UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
QUÍMICA FARMACEUTICO BIOLÓGICA
BIOSINTESÍS Y BIOTECNOLOGÍA
PRO...
INTRODUCCIÓN
Hormonas, interferones y
diversas enzimas
Técnicas de DNA recombinante Significaron una revolución en la producción
de este tipo de compuestos. Permite alterar los ...
MARCO HISTÓRICO
• Biotecnología Aplicación de los principios de la ciencia e ingeniería
al procesamiento de materiales por agentes biológi...
RECOMBINACIÓN NATURAL
Conjugación
Transducción
Transformación
MUTAGÉNESIS
Herramienta para el mejoramiento de cepas.
MUTACIÓN
Es un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos del DNA.
Puede o no producir un cambio observable en el ind...
MUTÁGENOS FÍSICOS
• Mutaciones puntuales
• Dímeros de Timina
• Roturas cromosómicas
• Radiación UV
• Rayos γ
• Rayos X
MUTÁGENOS QUÍMICOS
Ácido Nitroso
Agentes alquilantes
Sustancias análogas a las bases nitrogenadas
Sustancias intercalantes
MUTAGÉNESIS INDUCIDA
Someter a los microorganismos a repetidas rondas de Mutagénesis,
seguido de una detección y selección...
INGENIERÍA GENÉTICA DE
MICROORGANISMOS
Producción de proteínas en bacterias.
• La tecnología de DNA recombinante ha permitido que
secuencias específicas de ADN sean transferidas de un
organismo a otr...
• La Ingeniería Genética implica la manipulación del DNA
fuera de la célula.
1. Aislamiento y recuperación del gen de inte...
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
EN BACTERIAS
Uso de vectores para la inserción del DNA
Usualmente resulta necesario insertar un gen exógeno en un
vector que se replica autónomamente en el microorganismo
hosped...
PLÁSMIDOS
• Características
• Origen de replicación
• Gen de resistencia a
antibióticos
• Comúnmente el DNA
exógeno y el p...
La introducción de plásmidos recombinantes por Transformación se
puede lograr con un tratamiento de Cloruro de Calcio, lo ...
VECTORES DE FAGO Λ
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
Detección y Selección de clones Recombinantes
PCR y Bases de Datos
Expresión de los Genes clonados...
• Método de hibridación.
• Método fenotípico
• Método
inmunológico
Colonias con defectos nutricionales
Métodos Genéticos
BASES DE DATOS
EXPRESIÓN DE LOS
GENES INSERTADOS.
ALTOS NIVELES DE
EXPRESIÓN DE PROTEÍNA
• Factores genéticos.
Características del gen, estabilidad del ARNm, Promotor
emple...
RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
• Acumulación de proteína en citoplasma
*Lisis de la célula
*Puede ocurrir la for...
*Separar por centrifugación
O filtración.
** remoción de ácido nucleicos
mediante agentes policatiónicos
*** precipitación...
PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA
EN E. coli
PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA (RENNINA)
• Es la proteasa (Aspartil-proteasa) que se produce en
una mayor proporción en el cuarto...
RENNINA
• Se libera como PREPROQUIMOSINA
PRE 16 aa PRO 27 aa QUIMOSINA
PRO 27 aa QUIMOSINA
QUIMOSINA
¿QUÉ HACE LA
RENNINA?
• Coagula la leche por la
hidrólisis de k-caseina
PROBLEMA
¿Solución?
Rennina producida por hongos como Mucor o
Endothia
PRO 27 aa QUIMOSINA
Rennina recombinante
QUIMOSINA
RECOMBINANTE
• Fusión al extremo N-
terminal de LacZ o TrpE
• La secuencia de la
proquimosina se insertó
nmediat...
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
EN LEVADURAS
GENOMA NUCLEAR S. CEREVISIAE
Distribución genoma S. cerevisiae
Comparación en tamaño de
genomas
GENOMA NO NUCLEAR
YAC’S “YEAST ARTIFICIAL
CHROMOSOMES”
Centromérico
Episomal
(Lanzadera)
MEJORA EXPRESIÓN
GENÉTICA
Acetilación
Otras
• Glicosilación
• Insertar genes de
glicosilación humanos
• Deleción de genes ...
CEPA E. COLI K12 JA 198, VECTOR PBR322, GEN PROQUIMOSINA ERAN 3
SEGMENTOS SE INSERTAN EN EL VECTOR Y SE DEJA LA CEPA CON E...
PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO
DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B
POR LEVADURAS
VACUNA DE LA
HEPATITIS B
Antígeno de superficie del virus
de la hepatitis B (HBsAg)
9 RESIDUOS DE G
3 RESIDUOS DE G
GLUCOSILACION, PLEGAMIENTO Y
ACETILACIÓN DE HBSAG
Humano
• N-Glucosilado
• Exportado hacia la
membrana vía Golgi
• Plegami...
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
Uso Terapeútico
PROTEÍNAS
RECOMBINANTES: USO
TERAPÉUTICO
•Factor de necrosis tisular-α
Anticuerpos
•Interferones, Interleucinas , TNFCánce...
DNASAS: FIBROSIS
QUÍSTICA
DNasas 260 aa
(Pulmozyme®, FDA 1996)
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• Primera proteína recombinante de uso farmacéutico.
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Humulin® , FDA 1981
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tipos I y III
REFERENCIAS
• Lauersen, K. J.; Berger, H.; Mussgnug, J. H.; Kruse, O. Efficient
recombinant protein production and secreti...
REFERENCIAS
• Waites, MJ. (2001) Industrial Microbiology: An Introduction.
Blackwell Science. London, UK. p. 80-84. 173-17...
Producción de proteínas recombinantes
Producción de proteínas recombinantes
Producción de proteínas recombinantes
Producción de proteínas recombinantes
Producción de proteínas recombinantes
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Producción de proteínas recombinantes

  1. 1. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA QUÍMICA FARMACEUTICO BIOLÓGICA BIOSINTESÍS Y BIOTECNOLOGÍA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Canchola Carrillo Eileen Muñoz Herrera David Nava Pintor Edgar Ezequiel Ocampo Olvera Silvestre Alfredo Semestre 2014/2 Torres Torres Edna Yuzi 30 de Abril del 2014 .
  2. 2. INTRODUCCIÓN
  3. 3. Hormonas, interferones y diversas enzimas
  4. 4. Técnicas de DNA recombinante Significaron una revolución en la producción de este tipo de compuestos. Permite alterar los genes y expresarlos de tal manera que se pueden obtener proteínas con propiedades funcionales mejoradas o corregir defectos genéticos •Vector de expresión, un plásmido q contiene secuencias de control de trascripción y traducción en posiciones adecuadas. •Proteínas de eucariontes. El DNA recombinante con la secuencia que codifica la proteína también presenta las secuencias.
  5. 5. MARCO HISTÓRICO
  6. 6. • Biotecnología Aplicación de los principios de la ciencia e ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos. La definición actual se refiere también a los productos. El consumo de la bebida aumentó al transcurrir los siglos; se tuvieron que desarrollar métodos que permitieran obtener grandes volúmenes.
  7. 7. RECOMBINACIÓN NATURAL Conjugación Transducción Transformación
  8. 8. MUTAGÉNESIS Herramienta para el mejoramiento de cepas.
  9. 9. MUTACIÓN Es un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos del DNA. Puede o no producir un cambio observable en el individuo. Se presenta súbita y espontáneamente. 10-10 mutaciones por generación por gen
  10. 10. MUTÁGENOS FÍSICOS • Mutaciones puntuales • Dímeros de Timina • Roturas cromosómicas • Radiación UV • Rayos γ • Rayos X
  11. 11. MUTÁGENOS QUÍMICOS Ácido Nitroso Agentes alquilantes Sustancias análogas a las bases nitrogenadas Sustancias intercalantes
  12. 12. MUTAGÉNESIS INDUCIDA Someter a los microorganismos a repetidas rondas de Mutagénesis, seguido de una detección y selección apropiadas de los sobrevivientes, ha sido una herramienta muy efectiva en el mejoramiento de muchos microorganismos utilizados industrialmente.
  13. 13. INGENIERÍA GENÉTICA DE MICROORGANISMOS Producción de proteínas en bacterias.
  14. 14. • La tecnología de DNA recombinante ha permitido que secuencias específicas de ADN sean transferidas de un organismo a otro. • Esto puede ser utilizado para incrementar el rendimiento de un producto mediante la remoción de los cuellos de botella en las rutas metabólicas y amplificando o modificando pasos específicos en la ruta metabólica. • Dado que no hay restricción para el origen de los genes que expresa un microorganismo, la producción de proteínas de origen animal y vegetal se ha hecho posible
  15. 15. • La Ingeniería Genética implica la manipulación del DNA fuera de la célula. 1. Aislamiento y recuperación del gen de interés. • Regulación de su expresión. 2. 3. Inserción del DNA en la célula huésped mediante un vector de fácil manipulación. 4. Reproducción.
  16. 16. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS Uso de vectores para la inserción del DNA
  17. 17. Usualmente resulta necesario insertar un gen exógeno en un vector que se replica autónomamente en el microorganismo hospedero y actúa como un transportador del segmento de DNA exógeno insertado.
  18. 18. PLÁSMIDOS • Características • Origen de replicación • Gen de resistencia a antibióticos • Comúnmente el DNA exógeno y el plásmido son cortados con la misma enzima de restricción. • El plásmido recombinante se introduce por Transformación
  19. 19. La introducción de plásmidos recombinantes por Transformación se puede lograr con un tratamiento de Cloruro de Calcio, lo cual somete a la membrana celular haciéndola más permeable al DNA exógeno.
  20. 20. VECTORES DE FAGO Λ
  21. 21. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Detección y Selección de clones Recombinantes PCR y Bases de Datos Expresión de los Genes clonados Recuperación y Purificación de Proteínas
  22. 22. • Método de hibridación.
  23. 23. • Método fenotípico • Método inmunológico
  24. 24. Colonias con defectos nutricionales Métodos Genéticos
  25. 25. BASES DE DATOS
  26. 26. EXPRESIÓN DE LOS GENES INSERTADOS.
  27. 27. ALTOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNA • Factores genéticos. Características del gen, estabilidad del ARNm, Promotor empleado, cepa utilizada • Factores fisiológicos. Componentes del medio de cultivo, estrategias de cultivo, parámetro en el fermentador.
  28. 28. RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS • Acumulación de proteína en citoplasma *Lisis de la célula *Puede ocurrir la formación de cuerpos de inclusión. • Acumulación de proteínas en el espacio periplasmático. *Choque osmótico
  29. 29. *Separar por centrifugación O filtración. ** remoción de ácido nucleicos mediante agentes policatiónicos *** precipitación de la proteína con sale s o resinas de integración hidrofóbica **** purificación final por métodos cromatográficos.
  30. 30. PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA EN E. coli
  31. 31. PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA (RENNINA) • Es la proteasa (Aspartil-proteasa) que se produce en una mayor proporción en el cuarto estómago de los rumiantes lactantes.
  32. 32. RENNINA • Se libera como PREPROQUIMOSINA PRE 16 aa PRO 27 aa QUIMOSINA PRO 27 aa QUIMOSINA QUIMOSINA
  33. 33. ¿QUÉ HACE LA RENNINA? • Coagula la leche por la hidrólisis de k-caseina
  34. 34. PROBLEMA ¿Solución? Rennina producida por hongos como Mucor o Endothia
  35. 35. PRO 27 aa QUIMOSINA Rennina recombinante
  36. 36. QUIMOSINA RECOMBINANTE • Fusión al extremo N- terminal de LacZ o TrpE • La secuencia de la proquimosina se insertó nmediatamente después del RBS y el codón ATG
  37. 37. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS
  38. 38. GENOMA NUCLEAR S. CEREVISIAE Distribución genoma S. cerevisiae Comparación en tamaño de genomas
  39. 39. GENOMA NO NUCLEAR
  40. 40. YAC’S “YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES” Centromérico Episomal (Lanzadera)
  41. 41. MEJORA EXPRESIÓN GENÉTICA Acetilación Otras • Glicosilación • Insertar genes de glicosilación humanos • Deleción de genes de glicosilación • Cadena de oligohistidina
  42. 42. CEPA E. COLI K12 JA 198, VECTOR PBR322, GEN PROQUIMOSINA ERAN 3 SEGMENTOS SE INSERTAN EN EL VECTOR Y SE DEJA LA CEPA CON EL VECTOR EN MEDIO PARA FORMAR CUERPOS DE INCLUSIÓN.
  43. 43. PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B POR LEVADURAS
  44. 44. VACUNA DE LA HEPATITIS B Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)
  45. 45. 9 RESIDUOS DE G 3 RESIDUOS DE G
  46. 46. GLUCOSILACION, PLEGAMIENTO Y ACETILACIÓN DE HBSAG Humano • N-Glucosilado • Exportado hacia la membrana vía Golgi • Plegamiento en partículas de 22 nm • Acetilado Levadura • No glucosilado • Se acumula en el citoplasma • Plegamiento en partículas de 22 nm • Una fracción se acetila
  47. 47. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Uso Terapeútico
  48. 48. PROTEÍNAS RECOMBINANTES: USO TERAPÉUTICO •Factor de necrosis tisular-α Anticuerpos •Interferones, Interleucinas , TNFCáncer y infecciones virales •Eritropoyetina, Hirudin, Uroquinsa, Activador de plasminógeno tisular Enfermedades cardiovasculares •Insulina, Hormona del crecimiento Hormonas •Endorfinas, NeuropéptidosEnfermedades Neurológicas •Hepatitis-B Vacunas •Factor de crecimiento epidermico, de fibroblastos y factor VIII de la coagulación Cicatrizantes y factores de coagulación
  49. 49. DNASAS: FIBROSIS QUÍSTICA DNasas 260 aa (Pulmozyme®, FDA 1996) Viscosidad del moco
  50. 50. ERITROPOYETINA EPOGEN® 1989
  51. 51. SOMATOTROPINA (HGH) hGH 191 aa Cadáveres Bovino o porcino Recombinante (E. coli)
  52. 52. SOMATOTROPINA 192 aa N-formilmetionina N-formilmetionil-Hgh PROTROPIN® 1985
  53. 53. INSULINA • Primera proteína recombinante de uso farmacéutico.
  54. 54. E. Coli o S. cerevisiae Cadena A Cadena B Insulina Humulin® , FDA 1981
  55. 55. INTERFERÓN IFN-α IFN-β IFN-γ • Hepatitis C • Cáncer renal • Leucemias • Mieloma • Esclerosis múltiple • Leucemia • Cáncer renal
  56. 56. I N T E R F E R Ó N
  57. 57. INTERLEUCINAS IL-2 (PROLEUKIN®, FDA 1992) Carcinoma renal
  58. 58. FACTOR ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TISULAR (TPA) tPA (Serín proteasa) Plasminógeno Plasmina Disolución del coágulo
  59. 59. COLÁGENO Pichia augusta Pichia pastoris Colágeno tipos I y III
  60. 60. REFERENCIAS • Lauersen, K. J.; Berger, H.; Mussgnug, J. H.; Kruse, O. Efficient recombinant protein production and secretion from nuclear transgenes in Chlamydomonas reinhardtii . Journal of Biotechnology 167 (2013) 101-110. • Singer, M; Berg, P. Genes y Genomas. Una perspectiva cambiante. 1993, 1a edición, Ediciones Omega, S.A, Barcelona, España. pp 227-229. • Klug, W. S; Cummings, M.R. Conceptos de Genética. 1999, 5a edición, Prentice Hall, México. pp 453- 454 y 504. • Glazer, AN. Nakaido, Hiroshi.(2007) Microbial Biotechnology. Fundamentals of applied microbiology. 2da Edición. Cambridge University Press. Cambridge, UK. p. 90-143.
  61. 61. REFERENCIAS • Waites, MJ. (2001) Industrial Microbiology: An Introduction. Blackwell Science. London, UK. p. 80-84. 173-177. • Mellor, J., M. J. Dobson, N. A. Roberts, M. F. Tuite, J. S. Emtage, S. White, P. A. Patel, A. J. Kingsman and S. M. Kingsman. 1983. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. GENE 24: 1-14 • J. M. Cregg1, ,†, J. F. Tschopp1, C. Stillman1, R. Siegel1,High–Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Nature Biotechnology 5, 479 - 485 (1987) doi:10.1038/nbt0587-479

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