettazione di apparecchiature
• Ottimizzazione delle condizioni operative

23. Modellazione matematica-2
I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dal
Programma di Bioingegneria del CRS4 sono basati
principalmente su:
• Principi di conservazione della massa (specie coinvolte,
ossigeno, nutrienti, ECM, GFs)
• Bilancio di popolazione (sulle cellule)
- I bilanci descrivono l’evoluzione temporale/spaziale delle specie coinvolte
in termini di concentrazione, numero e dimensione delle cellule (massa /
dimensione caratteristica / diametro).
- I bilanci contengono termini diffusionali, reattivi (consumo nutrienti,
ossigeno, consumo o produzione di GFs), crescita e divisione cellulare,
trasformazione (differenziazione)

24. Modellazione matematica-3
• Le equazioni del modello sono implementate in un
codice di calcolo scritto in linguaggio FORTRAN
• La risoluzione numerica dei sistemi differenziali o
algebrico-differenziali risultanti viene effettuata
tramite librerie matematiche standard (esempio
IMSL)
• Un singolo run di calcolo, in base alla complessità,
può richiedere pochi minuti o parecchie ore.
• Il modello viene validato mediante confronto diretto
con i dati sperimentali disponibili.

25. Sistemi investigati
• Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate;
• Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e
osteoblasti (tessuto connettivo/osseo);
• Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti
(tessuto non connettivo);
• Espansione di MSC (cellule ovine);
• Espansione di condrociti ovini;
• Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC

26. Esempi di applicazione: I
Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate
Coltivazioni in sistema dinamico (bioreattore NASA
commissionato per il MIT) , utilizzo di condrociti
articolari bovini, scaffolds PGA, soluzione di nutrienti a
base di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

27. Cartilagini ingegnerizzate
Culture Culture
medium bulk medium
Sterile gas
a incubator
Culture
medium
z
Scaffolds
h/2
d/2
b 0 y
q
x z
r
h/2
d d/2
c 0
r
d

28. Cartilagini ingegnerizzate-2
Modello matematico

29. Cartilagini ingegnerizzate-3
Modello matematico-2

30. Cartilagini ingegnerizzate-4
PO2=80 mm hg
t=10 days

31. Cartilagini ingegnerizzate-5
PO2=40 mm hg
t=5 weeks

32. Cartilagini ingegnerizzate-6
Coltivazione su bioreattore con PO2=80 mm hg

33. Cartilagini ingegnerizzate-7
Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA

34. Cartilagini ingegnerizzate-8
Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA

35. Esempi di applicazione: II
Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e
osteoblasti (tessuto connettivo/osseo)
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule
mesenchimali umane, soluzione di nutrienti DMEM,
uso di fattori di crescita TGF-b superfamily, CDMP-1

36. Espansione e differenziazione di MSC

37. Espansione e differenziazione di MSC-2
Modello matematico

38. Espansione e differenziazione di MSC-3
Modello matematico-2

39. Espansione e differenziazione di MSC-4
Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b superfamily

40. Espansione e differenziazione di MSC-5
t=21 days
Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b1 e CDMP-1

41. Espansione e differenziazione di MSC-6
Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura

42. Esempi di applicazione: III
Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti
(tessuto non connettivo)
Coltivazione in sistemi statici, cellule CNSSC murine,
aggiunta di LIF, Activin-A

43. Espansione e differenziazione di CNSSC

44. Espansione e differenziazione di CNSSC-2
Modello matematico

45. Espansione e differenziazione di CNSSC-4
Sistemi statici, CNSSC murine, aggiunta di LIF

46. Espansione e differenziazione di CNSSC-5
Coltivazione con aggiunta di LIF + Activin A

47. Espansione e differenziazione di CNSSC-6
t=3 days
Coltivazione con aggiunta di Activin A

48. Esempi di applicazione: IV
Espansione di MSC (cellule ovine)
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule ovine,
soluzione di nutrienti a base di MEM (Minimum
Essential Medium Eagle)

49. Espansione di MSC (cellule ovine)
Modello matematico

50. Espansione di MSC (cellule ovine)-2
Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)

51. Esempi di applicazione: V
Espansione di condrociti ovini
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di
nutrienti a base di DMEM

52. Espansione di condrociti ovini
Modello matematico

53. Espansione di condrociti ovini-2
Sistema statico, petri dishes, medium DMEM

54. Espansione di condrociti ovini-3

55. Esempi di applicazione: VI
Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di
nutrienti a base di EBM (Endothelial Basal Medium) +
EGM-2 (Endothelial Cell Growth Medium)

56. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC
Modello matematico

57. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2
Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial Cell
Growth Medium (EGM-2)

58. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3

59. Possibili campi di applicazione
L’approccio modellistico presentato può essere
utilizzato in diversi campi della biomedicina:
• Ingegneria Tissutale;
• Medicina rigenerativa;
• Coltivazione cellulare per Terapia Genica;
• Studio dell’evoluzione di masse tumorali.

60. Riferimenti bibliografici
• R. Langer e J.P. Vacanti. Tissue engineering. Science, 260, 920-926, (1993).
• L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Tissue engineering of cartilage. In: J.D. Bronzino,
ed. The Biomedical Engineering Handbook. New York: CRC Press, 1995, pp. 1788–
1806, (1995).
• G. Vunjak-Novakovic, L.E. Freed, R.J. Biron e R. Langer. Effects of mixing on the
composition and morphology of tissue engineered cartilage. AIChE J 42, 850,
(1996).
• B. Obradovic, J.H. Meldon, L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Glycosaminoglycan
deposition in engineered cartilage: experiments and mathematical model. A.I.Ch.E.
Journal 46, 1860, (2000).
• M. Satoh, H. Sugino e T. Yoshida. Activin promotes astrocytic differentiation of a
multipotent neural stem cell line and an astrocyte progenitor cell line from murine
central nervous system. Neuroscience Letters 284, 143–146, (2000).
• P. Bianco. Stem cells in tissue engineering. Nature, 414,118-121, (2001).

61. Riferimenti bibliografici-2
• F. Barry, R.E. Boynton, B. Liu e J.M. Murphy. Chondrogenic differentiation of
mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene
expression of matrix components. Exp. Cell Res. 268, 189–200, (2001).
• C.G. Wilson, L.J. Bonassar e S.S. Kohles. Modeling the dynamic composition of
engineered cartilage. Arch. Biochem. Biophys. 408, 246, (2002).
• M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, F. Delogu e G. Cao. A simulation model for the growth
of tissue engineered cartilage on polymeric scaffolds. Journal of Chemical Reaction
Engineering, http://www.bepress.com/ijcre/vol1/A38, (2003).
• M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, A. Concas e G. Cao. Modeling of engineered cartilage
growth in rotating bioreactors. Chemical Engineering Science, 59, 5035-5040,
(2004).
• X. Bai, Z. Xiao, Y. Pan, J. Hu, J. Pohl, J. Wen e L. Li. Cartilage-derived morphogenetic
protein-1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into
chondrocytes. Biochem, Biophys. Res. Commun. 325, 453–460, (2004).

62. Riferimenti bibliografici-3
• M. Pisu, A. Concas, N. Lai e G. Cao. A novel simulation model for engineered
cartilage growth in static systems. Tissue Engineering, 12, 2311-2320, (2006).
• M. Pisu, A. Concas e G. Cao. A novel simulation model for stem cells
differentiation. Journal of Biotechnology. 130, 171-182, (2007).
• M. Pisu, A. Concas, S. Fadda, A. Cincotti e G. Cao. A simulation model for stem cells
differentiation into specialized cells of non-connective tissues, Journal of
Computational Biology and Chemistry. 32, 338-344, (2008).
• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, E. Desogus, F. Piras,
G. Piga, G. La Nasa e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro
mesenchymal stem cells proliferation. Cell Proliferation, 42,602-616 (2009).
• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, A. Cincotti, M. Pisu, A. Concas e G. Cao.
Experimental analysis and modelling of bone marrow mesenchimal stem cells
proliferation. Chemical Engineering Science, 65, 562-568 (2010).

63. Riferimenti bibliografici-4
• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, G. La Nasa, A.
Concas e G. Cao, In vitro ovine articular chondrocytes proliferation: experiments
and modeling. Cell Proliferation, 43, 310-320 (2010).
• L. Mancuso, M. Scanu, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and
modeling of in vitro HUVECs proliferation in the presence of various types of drugs.
Cell Proliferation, 43, 617-628 (2010).
• J. Vacanti. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to
state of the art, Journal of Pediatric Surgery, 45, 291–294, (2010).
• R. Tozzi. Nuovi Idrogeli per l'Ingegneria Tissutale ed il Drug Delivery, Dipartimento
farmaceutico, Università di Parma. PhD Thesis, http://hdl.handle.net/1889/1437
(2010).