1. "Metodologias inovadoras para
ensaios diagnósticos"
Alexandre Dias T. Costa
Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP/FIOCRUZ-PR)
Instituto Carlos Chagas (ICC/FIOCRUZ-PR)

2. O que são testes de diagnóstico?

3. • ferramentas auxiliares no diagnóstico
• acompanhamento de uma determinada condição ou
tratamento
• podem ser físicos, psicológicos ou (bio)químicos
O que são testes de diagnóstico?

4. Objeto da palestra:
Mostrar a evolução das técnicas de diagnóstico, desde
os primeiros testes de detecção imunológica até as mais
novas ferramentas de biologia molecular. Serão também
abordadas as diferentes capacidades de paralelização e
de processividade de amostras, tanto dos diferentes
testes existentes no mercado como dos testes
atualmente em desenvolvimento no Brasil e no mundo.

5. O passado
(mas nem tanto...)

6. Testes tipo ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay)
criados na década de 60 como alternativa aos métodos então
existentes (radioativos)
tipos: “indireto”, sanduíche, competitivo
extremamente versáteis com relação ao tipo de amostra
(sangue/soro, urina, saliva, ou outros fluidos)

7. ELISA “indireto”

8. ELISA sanduíche

9. ELISA competitivo

10. Usos atuais
diversas doenças
gravidez (HCG)
contaminantes em alimentos
contaminantes ambientais

11. O presente
Novas plataformas e melhoria das plataformas existentes

12. Demanda x Tecnologia

13. Testes de Fluxo Lateral

14. Teste rápido para Dengue
Detecção do vírus (proteína NS1):
Glicoproteína viral presente nos pacientes infectados do primeiro
ao nono dia após a infecção;
Detecção de anticorpos específicos contra o vírus:
IgM: 5 a 10 dias após o aparecimento dos sintomas em infecções
primárias (4 a 5 dias em infecções secundárias);
IgG: após 14 dia do aparecimento dos sintomas;

16. Mas…
(Sempre tem um “mas”)
Testes tipo ELISA detectam antígenos
ou anticorpos

17. Problemas com a janela imunológica…

18. Problemas com a janela imunológica…
Qual a
opção????

19. Detectar o patógeno!

20. Como fazer para detectar o ácido nucleico do agente
infeccioso?
DICA: a metodologia tem que ser sensível, reprodutível,
específica, precisa, simples, rápida, com grande
capacidade de processamento e possibilidade de
automação.

21. A solução é detectar o ácido nucléico
do agente infeccioso

22. PCR: Reação em cadeia da polimerase
Ao final de 35 ciclos, teremos mais de
1,5 bilhão de cópias do DNA alvo original

23. PCR convencional x PCR em tempo real
• Convencional
• Um par de iniciadores
• Análise por eletroforese em
gel
• Possibilidade de
contaminação
• Tempo real
• Um par de iniciadores
• Presença de uma sonda
• Detecção simultânea à
amplificação
• Não existe a necessidade de se
abrir o tubo para análise
• Análise quantitativa

27. Projeto NAT HIV/HCV brasileiro
CNPSH/MS

28. Pooling +
PCR Setup
cDNA + PCR DetecçãoExtração RNA
One Source

29. Influenza A(H1N1)
• 2009: Teste fornecido pelo CDC (Center for Disease Control and
Prevention);
• Disponibilidade limitada;
• Problemas de importação;
• Problemas de especificidade;
• Problemas de processividade;

30. • 2010: Produção completa do kit Influenza A(H1N1) pelo IBMP;
• Melhoria do produto: reação duplex

31. Demanda x Tecnologia

32. O futuro
Multitestes
Alta processividade
Point-of-care

34. Microarranjo (Biochips)
• Arranjo pré-definido de moléculas de DNA;
• Moléculas ligadas a uma superfície;
• Detecção e quantificação de ácidos nucleicos (RNAm na
forma de cDNA ou DNA genômico);
• Amostras são "marcadas" com fluorocromos;
• Leitores a laser;

36. Microarranjo Líquido - Luminex

39. Multiteste para Hemorrede

40. Internal…
Chagas…
HBVAg1
HCVAg1
HCVAg2
HIVAg1
HIVAg2
HTLV…
HTLV…
HTLV…
HTLV2…
Syphilis…
Syphilis…
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
4b1
5b1
6b6
8b6
10b3
14b5
15b4
Pool 2
HCV Multitest – multitest typical result Internal
Control
Chagas Ag
1
HBV Ag1
HCV Ag1
HCV Ag2
HIV Ag1
HIV Ag2
HTLV Ag1
HTLV Ag2
HTLV Ag3
HTLV2
Ag1
Syphilis
Ag1
Syphilis
Ag2

41. Multiteste prénatal
Alvos: AIDS, Hepatite B e C, Rubéola, Sífilis, Doença de Chagas e Toxoplasmose

42. Amostra
Bead ativada com antígeno Bead ativada com controle
Pad absorvente
Buffer
UV
Câmera
Buffer

45. PCR Lab-on-a-chip (LOC)

46. Projeto PODITRODI - visa o desenvolvimento de uma plataforma tecnológica
para diagnóstico no ponto de atendimento (point of care) para doenças tropicais,
integrando teste sorológico e molecular num único dispositivo.
DNA antibody
From Coura and Borges-Pereira, Acta Tropica, 2010
A inovação do PodiTrodi

47. A inovação do PodiTrodi
Atualmente
• Três processos independentes:
• ELISA
• Extração do ácido nucléico
• qPCR
• Equipamentos diferentes
• Semi automatizado
A Proposta
• Três processos sequenciais
automatizados, num único
equipamento portátil
Pooling + PCR
Setup
Detecção por qPCR
Extração RNA

48. Cartucho para extração de ácidos nucléicos
(ENAS/Frauhnhofer)

49. Chagas
• duplex reaction
(target and internal
control)
• regular mastermix
• 1/3 of regular run
time (ABI7500)
• gelified mix
• template: DNA
• status: in final
stages of
development

50. Gelification
Gelification consists in a process in which the PCR reagents are stabilized
by the addition of gelifying and stabilizing agents
Good alternative to reduce the cost of cold chain transport
Turns the PCR procedure extremely simple and fast to execute

51. Chagas
• duplex reaction
(target and internal
control)
• regular mastermix
• 1/3 of regular run
time (ABI7500)
• gelified mix
• template: DNA
• status: in final
stages of
development

52. Sequenciamento de Terceira Geração
Pirossequenciamento
SOLiD (oligonucleotídeos)
Illumina (corantes reversíveis)
Ion Torrent (condutividade)
Single molecule
Vários outros...
- Alta processividade
- Baixo custo por sequência
- Rapidez na obtenção de
grande quantidade de
informações

54. Aplicações
tipagem HLA: redução do tempo de análise e maior acurácia
identificação de patógenos e resistência a drogas: UTI
Farmacogenética: biomarcadores
Padrões de metilação, epigenética, polimorfismos...

55. Diagnóstico através de NGS

56. Diagnóstico de doenças com NGS

57. Diagnóstico de doenças com NGS

58. Proteômica na busca por biomarcadores
Diagnóstico mais precoce e acompanhamento mais refinado do tratamento, portanto
melhor prognóstico.

59. BioMEMS
(Biological MicroElectroMechanical Sensors)
BioMEMS refers to the science and technology of operating at the microscale for
biological and biomedical applications, which may or may not include any
electronic or mechanical functions.
[Steven S. Saliterman
(2006) Fundamentals of
bio-MEMS and medical
microdevices]

60. BioMEMS History
• 60s/70s – initial studies on functionalization of micro scale structures to manipulate their
biological properties
• 60s/70s – Glucose monitors & home pregnancy tests
• 1990 – Manz and Widmer: µTAS
(micro total analysis system)
• 1991 – first oligonucleotide chip
• 1998 – first solid microneedles for drug delivery;
first continous-flow PCR chip
• 1999 – laminar flows in microchannels

61. Materials approaches
• (glass)
• silicon
• plastics and polymers
• paper

62. Microfluidics
Lab on a Chip, 2011, 11: 1902
Current Opinion in Chemical Biology, 2012, 16: 243
DOI: 10.1515/bmt-2012-4425

63. Biosensors
• Micromechanical
• Electrical and electrochemical
• Optical
Biosens. Bioelectron. 2010, 26:1460
Sens. Actuators A Phys. 2006, 125, 273
Sens. Actuators A Phys. 2007, 135, 315
Appl. Phys. Lett. 2013, 102: 143702

64. Biological chips
• Oligonucleotide chips
• Microarrays

65. • PCR chips

66. Projeto Sepsis - desenvolver um método para captura dos
agentes infecciosos diretamente de amostras de sangue total
acoplado a um multiteste diagnóstico molecular rápido,
fundamentado no conceito Lab-On-Chip (LOC), para a
detecção e identificação desses patógenos e seus principais
mecanismos de resistência a antimicrobianos.

67. Silva et al., 2004
Sepse: síndrome de resposta inflamatória sistêmica desencadeada por um processo
de infecção generalizada, decorrente da invasão da corrente sanguínea por agentes
infecciosos.
BACTÉRIAS e FUNGOS
PRINCIPAL CAUSA DE MORTE EM UTI
Mortalidade(%)
Adaptado de Siqueira-Batista et al.,
2011

68. Chancede
Sobrevivência(%)
Início do tratamento
adequado
Adaptado de Kumar et al., 2006
Tubo para
hemocultura,
1915
Tubo para
hemocultura, século
21
Hemocultura: 100 anos
3 – 5 dias
50% negativo
7,6% / hr

69. OBJETIVO GERAL
ENRIQUECIMENTO DETECÇÃO e
IDENTIFICAÇÃO
Captura Seletiva PCR-Array
Multiteste molecular
- Especificidade
- Sensibilidade
- Agilidade

70. Captura Seletiva
105 102 100M +
Sangue contaminado
artificialmente: P. aeruginosa

71. In-Check: Plataforma Lab-On-Chip (LOC)
Tecnologia: PCR-Array

72. PCR chips

74. Tempo do teste a partir de
amostras de DNA extraído
Nossa Proposta
Tempo total do teste: 2h
Coleta de
sangue
Captura
Detecção e
identificação
5 min 25 min
Extração
DNA
30 min 60 min

75. Point of care
• Diagnostics
• Home care
• Insulin pumps

76. Eyenetra
(oftalmologista portátil)

77. Point of Care
• Glaucoma

78. Colaboradores
IBMP/ICC
Marco A. Krieger
Rita Rampazzo
Tahiana Brandalize
Camila B. Suarez
Cheysa A. Biondo
Leonardo Foti
ICC
Christian Probst
Daniela P. Pavoni
BioManguinhos
Antonio G. P. Ferreira
Patricia Brindeiro
Edimilson D. Silva
UFRJ - Biologia
Rodrigo Brindeiro
STMicroelectronics
Marco Bianchessi
Marco de Fazio
Marco Cereda
Alessandro Cocci
ENAS/Fraunhofer
Thomas Gessner
Andreas Morschauser
Jorg Nestler
CEA/Leti
Guillaume Delapierre
Dorothée Jary
Justine Lemonnier
UFPR – Física
Cyro K. Saul
Wido H. Schereiner
Arandi G. Bezerra Júnior
UTFPR
Fábio K. Schneider
Hugo Vieira Neto
UNICAMP
Jacobus Swart
Fundação CERTI (Florianópolis)
Manuel Steidle
Daniel Cobra

79. Obrigado pela atenção!
Alexandre Dias T. Costa
Instituto Carlos Chagas (ICC)
Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP)
FIOCRUZ PARANÁ – adcosta@tecpar.br
http://www.fiocruz.br/icc/
http://www.ibmp.org.br/