Virologia Diagnóstico Técnicas PCR
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O documento discute várias técnicas de diagnóstico virológico, incluindo métodos de amplificação como PCR em tempo real, extração de ácidos nucleicos, e aplicações destas técnicas para detecção e quantificação de vírus.
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- 3. real-time PCR Técnicas TÉCNICAS Biologia Molecular Métodos de Amplificação Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação Métodos de Hibridização Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 3
- 4. 4 Extracção Ácidos Nucleicos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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- 9. real-time PCR Técnicas Extracção Ácidos Nucleicos Biologia Molecular Avaliação Ácidos Nucleicos por Espectofotometria UV Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm. [dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL) [ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 9
- 10. 10 Técnicas de Amplificação AN Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
- 11. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 11
- 12. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular Amplifica um fragmento de DNA especifico; Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de cópias do fragmento pretendido; Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de sequência conhecida; 5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ 3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’ Região Alvo Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 12
- 13. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular MISTURA DE REACÇÃO: DNA Primers: Oligonucleótidos de cadeia simples com sequência complementar às sequências alvo do ADN (idealmente 20-24 nucleótidos); Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção; Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleótidos e estabilidade da Taq; dNTP’s: Nucleótidos livres (A, T, C, G); Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC) que efectua a cópia da sequencia alvo do ADN. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 13
- 14. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular PROCEDIMENTO 1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC); 2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC); 3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC); 5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ ATCCGAT (…) – 5’ 3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’ 5’ – (…) ATGCGTA Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 14
- 15. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular PROCEDIMENTO 4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo; FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 15
- 16. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular Electroforese em Gel de Agarose: Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu peso molecular; DNA e RNA possuem carga eléctrica negativa migram para o pólo positivo (quanto mais pequenas mais migram); Brometo de Etídeo que se vai intercalar na dupla hélice de ADN e possibilitar a visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV; Amostras da PCR carregadas no gel; Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 16
- 17. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular Pólo Positivo (+) Pólo Negativo (-) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 17
- 18. real-time PCR Técnicas Polymerase Chain Reaction Biologia Molecular APLICAÇÕES Detecção de sequências específicas de DNA viral Detecção AdV em amostras respiratórias Detecção EBV em biópsias Nasofaringe Detecção JCV em LCR ... DESVANTAGENS Altamente sensível a contaminação com quantidades residuais de DNA. Falsos positivos e artefactos. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 18
- 19. Restriction real-time PCR Fragment Técnicas Length Biologia Polymorphism (RFLP) Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 19
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- 23. Restriction real-time PCR Fragment Técnicas Length Biologia Polymorphism (RFLP) Molecular APLICAÇÕES Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com patologias Detecção variantes EBV – Associação com agressividade ... DESVANTAGENS Todas as do PCR Sensível a contaminação por DNAses Artefactos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 23
- 24. Single Strand real-time PCR Conformation Técnicas Biologia Polymorphism (SSCP) Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 24
- 25. Single Strand real-time PCR Conformation Técnicas Biologia Polymorphism (SSCP) Molecular Baseada na técnica da PCR; Análise de polimorfismos/mutações; Diferenças de sequência de um único nucleótido são suficientes para que cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional diferente; Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia simples/desnaturadas) em função da sua conformação. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 25
- 26. Single Strand real-time PCR Conformation Técnicas Biologia Polymorphism (SSCP) Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 26
- 27. Single Strand real-time PCR Conformation Técnicas Biologia Polymorphism (SSCP) Molecular APLICAÇÕES Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com agressividade ... DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Leitura gel poliacrilamida Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
- 28. real-time PCR Técnicas ReverseTranscriptase PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 28
- 29. real-time PCR Técnicas ReverseTranscriptase PCR Biologia Molecular Baseada na técnica da PCR; Análise de expressão de mRNA; Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA; Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA; mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’ TTTTTTTTTT – 5’ Molécula Alvo Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 29
- 30. real-time PCR Técnicas ReverseTranscriptase PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 30
- 31. real-time PCR Técnicas ReverseTranscriptase PCR Biologia Molecular VANTAGENS Permite fazer análise quantitativa da expressão de mRNA. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 31
- 32. real-time PCR Técnicas ReverseTranscriptase PCR Biologia Molecular APLICAÇÕES Expressão mRNA viral Avaliação actividade viral DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
- 33. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 33
- 34. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels Limitations of end-point PCR: Poor precision Low sensitivity Short dynamic range Low resolution Size-based discrimination Ethidium bromide for staining does not allow for accurate quantitation Requires post-PCR processing Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 34
- 35. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular Monitoriza a fluorescência emitida durante a reacção de PCR como um indicador da produções de amplicões em cada ciclo de PCR; Monitorização em tempo real; Detecção da amplificação nos estádios precoces da reacção – maior precisão; Alvo: DNA ou RNA Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 35
- 36. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 36
- 37. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 37
- 38. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 38
- 39. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular Exponential If 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise Linear PCR phases in linear view High variability. Reaction components Plateau are being consumed and PCR products are starting to degrade. [DNA] Linear Plateau End-point analysis. The reaction has stopped and if left for long – Exponential Cycle # degradation of PCR products. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 39
- 40. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument. Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold Rn – (Rn-baseline) NTC – no template control DRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 40
- 41. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular CT = threshold cycle Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual é detectado sinal Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 41
- 42. real-time PCR Técnicas RealTime PCR Biologia Molecular Aplicações Quantificação carga viral Monitorização carga viral Monitorização terapêutica VANTAGENS Amplificação monitorizada em tempo real Ausência de processamento pós PCR (baixo risco de contaminação) Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA) Rápido, Específico, sensível e reprodutível Quantitativo Barato Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 42
- 43. real-time PCR Técnicas Sequenciação Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 43
- 44. real-time PCR Técnicas Sequenciação Biologia Molecular Usada para determinar a sequência de nucleótidos Método de sequenciação mais utilizado – método didesoxi Adição de didesoxinucleótidos que terminam a reacção de polimerização 3’ OH – necessário para adição do nucleótido seguinte Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 44
- 45. real-time PCR Técnicas Sequenciação Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 45
- 46. real-time PCR Técnicas Sequenciação Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 46
- 47. 47 Técnicas de Hibridização Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
- 48. real-time PCR Técnicas Técnicas de Hibridização Biologia Molecular Alvo – DNA ou RNA Utilização de sondas específicas Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 48
- 49. real-time PCR Técnicas Captura Híbrida Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 49
- 50. real-time PCR Técnicas Captura Híbrida Biologia Molecular Principio da técnica Hibridização de Ácidos Nucleicos Amplificação sinal por Quimioluminescência Método semiquantitativo Método Hibridização amostras positivas com sondas específicas Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca Reacção com anticorpo secundário conjudado com FA Adição de reagente e detecção por quimioluminescência Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 50
- 51. real-time PCR Técnicas Captura Híbrida Biologia Molecular 45 minutes at 65ºC 60 minutes at 65ºC 15 minutes 30 minutes 60 minutes agitação Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 51
- 52. real-time PCR Técnicas Southern Blot Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 52
- 53. real-time PCR Técnicas Southern Blot Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 53
- 54. real-time PCR Técnicas Hibridização em tiras Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 54
- 55. real-time PCR Técnicas Hibridização em tiras Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 55
- 56. real-time PCR Técnicas Chips Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 56
- 57. real-time PCR Técnicas Chips Biologia Molecular Tipagem de vírus: HPV, HCV, HIV Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 57
- 58. real-time PCR Técnicas Chips Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 58
- 59. We ask the lab for a diagnosis, expecting a yes or no, but often end up with just a maybe… Professor Mark Pallen Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 59
- 60. Virologia Ano Lectivo 2010/11 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II