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AREA DE CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA

                            MÓDULO 5


EL SISTEMA DE AUTOCONTROL EN
LA INDUSTRIA AGROALIMENTARIA

    “MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS”

                            (Parte I)


                                  JAIME FISAC PONGILIONI
                                          Ingeniero Agrónomo
Madrid, Noviembre de 2012                       Col. Nº 4578 COIACC
                                                 Col. Nº 3199 COIAL
ÍNDICE

PARTE I:


      1    INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA.

      2    CRECIMIENTO MICROBIOLÓGICO.

      3    TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.

      4    ACTIVIDADES DE LOS MICROORGANISMOS.

      5    DIVERSIDAD MICROBIOLÓGICA.
1         INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA

                                   Bacterias
    Microorganismos Celulares:     Hongos
                                   Protozoos
                                   Viroides
    Microorganismos Acelulares:    Priones
                                   Virus
                                   Organizacíón Procariota (archaea/bacterias)
         Organismos Celulares:     Organización Eucariota
                                   (eucaria/algas, hongos, protozoos)

PROCARIOTAS

        Peptidoglicano:
                                  N-acetilglucosamina
                Polisacáridos:    Ácido acetil-murámico       Unidos por aa
                                  Péptidos cortos
        Endosporas; resistencia a cosas (Tª    conservación de alimentos).
Peptidoglicano
Bacterias Gram +


                                  ácidos        ácido
                       proteína teicoicos   lipoproteico




peptidoglicano

                                                           Espacio periplasmático
                                                            Relacionado con la síntesis de peptidoglicano
    membrana
    plasmática
       (8nm)




                 fosfolípido      proteína integrada
Bacterias Gram -


                             Polisacárido-O
                       polisacárido
                        Núcleo del




                                                              Lípido-A                      Porteína
  Membrana




                                                                         Porina
   Externa



                                   Fosfolípido




                                                                                                       8 nm
Periplásmico




                                                          lapoproteína
  Espacio




                                                                           peptidoglicano



        membrana
        plasmática
               (8nm)
Estructura del Lipopolisacárido (LPS)


          Lípido-A    KDO (cetodesoxioctanato) C8




            glucosamina        Núcleo del           Polisacárido “O”
                              polisacárido            (específico)


    el lipopolisacárido es tóxico en animales superiores; la toxicidad está
   en el Lipido-A (endotoxina).
    es permeable a moléculas pequeñas; PORINAS (canal que se satura de
   agua y hay moléculas pequeñas que la atraviesan). Hay porinas
   especificas y no especificas.
    es impermeable a moléculas grandes. Crea un espacio periplasmático
   entre la membrana plasmática y el peptidoglicano. Está relacionado con
   la síntesis de peptidoglicanos.
Tinción de Gram.



           COLORANTE              G(+)                    G(-)
          Violeta cristal           +                       +
          Iodo                    Cristal                Cristal
          Alcohol              Sigue violeta       Decolora la célula
          (decolorante)      (cierre de poros)   (disuelve los cristales)
          Zafranina
                              Sigue violeta            Color rojo
          (colorante rojo)
Postulados de Koch:
Comparación entre una célula Eucariota y una Procariota.


     Estructura      Procariota            Eucariota
Estructura del Flagelo.
Diferencias entre Endosporas y Células Vegetativas.
Diferencias entre el ARN ribosómico de Archaea/Bacteria/Eukarya.
2             CRECIMIENTO MICROBIOLÓGICO

    Tiempo de Generación (TG) = Tiempo de Duplicación.
            Tiempo en pasar de n a 2n.
            Es siempre el mismo para una misma especie bajo las mismas condiciones.

    Crecimiento Exponencial:                                                                   N0
                                                                                        log
              N = N0 * 2n           logN = logN0 + n*log2                      n=              N0
                                                                                            log 2
                                         dx                   nº de células o de cosas que yo quiero ver
                                            = µ*x
                                         dt
                                                constante de crecimiento específico (h-1)
                                                define el crecimiento óptimo
                                      crecimiento
                                                                                       Ln x
                                                                                            x0
             x = x0 * e µ(t–t0)        Ln x – Ln x0 = µ * (t-t0)                    µ=
                                                                                         t-t0

             Si (t-t0) = TG : x = 2 * x0                                                         Ln 2
                                                           2* x = x0 * e      µ(t–t0)       TG = µ
                                  x = x0 * e   µ(t–t0)
Curva de Crecimiento típica para una población microbiana:


                                                           FASES DE CRECIMIENTO
                                  LATENCIA   EXPONENCIAL          ESTACIONARIA       MUERTE


                            9.0                                                                       1.0
                                                                                   turbidez óptica    0.75
Log organismos viables/ml




                                                                                  (densidad óptica)
                            8.0                                         viables




                                                                                                             densidad óptica
                                                                                                      0.50

                            7.0

                                                                                                      0.25
                            6.0


                            5.0

                                                                      tiempo
Medidas directas del Crecimiento Microbiológico:
   A) Recuento de células totales.
                                                             sólidos
          Método del recuento directo en
                                                             líquidos
   B) Recuento de células viables: células vivas
          Método de siembra por extensión en placa.
          Método de siembra por vertido en placa.

                                     1 ml            1 ml           1 ml


                        1 ml



                                 9 ml         9 ml           9 ml          9 ml
                                 (1/10)       (1/100)       (1/1000)   (1/10000)   : diluciones
                                                        159 colonias
            Factor de dilución          102

                                        159 x 1000 = 1,59 * 105 (células / ml muestra original)
Las Industrias Agrarias y Alimentarias usan los “Sistemas de
      Cultivo Continuos”:
                                  S      Flujo constante de sustrato
MEDIO FRESCO DEL RESERVORIO
                                     REGULADOR DE FLUJO
       GAS/ AIRE ESTÉRIL




                                                  ESPACIO DE CABEZA GASEOSA

                                     X                S y X constantes: controlando
                                                      S controlo X

                                                  CULTIVO
                                 S



                                                        EFLUENTE DE CÉLULAS
                                                        MICROBIOLÓGICAS
Factores que afectan al crecimiento microbiológico:
  Temperatura:
        A mayor Tª las reacciones químicas y enzimáticas son más rápidas,
        pero llega a un punto donde se inhibe el crecimiento.
        Cada organismo tiene sus temperaturas cardinales:
            Tª mínima: Por debajo de ésta no existe crecimiento.
            Tª óptima: Crecimiento rápido (+ cerca de Tªmáx que de Tªmin).
            Tª máxima: Por encima de la cuál no existe crecimiento.



                           GELIFICACIÓN DE LA MEMBRANA (transporte lento: existe crecimiento)



                                                                                Tª
                                         Tª min                 Tª opt Tª max

                                                              DESNATURALIZACIÓN PROTEICA
Organismos PSICRÓFILOS:
               Tª óptima < 15 ºC
               PSICRÓFILOS ESTRICTOS: por encima de 15-20 ºC mueren.
               PSICRÓFILOS TOLERANTES: toleran bajadas bruscas de Tª.
                                        crecen a 0ºC.
                                        Tª óptima 20 – 40 ºC.

          Organismos MESÓFILOS:
               Tª óptima 30 - 37 ºC
               E. coli.
E. coli                                               Escherichia coli
          Organismos TERMÓFILOS:
               Tª óptima > 50ºC
               TERMÓFILOS TOLERANTES: Tª óptima 50 ºC.
               HIPERTERMÓFILOS: Tª óptima > 80 ºC.
                                No en Eucariotas.
                                Asociadas a procesos volcánicos.
                                Casi todas Arqueobacterias.
“Thermus Aquaticus”:
                         En centrales eléctricas y calentadores.
                         Tª optima 150 ºC.
  “Thermus Aquaticus polimerasa”:
                         Técnica del PCR (medicina forense)

TERMÓFILOS       e HIPERTERMÓFILOS se usan en
biotecnología, pues son muy estables y catalizan
reacciones a altas temperaturas.




               Thermophilus Aquaticus
pH:
      Para que exista crecimiento: 2 < pH < 10.
      También hay pH óptimos.
        Organismos ACIDÓFILOS:
                 pH 2 – 5.
                 Hongos.
                 Zumo de limón pH = 2
        Organismos NEUTRÓFILOS:
                 pH 7.
                 Agua Pura.
                 pH citoplasmático es neutro.
        Organismos ALCALÓFILOS:
                 pH > 7 (7 – 10).
                 Bacillus (Gram +).
                 Alcalófilos Extremos: Archaea
Oxígeno:

    Organismos AEROBIOS:
                Crecen a tensiones de O2 normales: 21% de O2 en aire.

            MICROAERÓFILOS: Utilizan el O2 cuando está a niveles mas bajos
                                que en el aire.
             A. FACULTATIVOS: Bajo ciertas condiciones nutritivas crecen tanto
                                en condiciones aerobias como anaerobias.

    Organismos ANEROBIOS:
                Los que no respiran O2.

           A. AEROTOLERANTES: Toleran el O2.
                                Crecen en presencia de O2 pero no pueden usarlo.
                  A. ESTRICTOS: Inhibidos o mueren en presencia de O2.
                                Bacterias: Clostridium (Bacilos Gram +)
                                          Sulfato-reductoras.
                                          Homoacetogénica.
Los AEROBIOS / ANAEROBIOS TOLERANTES tienen enzimas capaces de
destruir las formas tóxicas del O2:
Formas tóxicas del O2:
                         (ion muy tóxico)
       O2 +   e-         O2-      Superóxido
       O2-   + e-   + 2H+            H2O2   Peróxido de H
                                              -
       H2O2 + e- + H+             H2O + OH        Ión hidróxilo
                                                   (Se forma debido a radiaciones)

Enzimas que destruyen las 3 formas tóxicas:

                    CATALASA: Elimina el H2O2
                                       H2O2 + H2O2         2H2O + O2 (      )
               PEROXIDASA: Elimina el H2O2
                                       H2O2 + NADH            2H2O + NAD+
 SUPEROXIDOSISMUTASA:                 Catalasa en combinación
                (SOD)
                                       O2 + O2 + 2H+           H2O2 + O2 (      )
                                      Si tiene SOD tiene catalasa o peroxidasa
Disponibilidad de Agua:
      Es necesaria para la célula.
      Se crea una presión de turgencia importante para crecer.

         Medio HIPOTÓNICO:
               La [ ] exterior < [ ] citoplasma                La célula explota
         Medio HIPERTÓNICO:
               La [ ] exterior > [ ] citoplasma                La célula se arruga

      Actividad de Agua: aw

                         Presión de vapor del aire en equilibrio con una solución
                  aw =
                                 Presión del agua pura a esa temperatura

                                              0 < aw < 1

                                                        Ps
                                             aw =
                                                        PH O
                                                           2
Organismos HALÓFILOS:
      Requieren NaCl para crecer.
      Microorganismos marinos.
         H. DISCRETOS: Bajo requerimiento de NaCl (1- 6 %).
      H. HIPERTÓNICOS: Moderado requerimiento de NaCl (6 - 15%).
         H. EXTREMOS: Crecen en ambientes muy salinos
                          15 – 30 % para crecimiento óptimo

 Organismos OSMÓFILOS:
      Los microorganismos crecen en [ azúcares ].
      Crecen en frutas.
 Organismos XERÓFILOS:
      Los microorganismos crecen en ambientes muy secos.

Solutos Compatibles:
    Para no arrugarse, el microorganismo sintetiza solutos para
    aumentar la tensión osmótica en su interior.
Medición del Crecimiento Microbiológico:
3              TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS


TÉCNICAS de OBSERVACIÓN

    MICROSCOPÍA ÓPTICA: Microscopio óptico o de campo brillante.

            AUMENTO:     Con lentes convexas (a + convexa + aumento).
           CONTRASTE:    Consiste en diferenciar la imagen del fondo.
                         Depende de la absorción.
                         Añadimos colorante a la muestra.
          RESOLUCIÓN:    Capacidad para ver 2 puntos como 2 puntos y no
                         como 1.
                         “Poder de resolución”: distancia mínima para ver 2
                                 (t)              puntos como 2 puntos.
                                                         longitud de onda
                                                  λ
              150            t = 200      t =                Índice de refracción
                                                2 * AN           Tamaño de la lente
                 ¡¡ no lo veo !!
                                        Apertura Numérica = n * senϴ
Microscopio óptico:
        simple                                           x 10
                                  ocular      2 lentes   x 20
        Compuesto (2 lentes)                               x 10
                                  objetivo      3 lentes x 40      para
                                                           x 100   inmersión

Microscopio óptico de campo oscuro: aumenta el contraste
    Podemos ver muestras frescas (sin teñir); células vivas.
Tinciones:
         Simples:     compuestos ácidos/básicos cargados.
                      matamos a las células (desventaja).
                      fijación a la llama.
    Diferenciales:    tinción de Gram.
                      tinción ácido-alcohol resistencia (para cepas de
                      mycobacterium).
      Específicas:    de esporas.
                      de flagelos.
                      negativa (cápsula).
Microscopio Electrónico de Transmisión:

                                M.O.                         M.E.T.
           HAZ         Luz                     Electrones

        MUESTRA        En pletina de cristal   En pletina de metal (al vacío)

        ENFOQUE        Sistema de lentes       Sistema de lentes electromagnéticas

      IMAGEN FINAL     Imagen real             Microfotografía de fluorescencia

        AUMENTO        Hasta 1.000 aumentos    Hasta 200.000 aumentos

       RESOLUCIÓN      Hasta 200 nm            Hasta 1nm


     Muestra: al vacío.
     Corte en la parafina con una cuchilla (microtomo).
     Tinción con metales pesados.
     Técnica empleada:
                 Criofractura.
                 Criograbado.
                 Sombreado metálico (para los Virus).
Microscopio óptico:
       De campo brillante.
       De campo oscuro.
       Por contraste de fases:
            Basada en la diferencia de índice de refracción de los ≠
            componentes de la muestra (imagen tridimensional).
       Fluorescente:
           Técnicas con fluorocromos o marcación con sonda.
       Con focal:
           Microscopía antigua.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA:
   Con esto la λ.
   Calentamos hilos de tulsteno a 3.000 ºC y creamos un chorro de e-
   con una ddp altísima.                                      λ
                                                        d=
                                                              2*AN
                      1,5            1,5                      0,055
             λ=    V (voltaje)   =   300   = 0,055 nm   d=
                                                              2*300
Microscopio Electrónico de Transmisión:

            Recogemos los electrones secundarios que emiten la muestra al
            ser bombardeado por electrones primarios.
            Para observar células enteras.
            Tienen baja capacidad de resolución (1.000 aumentos; 20nm).
            Cubrimos con metales para acentuar las diferencias.

                  virus    m. electrónico.
                  bacterias    m. óptico.
                  membrana externa de una Gram (-)         m. e. de transmisión.

TÉCNICAS de CULTIVO
      Cultivo axénico     cultivo puro (1 sola especie de 1 sola célula).
      Condiciones estériles        no    contaminación         cond. asépticas.
      Medio de cultivo        Para hacer crecer los microorganismos.
                              Condiciones óptimas de cultivo     especie.
TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN:

    ESTERILIZACIÓN AL CALOR:

          Calor Húmedo:
               Autoclave (1 atm).
               Vapor de agua       120 ºC sin hervir.
               20 min en esterilizar.
               Cualquier cosa miscible con el agua se autoclava.
          Calor Seco:
               En horno:
                     180 ºC / 2-3 horas.
                     Materiales que aguanten altas temperaturas.
               A la llama (mechero).
    FILTRACIÓN:

          Separamos los m.o. del material a esterilizar.
          Sustancias termolábiles (aa, proteínas, …)
Tipos de filtros:
            De profundidad (de celulosa).
            De membrana ( 0,2-0,4 micras de tamaño de poros).
            Nucleopore (hechos los poros con radiaciones – sin cont)
            HEPA (para filtrar el aire - cabina de flujo laminar).

ESTERILIZACIÓN CON COMPUESTOS QUÍMICOS: en frio.

    Matamos al m.o. con:
        Germicida.
        Microbicida ( bactericida, viricida, fungicida, …)
    Microbioestáticos:
        No los mata pero inhibe su crecimiento.
    Toxicidad selectiva: Dependiendo de la t.s. tenemos:
        Desinfectante: superficies inanimadas. Ej:alcohol.
        Antiséptico: superficies de tejido como uso tópico. Ej. alcohol
        Quimioterapéutico: no tóxico para nosotros.
Fenoles y Alcoholes:
   Desestabilizan los lípidos de membrana.
   Desinfectante (piel) y antiséptico.
Halógenos y H2O2:
   Para agentes oxidantes.

Metales pesados:
   Son muy tóxicos.
   Mercurio de cromo.
Detergentes:
   Agente surfactante.
Gases:
   Matan a las esporas.
   Óxido de etileno y Formaldehido.
   Son muy tóxicos.
   Esterilizamos con bajas dosis.
2 técnicas de aislamiento de m.o.:
    Método de siembra en estría o placa. CULTIVOS AEROBIOS
    Método de diluciones sucesivas. CULTIVOS ANEROBIOS

Medio de Cultivo:
      Nutrientes.
             Macronutrientes: C, H, O, N, P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe.
             Micronutrientes: Fe (elementos traza).

       NUTRIENTES:

               Síntesis de la estructura
               celular y crecimiento (Fuente        ANABOLISMO
               de C)
               Obtención de Energía       CATABOLISMO

       FUENTE DE C:

                 CO2 atmosférico      AUTÓTROFO
                 Componentes orgánicos    HETERÓTROFO
FUENTE DE ENERGÍA:

              Luminosa (luz):
                     autótrofo    FOTOAUTÓTROFO
                    heterótrofo   FOTOHETERÓTROFO

              Por compuestos químicos:
                     autótrofo    QUIMIOAUTÓTROFO
                    heterótrofo   QUIMIOHETERÓTROFO



Medio de cultivo:
     Complejo: Ponemos un poco de todo con una fuente de
               Carbono (azúcar).
      Definido: Sabemos la composición exacta.
    Selectivo: Para que crezca un determinado m.o.
   Diferencial: Para poder distinguir dos microorganismos
                distintos (Agar, caldo peptonado, LIA, …)
Microscopía Electrónica
4        ACTIVIDAD DE LOS MICROORGANISMOS

    VISIÓN DEL METABOLISMO:

         Reacciones químicas que tienen lugar en el interior de la célula.
                1.- Entrada de nutrientes en la célula.
                2.- Síntesis.
                3.- Ensamblaje.
         Productos Precursores: Energía para todos los procesos del metabolismo.

                 Reacción ANABÓLICA              POLIMERIZACIÓN     ESTRUCTURA
                            (biosíntesis)                             CELULAR

NUTRIENTE


                 Reacción CATABÓLICA
                     (productor de energía)


                       Metabolitos Precursores
                        Poder Reductor (NADH)
                                Energía (ATP)
PRINCIPALES RUTAS CATABÓLICAS:

     Metabolitos precursores:
          Son 12 compuestos esenciales.
          Ninguna ruta por sí sola da los 12 compuestos.
     Poder Reductor:
          Reacciones de Oxido-Reducción (RedOx)
                                                                          Transferencia
                Oxidación: ceder e- (Lo ceden los átomos de H)            de protones
                Reducción: ganar e-

          Potencial de reducción: E0´ (mv)
                        E0´ (mv) < 0            capacidad para ceder e-
                        E0´ (mv) > 0            capacidad para ganar e-

                Glucosa como fuente de energía: funciona bien como dador de e-

          Proteínas transportadoras del PR:
                Libres en el citoplasma:      NAD+ ó NAP
                                                                      respiración
                Asociadas a membranas:        Forma la cadena de e-   fotosíntesis
Energía:

    Enlaces ricos en energía:     Enlaces tipo fosfato (ATP es el más alto)
                                  No todos los fosfatos son energéticos

    Síntesis de ATP:

           Fosforilación a nivel de sustrato         PEP      Piruvato

                    Compuesto orgánico fosforilado

                  Molécula de Fosfato de alta Energía           ADP           ATP


           Fosforilación oxidativa
                    En las membranas: ATPasa ó ATPsitetasa
                            Introducen H+
                            Sintetiza ATP para el gradiente de protones
GLUCOLISIS:         1 glucosa  2 piruvato + 2ATP + 2NADH

              ATP                                 ATP

    GLUCOSA             G-6-P            F-6-P            F1,6-BP     Muy inestable

      (C6)                                                      aldolasa

                                                              DHAP    (C3)
               ADP               ADP              NAD
                                    Muy inestable
   PIRUVATO            PEP              1,3-BPG               G3P     (C3)

             ATP             ATP                 NADH Comienzan las
                                                       oxidaciones


ENTNER-DOUDOROFF:               1 glucosa  2 piruvato + 1ATP + 2NADH

              ATP                   NADH                H2O
                                        ÁCIDO 6 FOSFO
    GLUCOSA             G-6-P            GLUCÓNICO
                                                                     αKDG

                                                                           aldolasa

                                                                    PIRUVATO


                                                              GLICERALDEHIDO
                          PIRUVATO
                                                                  FOSFATO
PENTOSAS FOSFATO:              1 glucosa  2 piruvato + 1ATP + 3NADH

                            ATP                  NADH
                                                    ÁCIDO 6 FOSFO
                 GLUCOSA                G-6-P
                                                     GLUCÓNICO
                                  ADP
                                                      CO2
                                                                  NADH

                                                        RIBULOSA 6
              PIRUVATO               G-3-P
                                                         FOSFATO


Desde PIRUVICO puedo:
     Para BIOSÍNTESIS.

     Seguir OXIDANDO para obtener energía hasta el final (CO2) respirando,
    pero hay m.o. que no respiran (el Piruvico de las PF no se oxida más!!!).

RESPIRACIÓN:
    Proceso en el cual un compuesto es oxidado con O2 (o un sustituto de O2), que
    funciona como aceptor terminal de e- y que normalmente se acompaña de la
    producción de ATP por Fosforilación Oxidativa.

    R. ANAERÓBICA: en lugar de O2, el último aceptor de e- es otra sustancia
    (SO42- ó NO3- )
CICLO DE KREBS:                                            oxidaciones


                                                                                         CO2




                                                                     Fosforilación a
                                                                     nivel de sustrato
                                             OXALACETATO

  GLUCOSA             ACETIL-CoA
                                               SUCCINATO
                                                                                         CO2




               piruvico (glucolisis)  2 x [3CO2 + 4NADH + 1FADH + 1GTP]


 El ciclo completo sólo lo tienen algunos m.o.
 Los que no lo tienen completo, contienen un enzima para descarboxilar.

 Aceptores de e- :
          1.- FADH – Deshidrogenasa.
          2.- Flavoproteína.
          3.- Ferredoxina (sólo capta e- , los H+ los echa fuera).
NADH Deshidrogenasa
           e-
             H+
  FLAVOPROTEÍNA
            e-                      Energía
                       +
                       H        “Protón-Motriz”

   FERREDOXINA             H+
                                H+
           e-
                  e-
     QUINONA                CITOCROMO
EJEMPLO 1: “Fermentación Homoláctica”           2 Hlac + 2 ATP

             Fermentación de ácido láctico de la leche para formar yogur.

                                  PIRUVICO
                                                 NADH

                                           lactato deshidrogenasa
                          NAD+
                            ÁCIDO PIRUVICO             el pH y precipita la caseína



EJEMPLO 2: “Fermentación Alcohólica”         Glucosa  2 Etanol + 2CO2 + 2ATP


                  PIRUVICO

                                    NADH        NAD+
                CO2
              ACETALDEHIDO                             ETANOL
                                 alcohol deshidrogenasa


              La fermentación alcohólica de la ruta de E.D. la produce la bacteria
              Zymomonas (Gram -, anaerobia facultativa), indeseables en la
              industria alcohólica y de bebidas.
EJEMPLO 2: “Fermentación Heteroláctica”


                      ATP    NADH     NADH

            GLUCOSA                      RIBULOSA (C5)
               (C6)

                         (C3) PIRUVICO                 ACETIL-PIRUVICO
                NADH + ATP
                                                     NADH
                  NAD+

                          ÁCIDO LÁCTICO                      ETANOL


                               1Glucosa  1Hlac + 1Etanol + 1CO2
ATP-sintetasa:   mete los H+ que han salido.
                 actúa como un canal de H+.
                 une un Pi a un ADP para formar ATP.

RESPIRACIÓN:
      AEROBIA: El último aceptor de e- es el O2.
                       O2/H2O       poder reductor muy alto

      ANAEROBIA: El último aceptor de e- no es el O2.
                 El salto energético es más bajo.

Vía de asimilación del NITRATO:
      Como NITRATO: ruta normal (plantas, hongos, …)
      Como NITRITO: cede un e- de Nitrato a Nitrito.
FERMENTACIÓN:

                    “Catabolismo anaeróbico en el que un compuesto orgánico sirve al
                    mismo tiempo como donador y aceptor de e- y en el que el ATP se
                    produce por fosforilación a nivel de sustrato”

                    No existe oxidación total de la fuente de energía.

                                No existe donador final de e-
                    Todas las reacciones están “balanceadas” internamente.

                    Hay que “gastar” el poder reductor (NADH) reduciéndolo.


                     F-6-P     F-1,6-B-P   G-3-P       D-H-A-P

                                           1,3-B-P-G     P-E-P        PIRUVICO   GLUCOLISIS
GLUCOSA   G-6-P
                               αKDG        PIRUVATO       G-3-P

                    A6PG                                          PIRUVICO ENTNER DOUDOROFF

                               R-6-P       G-3-P                  PIRUVICO   PENTOSAS FOSFATO
FUENTE DE                 FUENTE DE
                                                         SERES
    ENERGÍA                   CERBONO
                                                  QUIMIOAUTÓTROFOS
compuestos orgánicos             CO2              (QUIMIOLITOTROFOS)
        luz                      CO2               FOTOAUTÓTROFOS
compuestos orgánicos   compuestos orgánicos      QUIMIOHETERÓTROFOS

AUTÓTROFOS
                                                       18 ATP
    Fijación de CO2         Ciclo de KALVIN            12 NADPH

                            6 moléculas de CO2          1 molécula de Fructosa

FUENTE DE ENERGÍA

    - Luz      ATP
               NADPH          FOTOSÍNTESIS

    - Compuestos Químicos        ATPasa   (capta los e- del compuesto químico
                                          directamente)
                                          (el CQ es el donador de e-)
5                    DIVERSIDAD MICROBIANA

                              BACTERIAS
      Origen de la vida       ARCHEOBACTERIAS
                              PROCARIOTAS

    ESTROMATOLITOS: Masas microbianas laminadas, construidas por capas de
                    organismos filamentosos y no filamentosos que pueden
                    encontrarse fosilizados.
             TEORÍA            Mitocondria y cloroplastos fueron en su día dos bacterias
     ENDOSIMBIÓTICA:           de vida libre.
                               El microorganismo endosimbionte era fotosintético (da
                               lugar a las plantas)


CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

    Clasificación que nadie acepta:   Reino Animal / Plantas / Fungi / Monera / Protista
                                                              hongo   protozoo procariota
    Cronómetro Molecular: ARNr        16S eucariota
                                      18S procariota
BACTERIAS                                clasificación: dominio   +
                                                               reino
       ARCHAEA                                                 sección
       EUCAREA (eucariotas)                                    clase
                                                               órden
                                                               familia
BACTERIAS:                                                     género
                                                               especie   -
  Microorganismos Fotosintéticos:
                Bacterias Verdes.
                    Tienen clorosomas para acumular la energía.
                Bacterias Rojas ó Purpúreas.
                   Acumula en la membrana citoplasmática pigmentos para
                   acumular energía.
                   Las BV y BR: No producen CO2   Fotosíntesis anoxigénica

                                                                Solo 1 fotosistema
                                 Tienen bacterioclorofilas:
                                         BV: b, A, C, D, F.
                                         BR: b, A, B.
                                 El tipo de luz que necesitan determina el hábitat.
                                 Carotenos (efecto protector contra ciertas λ.
“fotosíntesis cíclica” (no donador ext. de e-)
                      Sólo se forma ATP (luz ATP)
                              FOTOFOSFORILACIÓN CICLICA
                      El NADPH surge de:
                         H2: dona los e- de NADP a NADPH
                         HS-: no lo dona directamente. La cadena de
                              e- va al revés.
                                                                -
                                 TRANSPORTE INVERSO DE e
                      Viven en lagos, estanques y fuentes termales.

   Cianobacterias.
       Ficobiliproteina en cianobacterias (Ficociana da color azul).
       Tienen tilacoides, Fotosistema I (fotosíntesis oxigénica) y II.
       Tienen la Clorofila A.
       Crecen en suelos (fertilizantes en suelos).
       “Azolla”, “Anabaena” (bacteria): hace la fotosíntesis y fija
       nitrógeno atmosférico (plantación de arroz).
       Hacen la misma fotosíntesis que las plantas.
       La luz: forma el grad de protones y dona e- (NADP      NADPH)
Microorganismos Quimiolitotrofos:
             Bacterias del Azufre.
                 HS- dona los e- a la Quinolona y se crea el grad en la
                 membrana       forma ATP.
                 Para sintetizar NADPH     “Transporte inverso de e-”
                 No es necesaria reacción metabólica.

             Bacterias del Hierro.                  H+, H+        ATP
                Aerobia y pH ácido (acidófilo).       Fe2+          O2
                Oxida el Fe2+ a Fe3+ .            pH 2-3             pH 6
                                                       Fe3+         H2O
                En arroyos de minerías.
                                                  EXTERIOR         INTERIOR

Microorganismos Quimioheterótrofos:
             Bacterias Aerobias.
                 Pseudomonas: Siempre respiran.
                                 Hacen la ruta de E. Doudoroff.
                                 Metabolizan gran cantidad de compuestos.
                                 Proceso descontaminante: BIORREMEDIACIÓN
                                 Proceso de lucha biológica (sideróforos:
                                 acompleja todo el Fe para que el patógeno
                                 no lo pueda utilizar).
“Pseudomona         syringae”:      patógenos
               vegetales. Presentes en hojas y no actúan si
               no hay condiciones ambientales adversas
               (frío, heladas, …). Produce clorosis.
F. Rizobiaceas: “Rizobium”:
                Fija N atmosférico (leguminosas).
                La bacteria está en los nódulos radicales de
                la raíz: N2      NH3       vegetal
                La planta es fuente de C y de E.
                Se protege el O2 y se produce la
                “leghemoglobina”, que lo sintetiza la planta
                y se lo da a la bacteria para que atrape el
                O2.
                Relación planta – bacteria es específica.
Ingeniería Genética:
                                          Agrobacterium: “Tumefaciens”:
 Nos quedamos con las “oparinas”                           Produce tumores en el tallo.
 (productor del tumor) que crea los
 genes oncogénicos y nos quedamos con
                                                         “Rhizogenes”:
 su DNAt y en ésta región inyectamos lo                    Produce tumores en la raíz.
 que queremos cultivar.
                                             Bacteria del Acumula ácidos orgánicos.
                                           Ácido Acético: “gluconobacter”: no es superoxidante.
                                                          “acetobacter”: es superoxidante (oxida el
                                                          HAc hasta CO2).
                                                          Sorbitol: la “sorbosa” produce el “ácido
                                                          ascórbico” (proceso de BIOCONVERSIÓN)
                                          G. Zimomonas: Produce la “fermentación alcohólica” por
                                                        la ruta de E. Doudoroff.
                                                        En algunos sitios se una para fermentar en
                                                        lugar de usar levadura (“pulque” para
                                                        hacer tequila, sidra, cerveza, miel,…).
                                                        También produce la fermentación de etanol.
                                               G. Vibrio: Algunas especies están asociadas a
                                                          enfermedades.
                                                          “Vibrio cholerae” en agua contaminada.
                                                          “Vibrio    parahemoliticus”    organismo
                                                          marino (en marisco).
   Bacterias Anerobias.
               Bacterias Bacilos no esporulados.
              Entéricas: Anaerobios y facultativos.
                         Grupo homogéneo de bacterias.
                         Fermenta muchos azúcares y forma gases.
                         Hay mezcla de muchos compuestos a la vez.
                                FERMENTACIÓN ÁCIDO-MIXTA.
                                FERMENTACIÓN BUTANO-DIÓLICA.

FERMENTACIÓN ÁCIDO-MIXTA.
  Se forma: ácido acético, ácido láctico, ácido succinico, etanol, CO2 , H2.
  Grupo Escherichia: Anaerobio facultativo.
                       Vive en el intestino grueso (si está en el i. delgado
                       produce enfermedades endéricas (diarreas).
                       Nos proporciona Vitamina-K.
                       Se usa como grupo indicador de contaminación.
      Género Shigella: Fuertes alteraciones (toxinas muy fuertes).
                       Parecidas a E. coli.
  Género Salmonella: Produce cepas patógenas.
                     Existen muchas variedades.
                     Clasificación: S.K, S.O, S.H
Género Yersinia: Gram -, aerobios y anaerobios facultativos.

            FERMENTACIÓN BUTANO-DIÓLICA:
               Se acumula y se produce “butano-diol”.
                     Enterobacter: Gram -, anaerobia facultativa.
                                   Ifecciosas o descomponedoras.
                        Klebsiella:Gram -, anaerobia facultativa.


BACTERIAS GRAM (+):
           Bajo contenido en G+C:
               Cocos Gram +: Aerobios.
                             Capaz de tolerar gran cantidad de NaCl.
                                De bajo contenido en agua (desecación).
                                Género “Staphylococus”:
                                       S. Aureus: tóxico en alimentos.
                                       S. Epidermis: en nuestra flora de la piel.
                                 Género “Sarcina”: acumula pigmentos (carotenos).
                  B. Lácticas: Anaerobios.
                               Formadas por cocos y bacilos.
Incapaces de sintetizar grupos tipo “hemo” (son
“fermentativos obligados”).
Son capaces de tolerar O2.
        Catalasa: no lo tienen.
        SOD: no lo tienen.
Tienen una oxidasa (FLAVOPROTEÍNA)
       NADH        NAD+

      O2                     H2O
           NADH-oxidasa

       NADH        NAD+                           H2O
                                         Mn
      O2                     H2O2
                        pseudicatalasa
                                                   O2

El producto final de la fermentación es el “ácido
láctico”.
   Homofermentativo:
                                    NADH         NAD+
               GLUCOLISIS
    GLUCOSA                  PIRUVICO                   LÁCTICO
                                    LACTATO DESHIDROGENASA
Heterofermentativo:
    No tienen la “aldolasa” (enzima básico de la
    glucolisis); no pueden romper la F-6-P.

      GLUCOSA           GLUCONATO-6-FOSFATO
                          CO2

                          RIBOSA-5-FOSFATO



                          PENTOSAS FOSFATO




                        G-3-P       ACETIL FOSFATO



      A. LÁCTICO        PIRUVATO       ETANOL



LACTOBACILUS:
   Bacilos.
   Especies homofermentativas / heteroferment.
   Asociadas a productos lácteos:
         Delbrukii supbulgaris / acidofilus.
LEUCONOSTOC:
                      Son fermentativos.
                      Forman coco-bacilar..
                      “leuconostoc mesenteroides”:
                             Vegetales: pepinillos, ….
                      Tolera alta [azúcares].
                STREPTOCOCUS:
                    Lactococos: en productos lácteos.
                    Enterococos: en flora intestinal.
                    Streptococos: producen enfermedades.
                           S. mutans (producen caries)
                           S. Neumoniae (causa neumonia)
                           S. thermophilus (en el yogur).

B. Endosporas: La >ia son bacterias del suelo (ventaja ecológica).
               Género bacilus:
                      Aerobios (catalasa + SOD).
                      Formador de endosporas.
                      Son los + abundantes del suelo.
                      Existen importantes especies para la
                      producción de antibióticos.
Otras especies importantes para la
       intoxicación alimentaria (B. cocus).
       Otras son patógenas de animales.
       (B.antracis).
       Otras son patógenas de insectos (B.
       thuringiensis); insecticidas biológicos.

Género clostridium:
       Anaerobios estrictos.
       Metabolismo fermentativo.
       Algunas sintentizan catalasa, pero poco.
       Funciones industriales (fermentar alcohol)
       Algunas fermentan la celulosa (mezcla con
       combustible y etanol para biocombustible)
      Algunas fermentan grasa,           proteínas
      cárnicas (c. cadaveris),…
          c. perfringens: intoxicación alimentaria
          c. botulinum: produce neurotoxina, vive
                          en el suelo y es mortal.
          c. tetanii: vive en el suelo.
   Alto contenido en G+C:
       Bacterias del ácido propiónico:
                Crece a partir del azúcar y la leche.
                Se aisló por primera vez del queso (emental suizo)
                                                                      A PROPIÓNICO

                          LACTOSA            A. LÁCTICO               A ACÉTICO

                               b. lacticus                 Propioni
                                                                      CO2
                                                          bacterium

       Bacterias Streptomyces:
                Se clasifican según las ramificaciones de las esporas.
                Son filamentosas y del suelo.
                Son productores de antibióticos.
       Bifidobacterias:
                Género bifidobacterium:
                      Produce ácido láctico.
                      Viven en el tracto intestinal de los lactantes (bebés)
                      No se implanta en el intestino pero beneficia la flora.
                      Anaerobio.
                      Ruta fermentación láctica ≠ al de bacterias lácticas.
Glucolisis.
El Ciclo de Kalvin.
ÁREA DE CONTROL DE CALIDAD Y DE SEGURIDAD ALIMENTARIA



            JAIME FISAC PONGILIONI
                    Ingeniero Agrónomo
                          Col. Nº 4578 COIACC
                           Col. Nº 3199 COIAL

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MÓDULO 5: Microbiología de los Alimentos (Parte 1)

  • 1. AREA DE CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA MÓDULO 5 EL SISTEMA DE AUTOCONTROL EN LA INDUSTRIA AGROALIMENTARIA “MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS” (Parte I) JAIME FISAC PONGILIONI Ingeniero Agrónomo Madrid, Noviembre de 2012 Col. Nº 4578 COIACC Col. Nº 3199 COIAL
  • 2. ÍNDICE PARTE I: 1 INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA. 2 CRECIMIENTO MICROBIOLÓGICO. 3 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. 4 ACTIVIDADES DE LOS MICROORGANISMOS. 5 DIVERSIDAD MICROBIOLÓGICA.
  • 3. 1 INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA Bacterias Microorganismos Celulares: Hongos Protozoos Viroides Microorganismos Acelulares: Priones Virus Organizacíón Procariota (archaea/bacterias) Organismos Celulares: Organización Eucariota (eucaria/algas, hongos, protozoos) PROCARIOTAS Peptidoglicano: N-acetilglucosamina Polisacáridos: Ácido acetil-murámico Unidos por aa Péptidos cortos Endosporas; resistencia a cosas (Tª conservación de alimentos).
  • 5. Bacterias Gram + ácidos ácido proteína teicoicos lipoproteico peptidoglicano Espacio periplasmático Relacionado con la síntesis de peptidoglicano membrana plasmática (8nm) fosfolípido proteína integrada
  • 6. Bacterias Gram - Polisacárido-O polisacárido Núcleo del Lípido-A Porteína Membrana Porina Externa Fosfolípido 8 nm Periplásmico lapoproteína Espacio peptidoglicano membrana plasmática (8nm)
  • 7. Estructura del Lipopolisacárido (LPS) Lípido-A KDO (cetodesoxioctanato) C8 glucosamina Núcleo del Polisacárido “O” polisacárido (específico)  el lipopolisacárido es tóxico en animales superiores; la toxicidad está en el Lipido-A (endotoxina).  es permeable a moléculas pequeñas; PORINAS (canal que se satura de agua y hay moléculas pequeñas que la atraviesan). Hay porinas especificas y no especificas.  es impermeable a moléculas grandes. Crea un espacio periplasmático entre la membrana plasmática y el peptidoglicano. Está relacionado con la síntesis de peptidoglicanos.
  • 8. Tinción de Gram. COLORANTE G(+) G(-) Violeta cristal + + Iodo Cristal Cristal Alcohol Sigue violeta Decolora la célula (decolorante) (cierre de poros) (disuelve los cristales) Zafranina Sigue violeta Color rojo (colorante rojo)
  • 10. Comparación entre una célula Eucariota y una Procariota. Estructura Procariota Eucariota
  • 12. Diferencias entre Endosporas y Células Vegetativas.
  • 13. Diferencias entre el ARN ribosómico de Archaea/Bacteria/Eukarya.
  • 14. 2 CRECIMIENTO MICROBIOLÓGICO Tiempo de Generación (TG) = Tiempo de Duplicación. Tiempo en pasar de n a 2n. Es siempre el mismo para una misma especie bajo las mismas condiciones. Crecimiento Exponencial: N0 log N = N0 * 2n logN = logN0 + n*log2 n= N0 log 2 dx nº de células o de cosas que yo quiero ver = µ*x dt constante de crecimiento específico (h-1) define el crecimiento óptimo crecimiento Ln x x0 x = x0 * e µ(t–t0) Ln x – Ln x0 = µ * (t-t0) µ= t-t0 Si (t-t0) = TG : x = 2 * x0 Ln 2 2* x = x0 * e µ(t–t0) TG = µ x = x0 * e µ(t–t0)
  • 15. Curva de Crecimiento típica para una población microbiana: FASES DE CRECIMIENTO LATENCIA EXPONENCIAL ESTACIONARIA MUERTE 9.0 1.0 turbidez óptica 0.75 Log organismos viables/ml (densidad óptica) 8.0 viables densidad óptica 0.50 7.0 0.25 6.0 5.0 tiempo
  • 16. Medidas directas del Crecimiento Microbiológico: A) Recuento de células totales. sólidos  Método del recuento directo en líquidos B) Recuento de células viables: células vivas  Método de siembra por extensión en placa.  Método de siembra por vertido en placa. 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml (1/10) (1/100) (1/1000) (1/10000) : diluciones 159 colonias Factor de dilución 102 159 x 1000 = 1,59 * 105 (células / ml muestra original)
  • 17. Las Industrias Agrarias y Alimentarias usan los “Sistemas de Cultivo Continuos”: S Flujo constante de sustrato MEDIO FRESCO DEL RESERVORIO REGULADOR DE FLUJO GAS/ AIRE ESTÉRIL ESPACIO DE CABEZA GASEOSA X S y X constantes: controlando S controlo X CULTIVO S EFLUENTE DE CÉLULAS MICROBIOLÓGICAS
  • 18. Factores que afectan al crecimiento microbiológico: Temperatura: A mayor Tª las reacciones químicas y enzimáticas son más rápidas, pero llega a un punto donde se inhibe el crecimiento. Cada organismo tiene sus temperaturas cardinales: Tª mínima: Por debajo de ésta no existe crecimiento. Tª óptima: Crecimiento rápido (+ cerca de Tªmáx que de Tªmin). Tª máxima: Por encima de la cuál no existe crecimiento. GELIFICACIÓN DE LA MEMBRANA (transporte lento: existe crecimiento) Tª Tª min Tª opt Tª max DESNATURALIZACIÓN PROTEICA
  • 19. Organismos PSICRÓFILOS: Tª óptima < 15 ºC PSICRÓFILOS ESTRICTOS: por encima de 15-20 ºC mueren. PSICRÓFILOS TOLERANTES: toleran bajadas bruscas de Tª. crecen a 0ºC. Tª óptima 20 – 40 ºC. Organismos MESÓFILOS: Tª óptima 30 - 37 ºC E. coli. E. coli Escherichia coli Organismos TERMÓFILOS: Tª óptima > 50ºC TERMÓFILOS TOLERANTES: Tª óptima 50 ºC. HIPERTERMÓFILOS: Tª óptima > 80 ºC. No en Eucariotas. Asociadas a procesos volcánicos. Casi todas Arqueobacterias.
  • 20. “Thermus Aquaticus”: En centrales eléctricas y calentadores. Tª optima 150 ºC. “Thermus Aquaticus polimerasa”: Técnica del PCR (medicina forense) TERMÓFILOS e HIPERTERMÓFILOS se usan en biotecnología, pues son muy estables y catalizan reacciones a altas temperaturas. Thermophilus Aquaticus
  • 21. pH: Para que exista crecimiento: 2 < pH < 10. También hay pH óptimos. Organismos ACIDÓFILOS: pH 2 – 5. Hongos. Zumo de limón pH = 2 Organismos NEUTRÓFILOS: pH 7. Agua Pura. pH citoplasmático es neutro. Organismos ALCALÓFILOS: pH > 7 (7 – 10). Bacillus (Gram +). Alcalófilos Extremos: Archaea
  • 22. Oxígeno: Organismos AEROBIOS: Crecen a tensiones de O2 normales: 21% de O2 en aire. MICROAERÓFILOS: Utilizan el O2 cuando está a niveles mas bajos que en el aire. A. FACULTATIVOS: Bajo ciertas condiciones nutritivas crecen tanto en condiciones aerobias como anaerobias. Organismos ANEROBIOS: Los que no respiran O2. A. AEROTOLERANTES: Toleran el O2. Crecen en presencia de O2 pero no pueden usarlo. A. ESTRICTOS: Inhibidos o mueren en presencia de O2. Bacterias: Clostridium (Bacilos Gram +) Sulfato-reductoras. Homoacetogénica.
  • 23. Los AEROBIOS / ANAEROBIOS TOLERANTES tienen enzimas capaces de destruir las formas tóxicas del O2: Formas tóxicas del O2: (ion muy tóxico) O2 + e- O2- Superóxido O2- + e- + 2H+ H2O2 Peróxido de H - H2O2 + e- + H+ H2O + OH Ión hidróxilo (Se forma debido a radiaciones) Enzimas que destruyen las 3 formas tóxicas: CATALASA: Elimina el H2O2 H2O2 + H2O2 2H2O + O2 ( ) PEROXIDASA: Elimina el H2O2 H2O2 + NADH 2H2O + NAD+ SUPEROXIDOSISMUTASA: Catalasa en combinación (SOD) O2 + O2 + 2H+ H2O2 + O2 ( ) Si tiene SOD tiene catalasa o peroxidasa
  • 24. Disponibilidad de Agua: Es necesaria para la célula. Se crea una presión de turgencia importante para crecer. Medio HIPOTÓNICO: La [ ] exterior < [ ] citoplasma La célula explota Medio HIPERTÓNICO: La [ ] exterior > [ ] citoplasma La célula se arruga Actividad de Agua: aw Presión de vapor del aire en equilibrio con una solución aw = Presión del agua pura a esa temperatura 0 < aw < 1 Ps aw = PH O 2
  • 25. Organismos HALÓFILOS: Requieren NaCl para crecer. Microorganismos marinos. H. DISCRETOS: Bajo requerimiento de NaCl (1- 6 %). H. HIPERTÓNICOS: Moderado requerimiento de NaCl (6 - 15%). H. EXTREMOS: Crecen en ambientes muy salinos 15 – 30 % para crecimiento óptimo Organismos OSMÓFILOS: Los microorganismos crecen en [ azúcares ]. Crecen en frutas. Organismos XERÓFILOS: Los microorganismos crecen en ambientes muy secos. Solutos Compatibles: Para no arrugarse, el microorganismo sintetiza solutos para aumentar la tensión osmótica en su interior.
  • 26. Medición del Crecimiento Microbiológico:
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  • 34. 3 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS TÉCNICAS de OBSERVACIÓN MICROSCOPÍA ÓPTICA: Microscopio óptico o de campo brillante. AUMENTO: Con lentes convexas (a + convexa + aumento). CONTRASTE: Consiste en diferenciar la imagen del fondo. Depende de la absorción. Añadimos colorante a la muestra. RESOLUCIÓN: Capacidad para ver 2 puntos como 2 puntos y no como 1. “Poder de resolución”: distancia mínima para ver 2 (t) puntos como 2 puntos. longitud de onda λ 150 t = 200 t = Índice de refracción 2 * AN Tamaño de la lente ¡¡ no lo veo !! Apertura Numérica = n * senϴ
  • 35. Microscopio óptico: simple x 10 ocular 2 lentes x 20 Compuesto (2 lentes) x 10 objetivo 3 lentes x 40 para x 100 inmersión Microscopio óptico de campo oscuro: aumenta el contraste Podemos ver muestras frescas (sin teñir); células vivas. Tinciones: Simples: compuestos ácidos/básicos cargados. matamos a las células (desventaja). fijación a la llama. Diferenciales: tinción de Gram. tinción ácido-alcohol resistencia (para cepas de mycobacterium). Específicas: de esporas. de flagelos. negativa (cápsula).
  • 36. Microscopio Electrónico de Transmisión: M.O. M.E.T. HAZ Luz Electrones MUESTRA En pletina de cristal En pletina de metal (al vacío) ENFOQUE Sistema de lentes Sistema de lentes electromagnéticas IMAGEN FINAL Imagen real Microfotografía de fluorescencia AUMENTO Hasta 1.000 aumentos Hasta 200.000 aumentos RESOLUCIÓN Hasta 200 nm Hasta 1nm Muestra: al vacío. Corte en la parafina con una cuchilla (microtomo). Tinción con metales pesados. Técnica empleada: Criofractura. Criograbado. Sombreado metálico (para los Virus).
  • 37. Microscopio óptico: De campo brillante. De campo oscuro. Por contraste de fases: Basada en la diferencia de índice de refracción de los ≠ componentes de la muestra (imagen tridimensional). Fluorescente: Técnicas con fluorocromos o marcación con sonda. Con focal: Microscopía antigua. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA: Con esto la λ. Calentamos hilos de tulsteno a 3.000 ºC y creamos un chorro de e- con una ddp altísima. λ d= 2*AN 1,5 1,5 0,055 λ= V (voltaje) = 300 = 0,055 nm d= 2*300
  • 38. Microscopio Electrónico de Transmisión: Recogemos los electrones secundarios que emiten la muestra al ser bombardeado por electrones primarios. Para observar células enteras. Tienen baja capacidad de resolución (1.000 aumentos; 20nm). Cubrimos con metales para acentuar las diferencias. virus m. electrónico. bacterias m. óptico. membrana externa de una Gram (-) m. e. de transmisión. TÉCNICAS de CULTIVO Cultivo axénico cultivo puro (1 sola especie de 1 sola célula). Condiciones estériles no contaminación cond. asépticas. Medio de cultivo Para hacer crecer los microorganismos. Condiciones óptimas de cultivo especie.
  • 39. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN: ESTERILIZACIÓN AL CALOR: Calor Húmedo: Autoclave (1 atm). Vapor de agua 120 ºC sin hervir. 20 min en esterilizar. Cualquier cosa miscible con el agua se autoclava. Calor Seco: En horno: 180 ºC / 2-3 horas. Materiales que aguanten altas temperaturas. A la llama (mechero). FILTRACIÓN: Separamos los m.o. del material a esterilizar. Sustancias termolábiles (aa, proteínas, …)
  • 40. Tipos de filtros: De profundidad (de celulosa). De membrana ( 0,2-0,4 micras de tamaño de poros). Nucleopore (hechos los poros con radiaciones – sin cont) HEPA (para filtrar el aire - cabina de flujo laminar). ESTERILIZACIÓN CON COMPUESTOS QUÍMICOS: en frio. Matamos al m.o. con: Germicida. Microbicida ( bactericida, viricida, fungicida, …) Microbioestáticos: No los mata pero inhibe su crecimiento. Toxicidad selectiva: Dependiendo de la t.s. tenemos: Desinfectante: superficies inanimadas. Ej:alcohol. Antiséptico: superficies de tejido como uso tópico. Ej. alcohol Quimioterapéutico: no tóxico para nosotros.
  • 41. Fenoles y Alcoholes: Desestabilizan los lípidos de membrana. Desinfectante (piel) y antiséptico. Halógenos y H2O2: Para agentes oxidantes. Metales pesados: Son muy tóxicos. Mercurio de cromo. Detergentes: Agente surfactante. Gases: Matan a las esporas. Óxido de etileno y Formaldehido. Son muy tóxicos. Esterilizamos con bajas dosis.
  • 42. 2 técnicas de aislamiento de m.o.: Método de siembra en estría o placa. CULTIVOS AEROBIOS Método de diluciones sucesivas. CULTIVOS ANEROBIOS Medio de Cultivo: Nutrientes. Macronutrientes: C, H, O, N, P, S, K, Mg, Na, Ca, Fe. Micronutrientes: Fe (elementos traza). NUTRIENTES: Síntesis de la estructura celular y crecimiento (Fuente ANABOLISMO de C) Obtención de Energía CATABOLISMO FUENTE DE C: CO2 atmosférico AUTÓTROFO Componentes orgánicos HETERÓTROFO
  • 43. FUENTE DE ENERGÍA: Luminosa (luz): autótrofo FOTOAUTÓTROFO heterótrofo FOTOHETERÓTROFO Por compuestos químicos: autótrofo QUIMIOAUTÓTROFO heterótrofo QUIMIOHETERÓTROFO Medio de cultivo: Complejo: Ponemos un poco de todo con una fuente de Carbono (azúcar). Definido: Sabemos la composición exacta. Selectivo: Para que crezca un determinado m.o. Diferencial: Para poder distinguir dos microorganismos distintos (Agar, caldo peptonado, LIA, …)
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  • 59. 4 ACTIVIDAD DE LOS MICROORGANISMOS VISIÓN DEL METABOLISMO: Reacciones químicas que tienen lugar en el interior de la célula. 1.- Entrada de nutrientes en la célula. 2.- Síntesis. 3.- Ensamblaje. Productos Precursores: Energía para todos los procesos del metabolismo. Reacción ANABÓLICA POLIMERIZACIÓN ESTRUCTURA (biosíntesis) CELULAR NUTRIENTE Reacción CATABÓLICA (productor de energía) Metabolitos Precursores Poder Reductor (NADH) Energía (ATP)
  • 60. PRINCIPALES RUTAS CATABÓLICAS: Metabolitos precursores: Son 12 compuestos esenciales. Ninguna ruta por sí sola da los 12 compuestos. Poder Reductor: Reacciones de Oxido-Reducción (RedOx) Transferencia Oxidación: ceder e- (Lo ceden los átomos de H) de protones Reducción: ganar e- Potencial de reducción: E0´ (mv) E0´ (mv) < 0 capacidad para ceder e- E0´ (mv) > 0 capacidad para ganar e- Glucosa como fuente de energía: funciona bien como dador de e- Proteínas transportadoras del PR: Libres en el citoplasma: NAD+ ó NAP respiración Asociadas a membranas: Forma la cadena de e- fotosíntesis
  • 61. Energía: Enlaces ricos en energía: Enlaces tipo fosfato (ATP es el más alto) No todos los fosfatos son energéticos Síntesis de ATP: Fosforilación a nivel de sustrato PEP Piruvato Compuesto orgánico fosforilado Molécula de Fosfato de alta Energía ADP ATP Fosforilación oxidativa En las membranas: ATPasa ó ATPsitetasa  Introducen H+  Sintetiza ATP para el gradiente de protones
  • 62. GLUCOLISIS: 1 glucosa  2 piruvato + 2ATP + 2NADH ATP ATP GLUCOSA G-6-P F-6-P F1,6-BP Muy inestable (C6) aldolasa DHAP (C3) ADP ADP NAD Muy inestable PIRUVATO PEP 1,3-BPG G3P (C3) ATP ATP NADH Comienzan las oxidaciones ENTNER-DOUDOROFF: 1 glucosa  2 piruvato + 1ATP + 2NADH ATP NADH H2O ÁCIDO 6 FOSFO GLUCOSA G-6-P GLUCÓNICO αKDG aldolasa PIRUVATO GLICERALDEHIDO PIRUVATO FOSFATO
  • 63. PENTOSAS FOSFATO: 1 glucosa  2 piruvato + 1ATP + 3NADH ATP NADH ÁCIDO 6 FOSFO GLUCOSA G-6-P GLUCÓNICO ADP CO2 NADH RIBULOSA 6 PIRUVATO G-3-P FOSFATO Desde PIRUVICO puedo:  Para BIOSÍNTESIS.  Seguir OXIDANDO para obtener energía hasta el final (CO2) respirando, pero hay m.o. que no respiran (el Piruvico de las PF no se oxida más!!!). RESPIRACIÓN: Proceso en el cual un compuesto es oxidado con O2 (o un sustituto de O2), que funciona como aceptor terminal de e- y que normalmente se acompaña de la producción de ATP por Fosforilación Oxidativa. R. ANAERÓBICA: en lugar de O2, el último aceptor de e- es otra sustancia (SO42- ó NO3- )
  • 64. CICLO DE KREBS: oxidaciones CO2 Fosforilación a nivel de sustrato OXALACETATO GLUCOSA ACETIL-CoA SUCCINATO CO2 piruvico (glucolisis)  2 x [3CO2 + 4NADH + 1FADH + 1GTP] El ciclo completo sólo lo tienen algunos m.o. Los que no lo tienen completo, contienen un enzima para descarboxilar. Aceptores de e- : 1.- FADH – Deshidrogenasa. 2.- Flavoproteína. 3.- Ferredoxina (sólo capta e- , los H+ los echa fuera).
  • 65. NADH Deshidrogenasa e- H+ FLAVOPROTEÍNA e- Energía + H “Protón-Motriz” FERREDOXINA H+ H+ e- e- QUINONA CITOCROMO
  • 66. EJEMPLO 1: “Fermentación Homoláctica” 2 Hlac + 2 ATP Fermentación de ácido láctico de la leche para formar yogur. PIRUVICO NADH lactato deshidrogenasa NAD+ ÁCIDO PIRUVICO el pH y precipita la caseína EJEMPLO 2: “Fermentación Alcohólica” Glucosa  2 Etanol + 2CO2 + 2ATP PIRUVICO NADH NAD+ CO2 ACETALDEHIDO ETANOL alcohol deshidrogenasa La fermentación alcohólica de la ruta de E.D. la produce la bacteria Zymomonas (Gram -, anaerobia facultativa), indeseables en la industria alcohólica y de bebidas.
  • 67. EJEMPLO 2: “Fermentación Heteroláctica” ATP NADH NADH GLUCOSA RIBULOSA (C5) (C6) (C3) PIRUVICO ACETIL-PIRUVICO NADH + ATP NADH NAD+ ÁCIDO LÁCTICO ETANOL 1Glucosa  1Hlac + 1Etanol + 1CO2
  • 68. ATP-sintetasa: mete los H+ que han salido. actúa como un canal de H+. une un Pi a un ADP para formar ATP. RESPIRACIÓN: AEROBIA: El último aceptor de e- es el O2. O2/H2O poder reductor muy alto ANAEROBIA: El último aceptor de e- no es el O2. El salto energético es más bajo. Vía de asimilación del NITRATO: Como NITRATO: ruta normal (plantas, hongos, …) Como NITRITO: cede un e- de Nitrato a Nitrito.
  • 69. FERMENTACIÓN: “Catabolismo anaeróbico en el que un compuesto orgánico sirve al mismo tiempo como donador y aceptor de e- y en el que el ATP se produce por fosforilación a nivel de sustrato” No existe oxidación total de la fuente de energía. No existe donador final de e- Todas las reacciones están “balanceadas” internamente. Hay que “gastar” el poder reductor (NADH) reduciéndolo. F-6-P F-1,6-B-P G-3-P D-H-A-P 1,3-B-P-G P-E-P PIRUVICO GLUCOLISIS GLUCOSA G-6-P αKDG PIRUVATO G-3-P A6PG PIRUVICO ENTNER DOUDOROFF R-6-P G-3-P PIRUVICO PENTOSAS FOSFATO
  • 70. FUENTE DE FUENTE DE SERES ENERGÍA CERBONO QUIMIOAUTÓTROFOS compuestos orgánicos CO2 (QUIMIOLITOTROFOS) luz CO2 FOTOAUTÓTROFOS compuestos orgánicos compuestos orgánicos QUIMIOHETERÓTROFOS AUTÓTROFOS 18 ATP Fijación de CO2 Ciclo de KALVIN 12 NADPH 6 moléculas de CO2 1 molécula de Fructosa FUENTE DE ENERGÍA - Luz ATP NADPH FOTOSÍNTESIS - Compuestos Químicos ATPasa (capta los e- del compuesto químico directamente) (el CQ es el donador de e-)
  • 71. 5 DIVERSIDAD MICROBIANA BACTERIAS Origen de la vida ARCHEOBACTERIAS PROCARIOTAS ESTROMATOLITOS: Masas microbianas laminadas, construidas por capas de organismos filamentosos y no filamentosos que pueden encontrarse fosilizados. TEORÍA Mitocondria y cloroplastos fueron en su día dos bacterias ENDOSIMBIÓTICA: de vida libre. El microorganismo endosimbionte era fotosintético (da lugar a las plantas) CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS Clasificación que nadie acepta: Reino Animal / Plantas / Fungi / Monera / Protista hongo protozoo procariota Cronómetro Molecular: ARNr 16S eucariota 18S procariota
  • 72. BACTERIAS clasificación: dominio + reino ARCHAEA sección EUCAREA (eucariotas) clase órden familia BACTERIAS: género especie - Microorganismos Fotosintéticos:  Bacterias Verdes. Tienen clorosomas para acumular la energía.  Bacterias Rojas ó Purpúreas. Acumula en la membrana citoplasmática pigmentos para acumular energía. Las BV y BR: No producen CO2 Fotosíntesis anoxigénica Solo 1 fotosistema Tienen bacterioclorofilas: BV: b, A, C, D, F. BR: b, A, B. El tipo de luz que necesitan determina el hábitat. Carotenos (efecto protector contra ciertas λ.
  • 73. “fotosíntesis cíclica” (no donador ext. de e-) Sólo se forma ATP (luz ATP) FOTOFOSFORILACIÓN CICLICA El NADPH surge de: H2: dona los e- de NADP a NADPH HS-: no lo dona directamente. La cadena de e- va al revés. - TRANSPORTE INVERSO DE e Viven en lagos, estanques y fuentes termales.  Cianobacterias. Ficobiliproteina en cianobacterias (Ficociana da color azul). Tienen tilacoides, Fotosistema I (fotosíntesis oxigénica) y II. Tienen la Clorofila A. Crecen en suelos (fertilizantes en suelos). “Azolla”, “Anabaena” (bacteria): hace la fotosíntesis y fija nitrógeno atmosférico (plantación de arroz). Hacen la misma fotosíntesis que las plantas. La luz: forma el grad de protones y dona e- (NADP NADPH)
  • 74. Microorganismos Quimiolitotrofos:  Bacterias del Azufre. HS- dona los e- a la Quinolona y se crea el grad en la membrana forma ATP. Para sintetizar NADPH “Transporte inverso de e-” No es necesaria reacción metabólica.  Bacterias del Hierro. H+, H+ ATP Aerobia y pH ácido (acidófilo). Fe2+ O2 Oxida el Fe2+ a Fe3+ . pH 2-3 pH 6 Fe3+ H2O En arroyos de minerías. EXTERIOR INTERIOR Microorganismos Quimioheterótrofos:  Bacterias Aerobias. Pseudomonas: Siempre respiran. Hacen la ruta de E. Doudoroff. Metabolizan gran cantidad de compuestos. Proceso descontaminante: BIORREMEDIACIÓN Proceso de lucha biológica (sideróforos: acompleja todo el Fe para que el patógeno no lo pueda utilizar).
  • 75. “Pseudomona syringae”: patógenos vegetales. Presentes en hojas y no actúan si no hay condiciones ambientales adversas (frío, heladas, …). Produce clorosis. F. Rizobiaceas: “Rizobium”: Fija N atmosférico (leguminosas). La bacteria está en los nódulos radicales de la raíz: N2 NH3 vegetal La planta es fuente de C y de E. Se protege el O2 y se produce la “leghemoglobina”, que lo sintetiza la planta y se lo da a la bacteria para que atrape el O2. Relación planta – bacteria es específica.
  • 76. Ingeniería Genética: Agrobacterium: “Tumefaciens”: Nos quedamos con las “oparinas” Produce tumores en el tallo. (productor del tumor) que crea los genes oncogénicos y nos quedamos con “Rhizogenes”: su DNAt y en ésta región inyectamos lo Produce tumores en la raíz. que queremos cultivar. Bacteria del Acumula ácidos orgánicos. Ácido Acético: “gluconobacter”: no es superoxidante. “acetobacter”: es superoxidante (oxida el HAc hasta CO2). Sorbitol: la “sorbosa” produce el “ácido ascórbico” (proceso de BIOCONVERSIÓN) G. Zimomonas: Produce la “fermentación alcohólica” por la ruta de E. Doudoroff. En algunos sitios se una para fermentar en lugar de usar levadura (“pulque” para hacer tequila, sidra, cerveza, miel,…). También produce la fermentación de etanol. G. Vibrio: Algunas especies están asociadas a enfermedades. “Vibrio cholerae” en agua contaminada. “Vibrio parahemoliticus” organismo marino (en marisco).
  • 77. Bacterias Anerobias. Bacterias Bacilos no esporulados. Entéricas: Anaerobios y facultativos. Grupo homogéneo de bacterias. Fermenta muchos azúcares y forma gases. Hay mezcla de muchos compuestos a la vez. FERMENTACIÓN ÁCIDO-MIXTA. FERMENTACIÓN BUTANO-DIÓLICA. FERMENTACIÓN ÁCIDO-MIXTA. Se forma: ácido acético, ácido láctico, ácido succinico, etanol, CO2 , H2. Grupo Escherichia: Anaerobio facultativo. Vive en el intestino grueso (si está en el i. delgado produce enfermedades endéricas (diarreas). Nos proporciona Vitamina-K. Se usa como grupo indicador de contaminación. Género Shigella: Fuertes alteraciones (toxinas muy fuertes). Parecidas a E. coli. Género Salmonella: Produce cepas patógenas. Existen muchas variedades. Clasificación: S.K, S.O, S.H
  • 78. Género Yersinia: Gram -, aerobios y anaerobios facultativos. FERMENTACIÓN BUTANO-DIÓLICA: Se acumula y se produce “butano-diol”. Enterobacter: Gram -, anaerobia facultativa. Ifecciosas o descomponedoras. Klebsiella:Gram -, anaerobia facultativa. BACTERIAS GRAM (+):  Bajo contenido en G+C: Cocos Gram +: Aerobios. Capaz de tolerar gran cantidad de NaCl. De bajo contenido en agua (desecación). Género “Staphylococus”: S. Aureus: tóxico en alimentos. S. Epidermis: en nuestra flora de la piel. Género “Sarcina”: acumula pigmentos (carotenos). B. Lácticas: Anaerobios. Formadas por cocos y bacilos.
  • 79. Incapaces de sintetizar grupos tipo “hemo” (son “fermentativos obligados”). Son capaces de tolerar O2. Catalasa: no lo tienen. SOD: no lo tienen. Tienen una oxidasa (FLAVOPROTEÍNA) NADH NAD+ O2 H2O NADH-oxidasa NADH NAD+ H2O Mn O2 H2O2 pseudicatalasa O2 El producto final de la fermentación es el “ácido láctico”. Homofermentativo: NADH NAD+ GLUCOLISIS GLUCOSA PIRUVICO LÁCTICO LACTATO DESHIDROGENASA
  • 80. Heterofermentativo: No tienen la “aldolasa” (enzima básico de la glucolisis); no pueden romper la F-6-P. GLUCOSA GLUCONATO-6-FOSFATO CO2 RIBOSA-5-FOSFATO PENTOSAS FOSFATO G-3-P ACETIL FOSFATO A. LÁCTICO PIRUVATO ETANOL LACTOBACILUS: Bacilos. Especies homofermentativas / heteroferment. Asociadas a productos lácteos: Delbrukii supbulgaris / acidofilus.
  • 81. LEUCONOSTOC: Son fermentativos. Forman coco-bacilar.. “leuconostoc mesenteroides”: Vegetales: pepinillos, …. Tolera alta [azúcares]. STREPTOCOCUS: Lactococos: en productos lácteos. Enterococos: en flora intestinal. Streptococos: producen enfermedades. S. mutans (producen caries) S. Neumoniae (causa neumonia) S. thermophilus (en el yogur). B. Endosporas: La >ia son bacterias del suelo (ventaja ecológica). Género bacilus: Aerobios (catalasa + SOD). Formador de endosporas. Son los + abundantes del suelo. Existen importantes especies para la producción de antibióticos.
  • 82. Otras especies importantes para la intoxicación alimentaria (B. cocus). Otras son patógenas de animales. (B.antracis). Otras son patógenas de insectos (B. thuringiensis); insecticidas biológicos. Género clostridium: Anaerobios estrictos. Metabolismo fermentativo. Algunas sintentizan catalasa, pero poco. Funciones industriales (fermentar alcohol) Algunas fermentan la celulosa (mezcla con combustible y etanol para biocombustible) Algunas fermentan grasa, proteínas cárnicas (c. cadaveris),… c. perfringens: intoxicación alimentaria c. botulinum: produce neurotoxina, vive en el suelo y es mortal. c. tetanii: vive en el suelo.
  • 83. Alto contenido en G+C: Bacterias del ácido propiónico: Crece a partir del azúcar y la leche. Se aisló por primera vez del queso (emental suizo) A PROPIÓNICO LACTOSA A. LÁCTICO A ACÉTICO b. lacticus Propioni CO2 bacterium Bacterias Streptomyces: Se clasifican según las ramificaciones de las esporas. Son filamentosas y del suelo. Son productores de antibióticos. Bifidobacterias: Género bifidobacterium: Produce ácido láctico. Viven en el tracto intestinal de los lactantes (bebés) No se implanta en el intestino pero beneficia la flora. Anaerobio. Ruta fermentación láctica ≠ al de bacterias lácticas.
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  • 100. El Ciclo de Kalvin.
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  • 112. ÁREA DE CONTROL DE CALIDAD Y DE SEGURIDAD ALIMENTARIA JAIME FISAC PONGILIONI Ingeniero Agrónomo Col. Nº 4578 COIACC Col. Nº 3199 COIAL