Este documento describe métodos para analizar la leche, incluyendo el recuento de placa y la prueba de reductasa. La prueba de reductasa mide indirectamente la densidad bacteriana en la leche mediante el tiempo requerido para la decoloración de un colorante por la actividad microbiana. El recuento de placa involucra diluir la muestra de leche, cultivarla en placas, e incubar e contar las colonias para estimar la cantidad de bacterias. También se proporciona información sobre los materiales e instrumentos necesarios y los pas

1. Dra. Maria Guadalupe Garcia M
ggm2096@hotmail.com

2. ÁREA PARAANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO

3.  Este método es un indicador indirecto de la
población microbiana de la leche y depende de la
actividad metabólica de los diferentes
microorganismos presentes de la leche bajo las
condiciones del test.
 Este método mide indirectamente la densidad
bacteriana en la leche, en términos de intervalo de
tiempo requerido después del comienzo de la
incubación, para que una mezcla colorante-leche
de un color característico se decolore hasta el
blanco.

4.  Tubos de ensayo con tapa rosca
 Pipetas de10 y 1 ml
 Frasco para la muestra
 Baño maria a 36ºC + 1ºC

5.  Colorante azul de metileno (una tableta de 8.8mg
de tiocianato de azul de metileno en 200 cc de
agua destilada)
Mantener en refrigeracion
(TODO EL MATERIAL UTILIZADO EN ESTE
TEST DEBE SER ESTERIL)

6. 1. Identificación de los tubos en forma legible
2. Agitación vigorosa de la muestra
3. Verter 10cc de la muestra en el tubo
4. Agregar 1cc de Tiocianato de azul de metileno
5. Colocar la tapa sin ajustar
6. Poner en B.M a 36ºC ± 1ºC sin agitar ni invertir
7. Una vez que la muestra alcanza temp de 36ºC ,
ajustar la tapa del tubo e invertir 3 veces
Si en esta ultima etapa luego de la inversión se
produce la decoloración se informara el tiempo
de reductasa como TRAM P.I. (Preincubacion)

7. 8. De no existir decoloración incubar por 30
minutos. Al final de este periodo invertir
suavemente los tubos una vez. Si se ha producido
la decoloración informar como TRAM 30
minutos
9. Si la muestra continua sin decolorarse, incubar
por una hora mas
10. Si al final de este periodo se produce
decoloración informar TRAM 1 hora

8.  Bacterias coliformes:
Son bacilos Gram negativos, aerobios facultativos,
no formadores de esporas, que fermentan la
lactosa, con producción de acido y gas, y
pertenecen comúnmente a los generos Escherichia,
Aerobacter, Klebsiella.Una fuente de estos
organismos es el tracto intestinal de los animales
de sangre caliente.

9.  El método se basa en colocar la muestra de leche
en un medio de cultivo solido y selectivo (agar-
bilis-rojo-violeta) incubarlo en condiciones
adecuadas y estimar la cantidad de bacterias
coliformes en base al numero de colonias rojas
obscuras que se desarrollen.

10. INSTRUMENTAL
 Estufa
 Pipetas volumétricas de 2cc
 Pipetas de 25cc
 Cajas de petri de 10cc de diametro
 Aparatos para recuento de colonias
 Baño de agua a 45ºC± 1ºC
 Matraz erlenmeyer de 250cc

11.  Agar bilis-rojo-violeta o Agar Mac Conckey
 MEDIO DE DILUCIÓN
 Agua peptonada

12. 1. En condiciones asepticas transferir 2cc de muestra a cada
caja de petri
2. Anadir 10 a 15 cc de medio de cultivo a 45ºC ± 1ºC
3. Con movimientos circulares horizontales mezclar
cuidadosamente el medio de cultivo con la muestra
4. Solidificar dejando la caja de Petri en reposo durante 5 a
10 minutos sobre una superficie horizontal,
5. Inmediatamente esparcir sobre la superficie solidificada
aprox 4cc de medio de cultivo a 45ºC± 1ºC para formar
una capa delgada (evitar desarrollo de microorg en la
parte superficial) y enfriar hasta completa solidificacion
6. Incubar cultivos colocando las cajas de petri en posicion
invertida dentro de la estufa regulada a 32ºC± 1ºC
manteniendo alli durante 24 horas

13. 1. PIPETAS SEROLÓGICAS DE PUNTA ANCHA DE 1, 5 CM3
2. Y 10 CM3
3. GRADUADAS EN 1/10 DE UNIDAD.
4.
5. CAJAS PETRI DE 90 MM X 15 MM,.
6.
7. ERLENMEYER Y/O FRASCO DE BOCA ANCHA DE 100 CM3, 250 CM3, 500 CM3 Y 1 000 CM3 CON TAPA DE ROSCA
AUTOCLAVABLE.
8.
9. TUBOS DE 150 MM X 16 MM
10.
11. GRADILLAS
12.
13. CONTADOR DE COLONIAS
14. BALANZA DE CAPACIDAD NO SUPERIOR A 2 500 G Y DE 0,1 G DE SENSIBILIDAD.
15.
16. BAÑO DE AGUA REGULADO A 45°C ± 1°C.
17.
18. INCUBADOR REGULABLE (25°C - 60°C)
19. AUTOCLAVE.
20. REFRIGERADORA PARA MANTENER LAS MUESTRAS Y MEDIOS DE CULTIVO
21. CONGELADOR PARA MANTENER LAS MUESTRAS A TEMPERATURA DE -15°C A -20°C

14.  Agar para recuento en placa (Plate Count Agar).
Preparación
MEDIO DE DILUCIÓN
 Agua peptonada al 0,1 % (diluyente)

15. 1. Para cada dilución el ensayo se hará por duplicado.
En cada una de las cajas Petri bien identificadas se
depositará 1 cm3 de cada dilución. Para cada
depósito se usará una pipeta distinta y esterilizada.
2. Inmediatamente, verter en cada una de las placas
inoculadas aproximadamente 20 cm3 de agar
para recuento en placa–PCA, fundido y templado a
45°C ± 2°C. La adición del medio no debe pasar
de más de 45 minutos a partir de la preparación de la
primera dilución

16. 1. Cuidadosamente, mezclar el inoculo de siembra
con el medio de cultivo imprimiendo a la placa
Movimientos de vaivén: 5 veces en el sentido de
las agujas del reloj y 5 veces en el contrario.
2. Como prueba de esterilidad verter agar en una
caja que contenga el diluyente sin inocular. No
debe haber desarrollo de colonias.
3. Dejar reposar las placas para que se solidifique
el agar.
4. Invertir las cajas e incubarlas a 30°C ± 1°C por
48 a 75 horas.

17. 5. No apilar más de 6 placas. Las pilas de placas deben estar
separadas entre sí, de las paredes y del techo de la
incubadora.
6. Pasado el tiempo de incubación seleccionar las placas de
dos diluciones consecutivas que presenten entre 15 y 300
colonias y utilizando un contador de colonias, contar
todas las colonias que hayan crecido en el medio, incluso
las pequeñitas, pero, se debe tener cuidado para no
confundirlas con partículas de alimentos o precipitados,
para esto, utilizar lupas de mayor aumento.
7. Las colonias de crecimiento difuso deben considerarse
como una sola colonia si el crecimiento de este tipo de
colonias cubre menos de un cuarto de la placa; si cubre
más la caja no será tomada en cuenta en el ensayo.
8. Anotar el número de colonias y la respectiva dilución.