1. DNADNA

2. DNA ESTRUCTURADNA ESTRUCTURA
LALA
ESTRUCTURAESTRUCTURA
DEL ADN ESTADEL ADN ESTA
DEFINIDA PORDEFINIDA POR
LA SECUENCIALA SECUENCIA
DE LAS BASESDE LAS BASES
NITROGENADANITROGENADA
S EN LAS EN LA
CADENA DECADENA DE
NUCLEOTIDOSNUCLEOTIDOS

3. ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADASESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS
DEL DNA Y RNADEL DNA Y RNA

5. A G C T
Hombre, H.sapiens 0.29 0.18 0.18 0.31
Bovino, Bos taurus 0.26 0.24 0.23 0.27
Levadura, S.cerevisiae 0.30 0.18 0.15 0.29
Mycobacterium sp. 0.12 0.28 0.26 0.11
Composición en bases del DNA en algunas especies

6. 1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1
Es decir, A+G = C+T
2. En todos los DNA estudiados, la proporción molar
de A es igual a la de T, y la de G igual a la de C.
Es decir, A = T y G = C
Reglas de Chargaff

7. 1. El DNA es una doble hélice
plectonémica y dextrógira,
con un paso de rosca de 3.4 nm
3.4 nm
Modelo de Watson - Crick, A

8. Modelo de Watson-Crick, B
2. Cada una de las dos hélices es un polinucleótido entrelazado con
el otro de manera que su polaridad es opuesta (es decir, corren en
sentido antiparalelo)
5’
3’ 5’
3’

9. 3. El eje ribosa-fosfato se sitúa
hacia el exterior de la doble hélice,
en contacto con el solvente
4. Mientras que las bases nitrogenadas
(anillos planares) se sitúan, apiladas,
hacia el interior de la estructura, en un
entorno hidrofóbico
Modelo de Watson-Crick, C

10. 5. Las bases están situadas en planos aproximadamente
perpendiculares al eje mayor de la doble hélice. La distancia
entre planos es de 0.34 nm
Modelo de Watson-Crick, D
0.34 nm

11. Modelo de Watson-Crick, E
N
N
N
N
N
HH
N N
O
O
CH3
H
A
T
6. Cada base interacciona
con su opuesta a través de
enlaces de hidrógeno, y de
manera que:
(a) Adenina (A) sólo puede
interaccionar con timina (T)
(y viceversa), a través de dos
puentes de hidrógeno, y

12. N
N
N
N
O
H
N
H
H
N N
O
N
H
H
G
C
(b) Guanina (G) sólo
puede interaccionar con
citosina (C) (y viceversa),
a través de tres puentes
de hidrógeno

13. 3’
2’
1’
5’
4’
7. La base está situada
en posición anti-8. La desoxirribosa
en forma furanósica
9. El anillo furanósico está
en conformación endo-2’
Modelo de Watson-Crick, F

14. 10. El eje de la doble hélice
no pasa por el centro geométrico
del par de bases. Esto determina
que la hélice presente un surco
ancho y un surco estrechoSurco
ancho
Surco
estrecho
Modelo de Watson-Crick, G

15. Paso de rosca 3.4 nm
Distancia entre 0.34 nm
planos de bases
Pares de bases/vuelta 10
Anchura 2.4 nm
Geometría de la doble hélice (DNA-B)
0.34
3.4
2.4

16. Interacciones débiles que mantienen la estructura del DNA
1. Enlaces de hidrógeno entre
bases complementarias
2. Interacciones hidrofóbicas
entre planos de bases contiguos
(int. de apilamiento, stacking)
3. Interacciones iónicas del fosfato
con moléculas electropositivas
(histonas, poliaminas, etc.)

17. 1. Compatible con los datos cristalográficos
2. El modelo predice una determinada densidad lineal que se
cumple para todos los DNAs conocidos
3. El DNA rico en GC debe ser más difícil de desnaturalizar que
el rico en AT. Esta predicción se cumple perfectamente.
4. El estudio de frecuencias de vecino más próximo (A.Kornberg)
sólo es compatible con un modelo complementario y antiparalelo
p.e.: el par AG tiene la misma frecuencia que el par CT; AT tiene
la misma frecuencia que TA, y así sucesivamente.
Pruebas experimentales de la estructura del DNA

18. A B Z
Grosor 2.6 2.4 1.8
Giro Dextro Dextro Levo
Bases/vuelta 11 10.4 12
P.de rosca 2.5 3.4 4.5
Inclinación 19º 1º 9º
plano bases
Distintas formas del DNA

19. DNA-A
1.Doble hélice plectonémica y dextró-
gira
2. Planos de bases oblicuos respecto
al eje de la doble hélica
3. Propio de RNAs en doble hélice, o
de híbridos DNA-RNA
4. Más ancha y corta que DNA-B

20. DNA-Z
1. Doble hélice plectonémica y levógira
2. Zonas de secuencia alternante -GCGC-
3. Conformación de G es syn- en lugar de
anti-
4. Más estrecha y larga que DNA-B

22. Desnaturalización del DNA
T, ºC
% Incremento
Absorbancia a
260 nm
La desnaturalización
térmica del DNA sigue
una curva sigmoide. El
punto medio, Tm, está
relacionado con el conte-
nido en G+C. Así, la muestra
B tiene un mayor contenido
en G+C que A.

23. La temperatura de fusión (Tm) necesaria para
desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto
medio de la reacción ADN doble hélice → ADN hélice
sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en
G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de
fusión (Tm).

24. El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado
con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta
(UV) a 2.600 . El menor grado de absorción se produce
en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando
se produce la desnaturalización pasando a estado de
hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la
absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de
hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo
aumenta la absorbancia.
Efecto Hipo crómico del DNA

25. EFECTO HIPOCROMICOEFECTO HIPOCROMICO

26. ¿Para qué purificar DNA?¿Para qué purificar DNA?
Aplicaciones

27. AplicacionesAplicaciones
ForenseForense
Dx enfermedades infecciosasDx enfermedades infecciosas
Dx enfermedades congénitasDx enfermedades congénitas
Clonación de GenesClonación de Genes
GenómicaGenómica
Control de calidad microbiológicoControl de calidad microbiológico
BiodiversidadBiodiversidad
Identificación de especiesIdentificación de especies

28. ¿Cómo purificar DNA?¿Cómo purificar DNA?

29. Los 3 pasos básicos para purificar DNALos 3 pasos básicos para purificar DNA
Lisis celular
Fraccionamiento de los ácidos nucleicos
Concentración de los ácidos nucleicos
1.1.
2.2.
3.3.

30. 1. Lisis celular1. Lisis celular
Lisis enzimática de tejidos animales
Tampón de lisis con detergente. Algunos protocolos
Con proteinasa K.
Lisis de bacterias o levaduras.
Lisozima (Bacterias Gram-positivas)
liticasa (levaduras).
Detergente y pH alcalino para plásmidos.
Homogenizadores mecánicos
Agitador mecánico, a la muestra se adicionan esferas.
Congelación descongelación
Se usa nitrógeno liquido.

31. 2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicos2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicos
Preparación de lisados crudos
No se purifica
Salting-out methods
Se precipitan las proteinas y
contaminantes con sales de acetato de
amonio o potasio
Fraccionamiento con solventes
orgánicos
Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico

32. 3. Concentración de ácidos nucleicos3. Concentración de ácidos nucleicos
Precipitación con:
Etanol
Isopropanol
En presencia de sales

33. 2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE
DNADNA
Electroforesis

34. ¿Cómo hacer una electroforesis de¿Cómo hacer una electroforesis de
DNA?DNA?

35. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA

36. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA

37. ¿Cómo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa?

38. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA

40. 1
2
3
5
4
6
7

41. Propiedades estructurales del DNAPropiedades estructurales del DNA
5’p OH3’
3’OH p5’
Las hebras de una molecula de DNA son
Antiparalelas y complementarias

42. Complementaridad del DNAComplementaridad del DNA
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
5’p
p 5’
OH3’
3’ OH
Puentes
Hidrógeno

43. 95°C95°C
T G T T C A G CA
A C A A G T C GT
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
Desnaturalización/reasociación del DNADesnaturalización/reasociación del DNA

44. T G T T C A G CA
AC AAG T CG T
Reasociación solo con cadenas complementariasReasociación solo con cadenas complementarias

45. HibridaciónHibridación
Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleicosEs la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos
complementarias para formar un duplex ocomplementarias para formar un duplex o
molécula de cadena doble.molécula de cadena doble.
• Posibles híbridaciones
DNA-DNA
DNA-RNA

46. dsDNA ssDNA apaream
iento
inicial
dsDNA
DesnaturalizaciónDesnaturalización
ReasociaciónReasociación
RenaturalizaciónRenaturalización
T° T°

47. Molécula de DNAcs o
RNA homóloga a una
secuencia de DNAcs o
RNA con la que se
hibrida de forma
estable y específica por
asociación de bases
complementarias.

48. SondasSondas
UnaUna sondasonda es un fragmento de DNA que:es un fragmento de DNA que:
– Se puede marcar para ser identificado y medidoSe puede marcar para ser identificado y medido
– Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridadSe hibrida a un DNA gracias a su complementaridad
Tipo de marcajesTipo de marcajes
– Radioactivo (Radioactivo (3232
P,P, 3535
S,S, 1414
C,C, 33
H)H)
– FluorescenteFluorescente
– Biotinilación (avidina-streptavidina)Biotinilación (avidina-streptavidina)

49. Hibridación de DNAHibridación de DNA
inmobilizado en soportes deinmobilizado en soportes de
hibridacion:hibridacion:
NitrocelulosaNitrocelulosa
Membranas de nylonMembranas de nylon
Southern BlotSouthern Blot

50. NucleasasNucleasas
Endonucleasa
5’ Exonucleasa 3’ Exonucleasa

51. Southern BlotSouthern Blot
Enzimas de retricción
DNA de varios
tamaños
Electroforesis en gel de agarosa
gel
Denaturación y transferencia a NC
blot

52. Hibridación de la sonda
Visualización

53. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:
1. electrophoresis1. electrophoresis

54. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:
2. transfer to a filter/membrane2. transfer to a filter/membrane

56. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:
3. hybridization to a labeled unique probe3. hybridization to a labeled unique probe

59. Testigopositivo
Testigonegativo
muestra
MUESTRA
Células,
microorganismos
autoradiografía
hibridacíón
lavado
sondas
Gel de agarosa
Ectracción y
Denaturalización del ADN
Filtro de
nitrocelulosa
transferencia
Separación de
filamentos
de ADN
ELECTROFORESIS

60. Southern Blot

61. FILTRO DE
NITROCELULOSA
COLONIAS REPLICA EN
PLACA CON FILTRO
FILTRO CON COLONIAS
COLONIAS
ADN DE LAS COLONIAS
EN EL FILTRO
AUTORADIOGRAFÍA
COLONIA
- Réplica en placa con filtro
- Lisis
- Secado
- Hibridación con sonda radioactiva

62. HibridacionHibridacion in situin situ por fluorescenciapor fluorescencia

63. HibridacionHibridacion in situin situ por fluorescenciapor fluorescencia