Cultivo de pleurotus ostreatus

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Cultivo de pleurotus ostreatus

  1. 1. Cultivo de Pleurotus ostreatus . Graciela Colman Mariana Sanabia Álvaro Soto 3º Biología CeRP del Sur Asesoramiento técnico: Prof. Ricardo Indarte .
  2. 2. Objetivo : <ul><li>Cultivar hongos pertenecientes a la especie Pleurotus ostreatus utilizando el instrumental con que cuenta el laboratorio de nuestra institución educativa. </li></ul><ul><li>Aprender a utilizar técnicas de laboratorio, vinculando tres asignaturas: Taller de laboratorio, Botánica y Microbiología. </li></ul>
  3. 3. Un poco de información… <ul><li>Los hongos son organismos eucariotas pertenecientes al reino Fungi. </li></ul><ul><li>Inicialmente se los consideró como plantas, pero presentan algunas características importantes que los diferencian de ellas: </li></ul><ul><li>La pared celular de los hongos no está compuesta de celulosa, como las plantas, sino de quitina. </li></ul>La quitina es un polisacárido que también forma el exoesqueleto de los artrópodos. <ul><li>No poseen pigmentos fotosintéticos, como clorofilas, entre otros. Por ende, no son capaces de realizar fotosíntesis. </li></ul>
  4. 4. <ul><li>No forman verdaderos tejidos. Sus células están juntas y muy relacionadas, pero no cumplen una función en conjunto. </li></ul><ul><li>Las células de los hongos se denominan hifas y el conjunto de todas las hifas de un hongo se conoce como micelio . </li></ul><ul><li>Dentro del reino Fungi encontramos tres grandes grupos: Los mohos, las levaduras y los hongos con cuerpo fructífero. </li></ul><ul><li>Pleurotus ostreatus pertenece a los hongos con cuerpo fructífero. </li></ul>La parte visible de los hongos “con sombrero” no es todo el hongo, sino su fructificación. El sombrero es una estructura especializada en la reproducción. En muchas especies es comestible .
  5. 5. El micelio subterráneo es el micelio primario . El sombrero está formado por el micelio secundario . <ul><li>Pleurotus ostreatus pertenece concretamente al filo Basidiomycota. </li></ul><ul><li>A este filo pertenecen, entre otros, todos los hongos cuyo cuerpo fructífero tiene forma de sombrero. </li></ul>
  6. 6. <ul><li>En la parte inferior del sombrero pueden observarse láminas. </li></ul><ul><li>Son las responsables de la reproducción asexual del hongo: Tienen a cada lado una capa de células, llamadas basidios, donde se originan las esporas. </li></ul>Las esporas son liberadas fuera del hongo y germinan al caer en un sustrato favorable, dando origen cada una a un nuevo hongo.
  7. 7. El cultivo del Pleurotus ostreatus es simple y requiere de poca inversión inicial. El sistema más común de siembra es en bolsas.
  8. 8. Como sustrato se puede usar casi cualquier elemento que contenga celulosa y lignina: pajas, aserrines, hojas, marlos molidos, subproductos de los cultivos de café, algodón, arroz, etc.
  9. 9. Funcionamiento del instrumental utilizado.
  10. 10. Autoclave: <ul><li>Para la esterilización del material y medios de cultivo utilizamos un autoclave. El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de cultivo in vitro, fue inventado por el microbiólogo francés Charles Chamberland, en 1879. </li></ul>
  11. 11. <ul><li>El proceso de esterilización en autoclave se compone de 3 fases : </li></ul><ul><li>Fase de purgado: La resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire que comienza a salir por la válvula de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización. </li></ul><ul><li>Fase de esterilización: Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización. Este proceso toma entre 15-20 minutos. </li></ul><ul><li>Fase de descarga : Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor. La presión y temperatura del calderín empieza a bajar poco a poco. </li></ul>
  12. 12. Estufa de cultivo: <ul><li>Tienen una cámara interior de acero inoxidable con soporte para estantes desmontables y posee dos puertas. La temperatura se calibra digitalmente y se controla mediante un termómetro incorporado. La temperatura fue 28ºC. </li></ul><ul><li>Es el aparato donde se incuban bacterias y hongos a una temperatura adecuada y constante, para realizar luego diversos análisis en el laboratorio.   </li></ul>
  13. 13. Desarrollo de la experiencia.
  14. 14. Materiales : <ul><li>De vidrio : </li></ul><ul><li>- Cajas de Petri. </li></ul><ul><li>- Matraces. </li></ul><ul><li>- Tubos de ensayo. </li></ul><ul><li>- Vaso de bohemia. </li></ul><ul><li>- Probeta </li></ul><ul><li>Otro instrumental : </li></ul><ul><li>- Horno microondas. </li></ul><ul><li>- Balanza. </li></ul><ul><li>- Mechero Bunsen. </li></ul><ul><li>Ansas. </li></ul><ul><li>Bisturí. </li></ul><ul><li>Pinzas. </li></ul><ul><li>- Tapabocas. </li></ul><ul><li>- Guantes de látex y de amianto. </li></ul><ul><li>- Autoclave. </li></ul><ul><li>- Estufa de cultivo. </li></ul><ul><li>Medios de cultivo : </li></ul><ul><li>- Czapek. </li></ul><ul><li>- Plate count agar. </li></ul><ul><li>- Antibiótico. </li></ul><ul><li>- Paja. </li></ul><ul><li>- Agua destilada. </li></ul><ul><li>Cuerpos fructíferos del hongo Pleurotus ostreatus. </li></ul>
  15. 15. Procedimiento : 1º Etapa : <ul><li>Preparación de los medios de cultivo : </li></ul><ul><li>Dilución del medio en agua destilada. </li></ul><ul><li>Esterilización del medio y de las cajas de Petri. </li></ul><ul><li>Añadidura de antibiótico. </li></ul><ul><li>Llenado de cajas de Petri al calor del mechero. </li></ul><ul><li>2) Extracción e inoculación de micelio : </li></ul><ul><li>Extracción de trozos de micelio con bisturí y pinzas. </li></ul><ul><li>Colocación de los trozos en las cajas de Petri con el medio solidificado. </li></ul><ul><li>Se llevan las cajas inoculadas a estufa de cultivo a 28ºC. </li></ul>
  16. 17. <ul><li>3) Multiplicación del micelio : Una vez que el micelio primario prolifera en las cajas de los pasos anteriores, se multiplica para obtener más cantidad. </li></ul><ul><li>Se preparan más cajas con medio de cultivo. </li></ul><ul><li>Se recortan trozos de medio sólido con micelio primario y se inoculan en las nuevas cajas. </li></ul><ul><li>Las nuevas cajas inoculadas se llevan a estufa de cultivo a 28ºC. </li></ul><ul><li>2º Etapa : 1) Preparación del medio donde se hará fructificar el micelio primario de Pleurotus ostreatus: </li></ul><ul><li>Se arman paquetes de paja envueltos en diario y se esterilizan en autoclave. </li></ul><ul><li>Humidificación de la paja con agua destilada para favorecer la fructificación. </li></ul>
  17. 18. <ul><li>2) Inculación del micelio primario en la paja : </li></ul><ul><li>En una bolsa de nylon, se colocan capas alternadas de paja y de micelio primario. </li></ul><ul><li>La bolsa se mantiene cerrada y en condiciones de humedad y luz moderada. </li></ul>Pleurotus ostreatus demora aproximadamente tres meses en fructificar.
  18. 20. Procedimiento alternativo: Esporada . - En un vaso de bohemia se coloca círculo de papel blanco con un orificio en el centro. - Sobre él, se coloca un cuerpo fructífero de Pleurotus ostreatus (el estípite se sostiene en el agujero de la hoja). - Sobre el vaso de bohemia se coloca una campana de vidrio, que puede ser un vaso de bohemia más grande dado vuelta. Se espera que, dos o tres días después, la hoja contenga las esporas que cayeron de las láminas del sombrero. Esas esporas se inoculan en cajas de Petri con medio de cultivo.
  19. 22. Resultados : <ul><li>Nos enfrentamos a nuevas limitaciones: Ventajas y desventajas del laboratorio. </li></ul><ul><li>Descartamos uno de los medios de cultivo, y nos quedamos con Czapek. </li></ul><ul><li>De cada generación de placas con micelio primario se contaminó el 50%: Las condiciones no eran del todo favorables para lograr esterilidad absoluta. </li></ul>
  20. 23. <ul><li>Luego de inocular la paja, descubrimos que el hongo que habíamos cultivado no era Pleurotus ostreatus: </li></ul>- Al microscopio descubrimos que era un Deuteromycota . - Compitió con Pleurotus ostreatus, colonizando el medio de cultivo. Nos vimos obligados a repetir la experiencia desde cero .
  21. 24. <ul><li>La repetición fue exitosa: Logramos obtener micelio primario de Pleurotus ostreatus. </li></ul>
  22. 25. <ul><li>La repetición retrasó los tiempos: </li></ul><ul><li>- Pleurotus ostreatus demora tres meses en fructificar, y la inoculación en la paja se hizo hace seis semanas. </li></ul>Aún no podemos saber si obtendremos micelio secundario de Pleurotus ostreatus. <ul><li>Modificaciones para la repetición: A la paja le agregamos aserrín, que ayuda a mantener la humedad y provee una fuente de lignina adicional (Pleurotus ostreatus es un hongo ligninolítico: degrada lignina). </li></ul><ul><li>El método de esporada en campana de vidrio no funcionó: Suponemos que el hongo no era suficientemente fresco. </li></ul>
  23. 26. Conclusiones finales: <ul><li>Aprendimos técnicas de laboratorio esenciales en la enseñanza y el aprendizaje de la Biología. </li></ul><ul><li>Comprendimos las limitaciones y las ventajas de un laboratorio de Biología de formación docente. </li></ul><ul><li>Comprobamos que toda práctica experimental está inmersa en un contexto determinado, y que éste determina en buena medida los resultados de la misma. </li></ul>
  24. 27. FIN. ¡Muchas gracias!
  25. 28. Staff del “Gruphongo”. Los responsables : Nuestro sincero agradecimiento al Profesor Ricardo Indarte, sin cuya ayuda este proyecto no hubiese sido posible .

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