El ADN y la Ingeniería genética<br />Tema 16<br />
Biotecnología<br />Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano <br /><ul><li>Producción de ...
Obtención de medicamentos</li></ul>La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biol...
Organismos transgénicos, terapia génica</li></li></ul><li>Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ...
Técnicas utilizadas en Ingeniería genética<br />
Aplicaciones de la ingeniería genética<br />
Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniería genética<br />
Tecnología del ADN recombinante<br />Fragmentar y aislar el ADN<br />Unión a vectores.<br />Introducción en las células.<b...
Enzimas de restricción<br />Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida.  <br />...
Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)</li></ul>Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma...
ADN recombinante<br />
Formación de ADN complementario por hibridación<br /><ul><li>Tenemos dos tipos distintos de ADN
Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización).
Se devuelven las condiciones adecuadas y se produce la renaturalización.
Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos tipos de ADN
El porcentaje de hibridación está relacionado con el parentesco evolutivo
Estas técnicas permiten localizar enfermedades genéticas</li></li></ul><li>Síntesis de ADNc usando ARNm como molde<br />Se...
AAAAAA 3’<br />5’<br />TTTTTT 5’<br />AAAAAA 3’<br />5’<br />TTTTTT 5’<br />3’<br />Transcriptasa inversa<br />ADNc<br />D...
Clonación de ADN<br />En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específi...
Vectores de clonación<br /><ul><li>Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan i...
Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.</li></ul>Para insert...
Tipos de vectores de clonación<br /><ul><li>Plásmidos
Virus bacteriófagos
Cósmidos
YAC’s (cromosomas artificiales de levadura)
Cromosomas artificiales de bacterias (BAC’s)
Cromosomas artificiales humanos</li></li></ul><li>Plásmidos<br /><ul><li>Son moléculas de ADN bicatenario circular.
Se localizan en las bacterias.
Tienen replicación independiente.
Genes propios (resistencias a antibióticos) que permiten seleccionarlos posteriormente
Facilidad para la manipulación.
Puntos de corte específicos para enzimas de restricción</li></li></ul><li>
Bacteriófagos<br /><ul><li>Virus que infectan bacterias
Incorporan material genético mediante el proceso de transducción.
Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material del antiguo huésped.</li></li></ul><li>Cósmidos<br /><ul><li>Cons...
Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el materi...
Lleva varios genes de plásmidos
Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos)
Tiene varios sitios de restricción
Permite transportar grandes cantidades de ADN.</li></li></ul><li>
Cromosoma artificial de levadura<br />Son vectores de clonación de alta capacidad. <br />Esto permite clonar en levaduras ...
Clonación de los fragmentos de ADN<br />Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo que sea). Generalmente d...
Almacenamiento de genes clonados<br /><ul><li>Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un v...
La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es de...
Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos.
Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc</li></li></ul><li>Identificación de clones<br />Una genoteca cont...
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Tema 16: El ADN y la ingeniería genética

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Temario de 2º de Bachillerato. Ensayos de secuenciación, PCR, microarrays, ADN recombinante

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Tema 16: El ADN y la ingeniería genética

  1. 1. El ADN y la Ingeniería genética<br />Tema 16<br />
  2. 2. Biotecnología<br />Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano <br /><ul><li>Producción de alimentos y bebidas
  3. 3. Obtención de medicamentos</li></ul>La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.<br /><ul><li>Clonación, mapas genéticos,
  4. 4. Organismos transgénicos, terapia génica</li></li></ul><li>Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano <br />Biotecnología<br />Tecnología del ADN recombinante<br />(década 70)<br />Alimentos<br />Medicamentos<br />Bebidas<br />Ingeniería genética<br />No hay modificación de genes<br />Animales y plantas transgenicas<br />Si hay modificación de genes<br />
  5. 5. Técnicas utilizadas en Ingeniería genética<br />
  6. 6. Aplicaciones de la ingeniería genética<br />
  7. 7. Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniería genética<br />
  8. 8. Tecnología del ADN recombinante<br />Fragmentar y aislar el ADN<br />Unión a vectores.<br />Introducción en las células.<br />Clonación<br />Búsqueda del clon idóneo.<br />Análisis del ADN clonado: transferencia Southern,<br />Secuenciación.<br />Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)<br />
  9. 9. Enzimas de restricción<br />Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida. <br />Las secuencias de corte son palindrómicas<br />El corte puede ser:<br /><ul><li>Liso
  10. 10. Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)</li></ul>Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma enzima se podrán unir mediante otro enzima, una ADN ligasa<br />
  11. 11. ADN recombinante<br />
  12. 12. Formación de ADN complementario por hibridación<br /><ul><li>Tenemos dos tipos distintos de ADN
  13. 13. Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización).
  14. 14. Se devuelven las condiciones adecuadas y se produce la renaturalización.
  15. 15. Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos tipos de ADN
  16. 16. El porcentaje de hibridación está relacionado con el parentesco evolutivo
  17. 17. Estas técnicas permiten localizar enfermedades genéticas</li></li></ul><li>Síntesis de ADNc usando ARNm como molde<br />Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminación de intrones<br />Una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm. <br />La misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los intrones, y añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP. <br />Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula. <br />Se hibrida un oligoncleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de ARNm maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para comenzar a trabajar. <br />Se añade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G. <br />La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando la cadena de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc).<br />Se sintetiza la doble cadena<br />
  18. 18. AAAAAA 3’<br />5’<br />TTTTTT 5’<br />AAAAAA 3’<br />5’<br />TTTTTT 5’<br />3’<br />Transcriptasa inversa<br />ADNc<br />Degradación del ARN<br />TTTTTT 5’<br />3’<br />Síntesis de la otra cadena de ADN<br />ADN polimerasa I<br />Nucleasa S1 elimina el bucle<br />ADN de doble cadena<br />
  19. 19.
  20. 20. Clonación de ADN<br />En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador.<br />Estos organismos deben cumplir las siguientes características:<br />Crecimiento rápido<br />No debe ser patógeno<br />Debe favorecer la entrada del transgén<br />Debe ser muy bien conocido<br />Debe ser fácilmente manipulable<br />Escherichiacoli<br />
  21. 21. Vectores de clonación<br /><ul><li>Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.
  22. 22. Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
  23. 23. Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.</li></ul>Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.<br />
  24. 24. Tipos de vectores de clonación<br /><ul><li>Plásmidos
  25. 25. Virus bacteriófagos
  26. 26. Cósmidos
  27. 27. YAC’s (cromosomas artificiales de levadura)
  28. 28. Cromosomas artificiales de bacterias (BAC’s)
  29. 29. Cromosomas artificiales humanos</li></li></ul><li>Plásmidos<br /><ul><li>Son moléculas de ADN bicatenario circular.
  30. 30. Se localizan en las bacterias.
  31. 31. Tienen replicación independiente.
  32. 32. Genes propios (resistencias a antibióticos) que permiten seleccionarlos posteriormente
  33. 33. Facilidad para la manipulación.
  34. 34. Puntos de corte específicos para enzimas de restricción</li></li></ul><li>
  35. 35. Bacteriófagos<br /><ul><li>Virus que infectan bacterias
  36. 36. Incorporan material genético mediante el proceso de transducción.
  37. 37. Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material del antiguo huésped.</li></li></ul><li>Cósmidos<br /><ul><li>Consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago.
  38. 38. Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el material genético)
  39. 39. Lleva varios genes de plásmidos
  40. 40. Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos)
  41. 41. Tiene varios sitios de restricción
  42. 42. Permite transportar grandes cantidades de ADN.</li></li></ul><li>
  43. 43. Cromosoma artificial de levadura<br />Son vectores de clonación de alta capacidad. <br />Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.<br />
  44. 44.
  45. 45. Clonación de los fragmentos de ADN<br />Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos<br />Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido.<br />Se mezclan los fragmentos.<br />Obtención de plásmidos recombinantes.<br />Se juntan los plásmidos con bacterias. <br />Incorporación de los plásmidos por transformación bacteriana.<br />Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico.<br />Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no son resistentes).<br />
  46. 46.
  47. 47. Almacenamiento de genes clonados<br /><ul><li>Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.
  48. 48. La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo.
  49. 49. Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos.
  50. 50. Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc</li></li></ul><li>Identificación de clones<br />Una genoteca contiene muchos clones<br />Hay que identificar el que nos interesa<br />Sondas de ADN<br />Sondas de ADN<br /><ul><li>Oligonucleótidos de cadena sencilla
  51. 51. Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la secuencia de aminoácidos de la proteína
  52. 52. Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser identificadas</li></li></ul><li>Una vez localizadas, las colonias que contienen el gen de interés se cultivan en grandes cantidades<br />
  53. 53. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)<br />Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco tiempo.<br />La reacción es un proceso cíclico: <br />La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. <br />Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermusaquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). <br />Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. <br />
  54. 54.
  55. 55. Aplicaciones de la PCR<br />Amplificación de: <br /><ul><li> ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles…
  56. 56. ADN obtenidos de la escena de un crimen (medicina forense).
  57. 57. ADN de células embrionarias (diagnostico prenatal de trastornos genéticos)
  58. 58. ADN de genes virales (en células infectadas por virus difíciles de detectar, como el VIH)</li></ul>Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf<br />
  59. 59. OH<br />Secuenciación del ADN<br />* Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA).<br />*Elementos necesarios:<br /> - DNA polimerasa<br /> - Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar<br /> - Mezcla de los 4 desoxinucleósidostrifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)<br /> - Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidostrifosfato<br /> (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada uno de ellos)<br />Didesoxi nucleótido<br />(bloqueo de la síntesis de DNA)<br />Desoxi nucleótido<br />
  60. 60. Pasos de la secuenciación<br />Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonación)<br />Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples)<br />Mezcla de todos los componentes de la reacción<br />Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un ddNTP marcado<br />Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*<br />Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida.<br />Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color.<br />El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.<br />
  61. 61. Materiales necesarios para la secuenciación<br />Obtención de cadenas de distinto tamaño acabadas en un ddNTP*<br />Separación de fragmentos por tamaños e identificación por color<br />
  62. 62. El estudio de la genómica es el conocimiento del genoma completo y de las interacciones entre los genes que lo forman.<br />objetivo<br />Genómica<br />Identificación de genes codificadores de proteínas<br />Genes que interactúan entre sí<br />Comparación de genomas de distintas especies<br />
  63. 63. Genómica<br />Conocimiento del genoma completo<br />Identificación de genes<br />Rastreo de secuencias de inicio de transcripción<br />Comparación con genes conocidos<br />
  64. 64. Genómica<br />Interacciones entre los genes del genoma<br />Genes que interactúan entre sí<br />La expresión de un gen afecta a otros y varía en función de las condiciones<br />La expresión del genoma se evalúa con chips de ADN<br />
  65. 65. Ensayo de micromatrices de ADN<br />Sirve para saber si un tejido normal presenta genes alterados que podrían provocar una enfermedad<br />
  66. 66. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html<br />http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/<br />Animación secuenciación genoma humano<br /> <br />http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequencer.html#<br />
  67. 67. Proteoma<br />Conjunto de proteínas de una célula, tejido o genoma completo<br />PROTEÓMICA<br />Proteómica<br />Estudios sistemáticos de las proteínas codificadas por el genoma de un organismo.<br />El conjunto de proteínas supera con mucho al de los genes. Su importancia radica en que son ellas las que desempeñan las actividades celulares<br />
  68. 68. Ingeniería genética y medicina<br />
  69. 69. Secuencia de la proteína (insulina)<br />Síntesis de los ADN<br />Obtención de plásmidos recombinantes con los genes para formar las dos cadenas de la insulina.<br />Expresión en E. coli<br />Purificación y procesado químico<br />Obtención de insulina activa<br />
  70. 70. Los seres humanos difieren en un 0.1% del genoma. <br />Estas diferencias están localizadas en regiones cromosómicas concretas.<br />Estas zonas se usan como marcadores genéticos<br />Con la identificación de los marcadores se hace la huella genética (método de Southernblot)<br />La comparación de huellas genéticas permite resolver casos policiales.<br />
  71. 71. MÉTODO DE SOUTHERN BLOT<br />
  72. 72. Ingeniería genética y medicina<br />
  73. 73. Ingeniería genética y agricultura<br />Obtención de plantas transgénicas<br />Resistencia a herbicidas<br />Mejora del producto<br />Plantas farmacéuticas<br />Se introduce un gen de E. coli que permite usar mayores concentraciones de herbicidas sin dañar a la planta de interés, y eliminando malas hierbas.<br />Las plantas producen sustancias medicinales, vacunas o anticuerpos (planticuerpos). <br />Se mejora el valor nutricional del producto, por ejemplo añadiendo beta-caroteno al arroz<br />
  74. 74.
  75. 75. Ingeniería genética y medio ambiente<br />Biorremediación<br />Bioadsorción<br />Biolixiviación<br />Uso de bacterias modificadas para degradar materia orgánica (petróleo)<br />Obtención de metales a partir de minerales de baja ley<br />Fijación de metales pesados a la superficie de la célula para limpieza de suelos<br />
  76. 76. Ingeniería genética y ganadería<br />MEJORA DE RAZAS<br />PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS<br />ESTUDIO DE ENFERMEDADES HUMANAS<br />Obtener razas mas resistentes, mas productivas, con mayor desarrollo, resistentes a condiciones más difíciles<br />Se usan animales transgénicos.<br />Se pueden obtener sustancias de interés como proteínas humanas para combatir enfermedades:<br />Enfisema hereditario<br />Factores de coagulación<br />Se estudia la expresión de genes humanos en organismos transgénicos<br />

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