1. EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE
PROTEÍNAS
Ivson Cassiano
Mayla Abrahim

2. O que são proteínas heterólogas
heterólogo (he-te-ró-lo-go) adj (hétero+logo) 1
Que consiste em elementos diferentes.
Expressão heteróloga de proteína significa que uma
proteína é experimentalmente colocado em uma célula que
normalmente não fazem (ou seja, expressa) a proteína.
A expressão de proteínas funcionais em hospedeiros
heterólogos é um desafio da biotecnologia moderna.

3. Proteínas e sua importância
A sequência de aminoácidos bem como a função da
proteína, são determinadas pela sequência de pares de
bases no gene que a codifica. As proteínas são
essenciais à estrutura, à função, e ao
regulamento celular e são também responsáveis pela
homeostasia do organismo.
A expressão heteróloga de proteínas é muito
importante quando se pretende proceder ao estudo
funcional das mesmas.
A utilização de microrganismos geneticamente
modificados, capazes de sintetizar proteínas em grande
quantidade, apresenta, sob o ponto de vista econômico,
uma vantagem considerável em relação aos processos
clássicos de produção.

4. Os sistemas de expressão heteróloga
em proteínas têm vindo a ser
extensivamente utilizados nos dias de
hoje, nomeadamente na produção de
proteínas de interesse do ponto de
vista biotecnológico e medicinal .
EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS

5. Expansão e desafios da indústria de
biotecnologia:
 produção eficiente e controlada de proteínas
recombinantes
 diferentes sistemas de expressão: procariotos e
eucariotos
 inúmeras finalidades: diagnóstica, terapêutica e de
prevenção (vacinas)
Tecnologia de DNA recombinante:
 obter e combinar genes de uma variedade de fontes
 clonar e expressar genes em diferentes hospedeiros
 produção de grandes quantidades de proteínas
recombinantes

6. A clonagem de expressão permite obter o produto do gene
clonado.
O produto é utilizado para diferentes fins:
 O transcrito da sequência clonada (transcrição in vitro) pode
servir como sonda de hibridação.
•A proteína expressa pode servir para identificar o gene clonado,
numa biblioteca de expressão, por hibridação com o anticorpo
específico.
•O DNA recombinante pode servir para produzir proteínas de valor
comercial.

7. Relembrando:
 Clonagem gênica: isolamento, amplificação e
purificação de um gene ou de genes, a partir do
material genético de um dado organismo.
 Vetores: veículos de clonagem que permitem que os
fragmentos de DNA a serem clonados sejam
introduzidos e propagados em uma célula hospedeira
adequada.
 Célula hospedeira: células de fácil manipulação,
crescimento rápido e constituição genética bem
conhecida (ex: bactérias, leveduras, células de cultura
de tecidos de mamíferos e insetos).

8. Sistemas de expressão de proteínas
recombinantes:
 bactérias (Escherichia coli)
 leveduras (Pichia pastoris)
 baculovírus/células de inseto
 cultura de células de mamíferos
 células de plantas e plantas transgênicas
 animais transgênicos

9. Processo: Escolhendo o vetor
Aplicação da proteína expressada
Características da proteína
Solubilidade e localização celular
Tags
Preparar o vetor
Digestão ou Método
LIC
Preparar o Inserto
Plasmídeo ou DNA
PCR
Clonar o Inserto
no Vetor
Anelamento
Transformação
Transformação em
célula
de expressão
Indução
Determinação tempo e
temperatura
SDS-PAGE
Cultura de
células
Extração
Detergentes
Métodos
Físicos
Purificação
Coluna afinidade
Protases - Tags

10. Procedimento:
Isolar e preparar o DNA;
Escolher o vetor apropriado;
O fragmento de DNA a clonar é introduzido em
vectores de clonagem, formando-se o DNA
recombinante.
O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira
– transformação, que possui mecanismos
enzimáticos para a replicação do DNA e para a
síntese protéica;
Selecção e identificação de células que incorporam o
DNA recombinante;
Verificar se a proteína foi expressa;
Remoção e purificação das proteínas. -

11. Escolhendo o vetor
Organismos como plasmídeos, bacteriófagos, cosmídios, BAC (Bacterial
Artificial Chromosome) e YAC (Yeast Artificial Chromosome) utilizados
para transferir DNA/RNA para uma celular hospedeira.
Considerações importantes para escolher o melhor vetor de expressão:
- Aplicação da proteína expressada;
- Informações específicas sobre a proteína a ser expressada (sequência extra de
amina terminal)
- Estratégia de clonagem – preparo do inseto (compatibilidade entre sítio de
restrição e a região de leitura).
- Solubilidade e localização celular (citoplasma, periplasma ou corpo de inclusão)
- um local de reconhecimento onde as endonucleases o irão cortar.

12. Preparando o inserto de DNA
DNA de interesse
Utilizar uma enzima de alta
fidelidade;
Limitar o número de ciclos da reação;
Aumentar a concentração do DNA;
Aumentar a concentração de primers.

13. Células para clonagem E. coli
Vantagens:
Vasto conhecimento da genética e fisiologia
de E. coli
Diversidade de vectores de clonagem
Fácil controlo da expressão génica
Fácil crescimento com elevadas produções
Secreção do produto no meio de cultura
Desvantagens:
Não realiza modificações pós-traducionais e
tem capacidade limitada de formar pontes
dissulfídricas
Atividade biológica e imunogenicidade
podem diferir da proteína natural
Elevado conteúdo de endotoxinas
Falta de um mecanismo de secreção

14. Escolhendo a melhor célula
 A escolha da melhor célula competente
depende da natureza da proteína de
interesse:
Proteínas mais sensíveis a ação de
proteases;
Proteínas eucarióticas que possuem códons
próprios, também chamados de raros;
Proteínas insolúveis;
Proteínas tóxicas;

15. Deficiência de Protease
Linhagens B834, BL21, BLR, Origami ™B,
Rosetta™ 2, Tuner™;
São deficientes em proteases que possam
degradar as proteínas durante o processo de
purificação;
Proteínas se tornam mais estáveis nessas
linhagens;

16. Um pedaço de DNA pode ser inserido em
um plasmídeo, se tanto o plasmídeo circular
e a fonte de DNA têm sítios de
reconhecimento para a mesma
endonuclease de restrição.
Vetor de expressão

17. Clonagem num vector de expressão
plasmídico
Um pedaço de DNA pode ser
inserido em um plasmídeo, se
tanto o plasmídeo circular e a
fonte de DNA têm sítios de
reconhecimento para a mesma
endonuclease de restrição.
O plasmídeo e o DNA
estranho são cortados por
esta endonuclease de
restrição (EcoRI neste
exemplo).
Os dois intermediários
recombinar por base o
emparelhamento e estão
ligadas pela ação da DNA
ligase.

18. O vector de expressão tem um
promotor forte, adjacente ao
gene que codifica a proteína, que
origina grandes quantidades de
mRNA.
O DNA recombinante é
introduzido em bactérias,
leveduras, células de inserto, ou
células de mamífero, onde o gene
clonado é transcrito e traduzido
eficientemente.

20. Tag
O tag é uma curta sequência de nucleotídeos que codifica um
peptideo com poucos aminoácidos.
 Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produto
do gene clonado.
 Permite a detecção e purificação de proteínas.
 Péptideos de fusão específicos conferem vantagens à
proteína alvo durante a expressão: aumentam a
solubilidade, protegem da proteólise, melhoram a
conformação, aumentam a produção.
São vários os tags utilizados nos vectores de clonagem:
His6
Glutationa-S-transferase (GST)
Proteína de ligação a maltose (MBP)
Proteína verde fluorescente (GFP)
Epítopos

21. Tag adicionado ao inserto
Por engenharia genética, uma tag (epítopo) pode ser
adicionado ao inserto.

22. Detecção de proteínas
A identificação do DNA clonado é feita por
hibridação com um anticorpo específico da
proteína expressa.

23. Recuperando a Proteína
Lise celular
Remoção dos Ácidos Nucléicos
Otimizar a Purificação
Remover os Tags
Armazenar as proteínas em tampão
apropriado.

24. Lise celular convencional

25. Detergentes para Extração

26. Buster Family
É uma mistura de detergentes, própria para o rompimento
da parede celular de E.coli e liberação das proteínas ativas.

27. Purificação de proteínas com tag
Após obtenção da proteína, esses resíduos devem ser
purificados;
Podem prejudicar a função / forma da proteína;
São removidos por uma protease específica e / ou
coluna cromatográfica.

28. Proteases de remoção
Proteases específicas promovem remoção
eficiente dos resíduos
da proteínas.
São altamente específicas e podem ser
ativadas em baixas
temperaturas
Evita desnaturação da proteína.

29. Fractogel
Purificação eficiente e econômica das
protéinas
Purificação de proteínas em larga
escala;
Purificação de proteínas recombinantes
obtidas da cultura celular
Purificação de vírus
Remoção de resíduos e toxinas
Alta estabilidade química

30. Corpos de Inclusão – Fração
Insolúvel
Corpos de inclusão: tornam a proteína
inativa devido a formação de agregados
insolúveis (ácidos nucléicos, fosfolipídios,
etc); Consequentemente a proteína deve
ser rearranjada para retomar sua atividade;
Métodos convencionais de purificação de
corpos de inclusão são empíricos e
consomem muito tempo do usuário.
iFOLD ™ Protein Refolding System
É um método rápido e
reprodutível de
identificar as condições
de rearranjo da proteína.

31. Gene repórter
Gene repórter é um gene que produz uma proteína
que pode ser detectada e quantificada utilizando um
teste simples.
Utilização de genes repórter na localização de proteínas
recombinantes
Ratinho transgénico com GFP em fusão com uma proteína epitelial
O ratinho contém um transgene marcado com GFP expresso no corpo; o
ratinho fluoresce quando iluminado com luz UV.

32. Atualmente
É possível realizar este processo (com modificações
especificas para cada célula, proteína de interesse e
genoma) em:
 Leveduras (Pichia pastoris, Saccharomyces
cerevisiae, entre outras).
 células de mamífero (células COS, células CV1,
etc)
 baculovírus/células de inseto
 células de plantas e plantas transgênicas
 animais transgênicos

33. A produção de insulina humana por
ENGENHARIA GENÉTICA
bactéria E. coli Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro
2001

34. vetor de expressão pLMT8.5 construído para a produção
da pró-insulina humana em E. coli.

35. Aumentando a estabilidade da
proteína
Utilize células deficientes de proteases;
Adicione inibidores de proteases durante o processo
de extração
Encontre o melhor tampão de armazenagem

36. Bibliografia
 Como melhorar sua Expressão de Proteínas
Recombinantes em E.coli. Paola de Carvalho Braga,
2008.
 Clonagem de expressão.
 PROTEÍNAS RECOMBINANTES PRODUZIDAS EM
LEVEDURAS. Fernando Araripe Gonçalves Torres. Revista
Biotecnologia.
 A produção de insulina humana por ENGENHARIA
GENÉTICA. Beatriz Dolabela de Lima. Revista
Biotecnologia.

37. OBRIGADO!
Ivson Cassiano
Mayla Abrahim