“Efecto del pH sobre la actividad de la β-amilasa”
David Cabrera
Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas,Facultad deCienc...
quelantespuedenproducirestapérdidade funcióndistorsionandolaconfiguración apropiada del
sitio activo (Espitia, 2009).
Las ...
Método
 Preparación del tampón acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml):
Preparar las soluciones de ácido acético y acet...
Resultados
Presente unatablaque recopilelosvaloresde Absorbancia,concentracióndemaltosa,velocidadde
formacióndemaltosa,vel...
Calcule las concentraciones de maltosa a partir de la curva estándar utilizando las lecturas de
absorbancia correspondient...
Además en el desarrollo de la práctica se descartó los trabajos experimentales a pH 4,5 y 5.5 ya
que al graficar la activi...
Cuestionario
a).- Señale que precauciónse ha tomado enel trabajo experimental de determinacióndel pH
óptimo para no mezcla...
d).- ¿Cuálesson los residuosde aminoácido presentesenel sitioactivo de la β-amilasa?
En el sitioactivo de la β-amilasaexis...
Próxima SlideShare
Cargando en…5
×

Efecto del p h sobre la actividad de la β david cabrera

225 visualizaciones

Publicado el

Efecto del PH sobre la actividad enzimática de la B amilasa

Publicado en: Ingeniería
0 comentarios
0 recomendaciones
Estadísticas
Notas
  • Sé el primero en comentar

  • Sé el primero en recomendar esto

Sin descargas
Visualizaciones
Visualizaciones totales
225
En SlideShare
0
De insertados
0
Número de insertados
5
Acciones
Compartido
0
Descargas
2
Comentarios
0
Recomendaciones
0
Insertados 0
No insertados

No hay notas en la diapositiva.

Efecto del p h sobre la actividad de la β david cabrera

  1. 1. “Efecto del pH sobre la actividad de la β-amilasa” David Cabrera Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas,Facultad deCiencia eIngeniería en Alimentos, Universidad Técnica de Ambato Resumen En el presente ensayose empleóβ-amilasa,paradeterminarlainfluencia que tiene el pH sobre la actividad enzimática de la β - amilasa de soya, condición que afecta en su gran mayoría a la estructura terciaria desestabilizando la enzima lo cual provoca que su velocidad enzimática disminuya de forma muy notoria; además mediante la exposición de la enzima a pH que se encontraban dentro de un rango de 3 a 6,5 se logró determinar el pH óptimo al cual la enzima puede trabajarsinningúnproblemaycon una alta eficiencia el mismo que resultó tener un valor de 5,313 resultadoque se pudodeterminarmediante laderivaciónde laecuaciónconlavelocidad promedio de formación de maltosa que en este caso se utilizó como estándar. Palabras Clave: β-amilasa, almidón, maltosa, actividad, pH. Introducción Las enzimassonmoléculasde naturalezaproteicaque catalizanreaccionesquímicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se conviertenenmoléculasdiferentesdenominadasproductos.Casi todoslosprocesosenlas células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas (Ruiz et.al, 2001). La actividad enzimática depende de la existencia de una estructura apropiada del sitio activo, el cual está compuesto por un número reducido de residuos de aminoácido próximos en la estructuratridimensional de la proteína pero usualmente alejados en la estructura primaria. Por tanto, cualquier agente que promueva el desplegado de la proteína separará los residuos que constituyenel sitioactivoyreduciránodestruiránsuactividadbiológica.Condiciones adversas de temperatura, pH o solvente y la presencia de sustancias caotrópicas, metales pesados y agentes
  2. 2. quelantespuedenproducirestapérdidade funcióndistorsionandolaconfiguración apropiada del sitio activo (Espitia, 2009). Las enzimasposeengruposquímicosionizables(carboxilos -COOH;amino-NH2;tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tenercarga eléctricapositiva,negativaoneutra.Comolaconformaciónde las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo. La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimopuedenafectardrásticamente suactividad.Así,la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos. (González, 2012). El objetivo de este trabajo es determinar la influencia del PH en la -amilasa a diversas concentraciones y estimar el PH óptimo. Materialesy Métodos: Reactivos Materiales - Ácido acético 0,05 M - Acetato de sodio 0,05 M - Ácido cítrico 0,05 M - Fosfato dibásico de sodio 0,1 M - Almidón soluble de papa - Solución de DNS - Medidor de pH o papel para medir pH - Pipetas de 1 ml y 5ml - Plancha de calentamiento con agitación - Agitador magnético - Baño María mantenido a 20 (ó 25) ±1 °C - Baño María a ebullición - cronómetro - Tubos bacteriológicos con tapa de 20 ml - Tubos de vidrio de 15 ml
  3. 3. Método  Preparación del tampón acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml): Preparar las soluciones de ácido acético y acetato de sodio 0,02M y mezclarlas hasta conseguir que el pH de la mezcla sea de 4,5 (relación de mezcla aproximada de 1:1).  Soluciones tampón citrato-fosfato de pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0 (50 ml). Mezclar lassolucionesde ácidocítrico(0,05 M) y fosfatodibásicode sodio(0,1M) de modo que el pH final de cada una de ellas alcance los valores antes indicados.  Soluciones de almidón al 1% (20 ml) en cada uno de los tampones citrato-fosfato Pesar la cantidad de almidón soluble correspondiente y suspender en 20 ml de tampón citrato- fosfato, calentar la suspensión bajo agitación y hervir durante 3 min. Enfriar y restituir el agua evaporada. Medir el valor de pH de cada sustrato (valor real que será usado para la gráfica y el cálculo del pH óptimo).  Solución de enzima 1/40 en tampón acetato (10 ml) Prepararla diluciónfinal de laenzimapordilucionessucesivas (1ª dil 1/10; 3,0 mL) y (2ª ¼; 10 mL).  Determinación de la actividad inicial a 20 ℃ Colocaren unagradilla36 tubosbacteriológicosperfectamente lavadosymarcadosconel valorde pH, 3 tubos por cada valor de pH más un blanco. Añadir a cada tubo 0,4 ml de la solución de ml de la solución de enzima a cada una de las réplicas, dejar que la reacción proceda durante 3 minutosydetenerlareaccióncon laadiciónde 0,5 ml de soluciónde DNS.Mezclarbien,hervirpor 5 minutos,enfriar,añadir5ml de agua destiladayleerla absorbancia a 540 nm frente a un blanco preparadoinvirtiendoel ordende adiciónde losreactivos(enzima,DNS(mezclarbien) ysustrato).  Preparación de la curva estándar de Maltosa Utilizar los valores de absorbancia y concentraciones de la curva estándar de maltosa de la práctica 1.
  4. 4. Resultados Presente unatablaque recopilelosvaloresde Absorbancia,concentracióndemaltosa,velocidadde formacióndemaltosa,velocidadrelativaenporcentajeyladesviaciónestándara los distintosvalores de pH. Obtengaelperfil depH (Gráficode% velocidadrelativavs pH)e incluyala ecuaciónderegresiónquemejor se ajuste algráfico. Generalmente,laecuaciónobtenidaesdesegundoorden.En este caso,derive la expresión,igualeaceroy obtengael valor máximo,estepH constituyeel óptimo. Gráfica #1: Estándar de maltosa Elaborado por: David Cabrera Fuente: Laboratorio ingeniería de las enzimas 2015 Cálculos NOTA: En esta ocasión se va a estimar velocidad inicial relativa, en porcentaje, a partir de las velocidades iniciales de hidrólisis del almidón soluble de papa, obtenidos a partir de la concentración de maltosa producida luego de 3 minutos de reacción: y = 0.3885x - 0.0071 R² = 0.9983 -0.100 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000 2.5000 Absorbancia [maltosa] (mg/ml) min3 [Malt] min0min3 [Malt][Malt] V dt dP 3min0min3min 0    
  5. 5. Calcule las concentraciones de maltosa a partir de la curva estándar utilizando las lecturas de absorbancia correspondientes y determine con ellas las velocidades inciales de hidrólisis. Con cada valorde velocidadcuantifique laactividadrelativadividiendo la velocidad de formación de maltosa a cada uno de los valores de pH para la velocidad máxima alcanzada y exprese en porcentaje. Determine el valor medio y calcule la desviación estándar. Elabore el gráfico de A relativa media vs pH (NOTA: incluya en el gráfico las barras de error) y determine el valor de pH óptimo por regresión a partir de la curva. Discusión Reporteel valor de pH óptimo.Compareconvaloresreportadosenbibliografíaparaesta enzima. RECUERDEutilizar bibliografíaexistenteenla bibliotecadelaFCIAL tanto física comovirtual. En el desarrollode lapráctica se determinólainfluenciadel pHsobre la actividad enzimática de la β - amilasa de soya, estimando así el pH óptimo para el cual dicha enzima actúe de manera eficiente al emplear como sustrato al almidón. El efecto del pH en la actividad enzimática es un factor muy importante que debe ser tenido en cuenta puesto que la intensidad máxima de la actividadde laenzima,ocurre enel pH óptimo,conrápida disminución de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad óptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9. El pH óptimo de una enzima puede guardar relación con cierta carga eléctrica de la superficie, o con condicionesóptimasparalafijaciónde laenzimaasu sustrato.Cuandohayun excesode iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus moléculas y ante un déficit los ceden. Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la molécula. Como todas las proteínas, las enzimas desempeñan su función por los residuos de aminoácidos; algunos confieren a su superficie una distribución de cargas eléctricas. Cuando la concentración de iones hidrogeno es muy baja en comparación con la concentración optima, la molécula los cede desapareciendo cargas positivas o apareciendo cargas negativas en su superficie. Cuando se cambia las cargas eléctricas en los residuos de aminoácidos se alteran los lazos de unión dentro de la molécula variando su acomodo tridimensional con recuperación de la actividad de la enzima (Vásquez, 2007). El producto de la reacciónfue lamaltosaque al ser cuantificada y con la curva obtenida, se calculóel pH óptimo,ysu valorfue de 5,31; ademásencuantoa laactividadrelativaque diocomo 15,58% de actividad, dando a conocer que la actividad de la beta amilasa empleada a pH 5,31 trabaja de forma adecuada aunque ésta no sea muy eficiente en cuanto al valor general de actividad relativa obtenida. 100* V V (%)A máx pH relativa 
  6. 6. Además en el desarrollo de la práctica se descartó los trabajos experimentales a pH 4,5 y 5.5 ya que al graficar la actividad enzimática vs. pH estos dos valores mostraban picos con errores a simple vista ya que estaban lejos de la curva generada, además con lo realizado se logró bajar el margen de error de la experimentación. La relación entre el pH y la actividad depende del comportamiento ácido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) puedencontenergruposfuncionalesácidosybásicos,siendosugradode disociacióndependiente del pH, loque determinará,entre otros aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad de unióndel sustratoal centroactivo del enzima(Km) y la capacidad de transformación del sustrato. Los estudios cinéticos a diferentes valores de pH nos proporcionan información sobre el mecanismo catalítico de los enzimas y la naturaleza de los aminoácidos más directamente implicados en la catálisis (Vásquez, 2007). Conclusiones  El pH afecta directamente a la actividad enzimática de la β - amilasa de soya ya que este factor influye sobre la estructura terciaria de la enzima lo cual se ve reflejado en la disminuciónde lavelocidad enzimática, por lo cual se necesita encontrar el pH óptimo al cual esta enzima trabaja de manera eficiente y para esto se la sometió a pruebas dentro de un rango de pH entre 3 y 6,5. Para este análisisse preparóunasoluciónconla enzima y el sustrato que en este caso fue el almidón, a la cual se le sometió a los pH dentro del rango antesmencionadohastaencontrar el pH óptimo el mismo que resultó ser de 5,313 es decir en este punto la enzima alcanza su mayor actividad catalítica por lo que su velocidad de reacción aumenta conforme los valores se acercan a este pH, este valor se pudo determinar mediante la derivación de la ecuación con la velocidad promedio de formación de maltosa.  Se determinó de manera experimental la actividad de la -amilasa mediante diversas concentracionesde enzima,que de la mismamanera sirvieron para verificar la diferencia entre lasvelocidadesde reacción,empleandocomosustratoalmidónsoluble, mediante la estimación de la cantidad de azucares reductores formados con DNS y mediante la derivación de la ecuación para cuantificar la actividad de la β-amilasa  Se evaluaronycompararon factoresque inhiben la velocidad en la cinética enzimática ya que la concentración de complejos enzima-sustrato depende, de las concentraciones de los componentes del complejo presentes en el medio.
  7. 7. Cuestionario a).- Señale que precauciónse ha tomado enel trabajo experimental de determinacióndel pH óptimo para no mezclarel efectode la estabilidadde la enzima a los diferentesvaloresde pH con la estimaciónde la influenciadel pH en la velocidadde reacción. -Se debe emplearunbuffer a un pH indicado para diluir la enzima antes de realizar la estimación de la actividad, puesto que se puede alterar la estabilidad enzimática. -Se debe colocar con la mayor exactitud posible las cantidades de enzima como de buffer para obtener una medición de actividad lógica. -Se debe aplicar la variación de pH sobre el sustrato de la enzimas permitirá distinguir la disminución de la actividad a determinado pH, evitando desestabilizar a la enzima (Sánchez,2008). b).-Cite al menosun ejemplode enzimaque actúe sobre un sustrato que se ioniza.Mencione el nombre del sustrato. La Seretonina N-acetiltransferasa cataliza la conversión de la seretonina (SUSTRATO) en N- acetilseretonina,generando un proceso de ionización al emplear al acetil-CoA como donador de los grupos acetilo (Fernández, 2009). c).- ¿Cuántos residuosionizablestiene unaenzimacuyo gráfico de Velocidadrelativa vs pH tiene forma de campana? Una enzimatiene 2residuosionizablesparatenerunavariaciónenformade campana,losmismos que tienenlacapacidadde ionizarse oprotonarse dependiendode lascondicionesdel medioenel que se hallan (Sánchez, 2008).
  8. 8. d).- ¿Cuálesson los residuosde aminoácido presentesenel sitioactivo de la β-amilasa? En el sitioactivo de la β-amilasaexisten dosresiduoslocalizadosenel centroactivodel enzima,en la mayorparte de loscasos aspárticoo glutámico.Unode ellosactúacomodonadorde un protón y el otro comonucleófilo/base,para estabilizarlaestructura. (Navarro,2009) e).- ¿Por qué se utilizóeneste estudiotampón citrato-fosfato enlugar de tampón acetato de sodiopara preparar los sustratos? Se utilizótampóncitratofosfatoporque el acetatode sodiotiene unrango de pH pequeño que va de 3,6 a 5,8; mientras que el tampón citrato fosfato tiene un rango de pH más amplio que va de 2,8 a 7,0, y nospermite trabajarenun rango acido-neutro,puestoque supH óptimo de trabajo es de 5,2, lo cual es el indicado para trabajar con la beta amilasa de soya (Batista, 2009). BIBLIOGRAFÍA Batista, A. 2009. “Producción de enzima amilasa microbiana mediante fermentación en sustrato líquido”. Disponibleen:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/sc hmidth02/parte08/09.html Espitia, C. 2009. “Determinación de la concentración de alfa y beta amilasas comerciales en la producciónde etanol a partirde almidónde cebada”. Pontificia Universidad Javeriana. Colombia. Fernández, P. 2009. “Actividad Enzimática”. Disponible en: http://www.rincondelasciencias.com/actividad%20enzimatica.pdf González, J. 2012. “Regulación de la actividad enzimática”. Disponible en: http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz22.htm Navarro, Diana. 2009 “Modificación funcional de la glucoamilasa de Sacharomyces cerevisiae”30/Diciembre2009 Disponible en: http://theindustrialenzymologist.blogspot.com/2009/12/modificacion-funcional-de-la.html Ruiz, R.; Vásquez, J. 2001. "Hidrólisis Enzimática de Desechos del Umarí (Poraqueiba serícea Tulasne) y de la yuca (Manihot esculenta Crantz)". Revista Amazónica de Investigación Alimentaria, v.1, nº1. Perú. pág. 22-29. Sánchez,L. 2008. ActividadEnzimática.Terceraedición.Editorial HiltherBros.Madrid-España.pág. 115-120. Vásquez, R. 2007. “Cinética Química”. Primera Edición. Editorial Reverte. México. pág. 216-218.

×