1. Mutaciones genéticas en tumores GIST
Irene González García, Juan Francisco González Vera y Jorge Gorrín Ramos
Tutor: Dr. Eduardo Salido Ruiz.
Co-tutoras: Dra. Nieves Hernández León; Dra. Débora Riverol Martín.
Introducción. Los tumores tipo GIST o tumores del estroma gastrointestinal se
clasifican como sarcomas de tejido blando y son la neoplasia mesenquimal más
frecuente del tracto gastrointestinal. Fundamentalmente expresan mutaciones en los
genes c-KIT y PDGFRα, con pronósticos y tratamientos diferentes. El correcto
diagnóstico patológico mediante pruebas inmunohistoquímicas así como el diagnóstico
molecular constituyen procedimientos fundamentales para establecer las terapias
adecuadas.
Objetivos. Aprender durante la realización del estudio sobre el diagnóstico de los
tumores tipo GIST y profundizar en la mecánica de trabajo de un laboratorio así como
en el proceso de secuenciación genética. Nuestro estudio pretendía determinar asimismo
la frecuencia en la que se manifiestan las diferentes mutaciones.
Material y Método. Contando con la colaboración de la unidad de Anatomía Patológica
del HUC, que nos proporcionó las muestras, procedimos a la extracción del DNA de las
células cancerosas. Posteriormente amplificamos el material mediante PCR y
secuenciamos los genes c-KIT y PDGFRα.
Resultados. Durante el periodo de seguimiento fueron analizadas 34 muestras
procedentes del HUC. El 11,8% de ellas presentaban mutaciones en el gen PDGFRα,
mientras que el 73,5% las mostraba en el gen c-KIT. En el resto (14,7%) no fue posible
determinar mutaciones.
Conclusiones. Tras la realización de los análisis, nos hemos familiarizado con la
mecánica de trabajo en un laboratorio de diagnóstico molecular y con la determinación
de mutaciones somáticas en las células tumorales. Este tipo de pruebas, que conducen a
un diagnóstico y un tratamiento más personalizados, suponen el inicio de una sanidad
que será más efectiva.
Palabras clave: tumores del estroma gastrointestinal, GIST, c-KIT, PDGFRα, Imatinib,
anatomía patológica, diagnóstico molecular, secuenciación genética, opciones
terapéuticas.
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2. Genetic mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors
Irene González García, Juan Francisco González Vera y Jorge Gorrín Ramos
(3th year students of Medicine).
Supervised by:
Eduardo Salido Ruiz, MD, PhD;
Nieves Hernández León, MD;
Débora Riverol Martín, MD.
ABSTRACT
Background. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs), regarded as soft tissue sarcomas,
are the most frequent mesenchymal neoplasms of the gastrointestinal tract. GISTs
usually show certain mutations in the c-KIT and the PDGFRα genes, being both
associated to different prognostic and therapeutic choices. Their molecular typing as
well as a more accurate pathological diagnosis by immunohistochemical testing seem
essential to find suitable treatments.
Objectives. This study aimed at refining our knowledge about GIST diagnosis and
certain typical lab genetic sequencing processes. Our purpose was also to determine the
incidence of certain mutations.
Materials and Methods. The Pathology Research Unit at our university hospital
(Hospital Universitario de Canarias, HUC) provided us with the study samples. After
DNA extraction from the cancer cells, we amplified the materials by polymerase chain
reaction (PCR) and then sequenced the c-KIT and PDGFRα genes.
Results. During the follow-up period 34 samples were analyzed. As much as 73.5% of
them showed some kind of mutation in the c-KIT gene whereas only 11.8% presented
some mutation in the PDGFRα gene. However, no cases could be determined in the
remaining 14.7% of the samples.
Conclusions. The present analysis allowed us to learn about somatic mutation
determinations in tumor cells and other routine laboratory procedures in molecular
diagnosis. The evidence thus obtained may lead us to find more precise diagnoses and
more individualized treatment options that may show the way to a more effective health
care service.
Key words: gastrointestinal stromal tumors, GIST, c-KIT, PDGFRα, Imatinib,
pathology, molecular diagnosis, genetic sequencing, treatment options.
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3. INTRODUCCIÓN:
Los tumores del estroma gastrointestinal (GIST), son tumores mesenquimales
que se originan en el tracto gastrointestinal, el epiplón, el mesenterio o el retroperitoneo
y suponen el 2% de todos los tumores gastrointestinales. La localización más frecuente
es el estómago (50%), seguido por el intestino delgado (20-30%), el intestino grueso
(10%), el esófago (5%); la frecuencia en el epiplón, mesenterio o retroperitoneo es
menor del 5% (27, 29). Aunque suele afectar a adultos, y en un 75% en pacientes de
más de 50 años, en raras ocasiones hay casos pediátricos que representan 1-2% de todos
los tumores GIST (31).
El GIST se origina de las células intersticiales de Cajal, un entramado celular
propio del tubo digestivo que permite el peristaltismo, coordinando las contracciones
musculares para que se produzcan en el momento preciso y con la intensidad y
dirección adecuadas.
Visión macroscópica de un GIST gástrico
Desde la publicación en el año 2001 por Joensuu (22), de un paciente con buena
respuesta al tratamiento con Imatinib, ha existido un cambio radical en el tratamiento de
estos pacientes en la enfermedad avanzada, con tasas de respuesta en torno al 50-60%.
Así mismo, aunque el tratamiento de elección es el quirúrgico en la enfermedad
localizada, existen controversias en ciertos pacientes con tumores localmente
avanzados, donde el tratamiento quirúrgico puede producir una alta frecuencia de
complicaciones o alteraciones funcionales. En estos casos, la toma de decisiones debe
ser realizada en un contexto multidisciplinario (cirujano, patólogo, radiólogo, oncólogo
clínico, gastroenterólogo, medicina nuclear). (28).
Junto con el correcto diagnóstico anatomopatológico y el diagnóstico diferencial
con otras entidades, en ocasiones de difícil resolución, otro aspecto muy importante, es
el análisis de mutaciones en estos tumores, donde según los últimos estudios en curso,
pueden tener implicaciones terapéuticas directas en la elección de la dosis inicial del
tratamiento. En el último consenso multidisciplinario de la ESMO, así como en otras
guías (28) se recomienda la incorporación del estudio molecular sistemático a todos los
tumores.
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4. Diagnóstico anatomopatológico
Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico de los GISTs es
morfológico e inmunohistoquímico (29). El análisis histopatológico revela dos patrones:
fusocelular y epitelioide o mixto.
A B
A. Corte histológico con Hematoxilina-eosina donde se observa un GIST de patrón
fusocelular, con moderada atipia nuclear. B. Corte histológico con Hematoxilina-
eosina donde se observa la proliferación tumoral mesenquimal infiltrando la lámina
propia de la mucosa gástrica. Con técnicas inmunohistoquímicas se demostró que se
trataba de un GIST.
El perfil inmunohistoquímico es crucial en el diagnóstico: CD-117 es
generalmente positivo, aunque existe un 5% de los GISTs CD-117 negativos; CD34 es
positivo en 60-70% de los casos y tan sólo el 5% lo es para S100; de los marcadores
musculares del 30-40% son positivos para actina específica de músculo, 1-2% para
desmina (ambos de distribución focal e intensidad leve) y un 85% positivos para h-
caldesmón lo que suele ser útil en los pocos casos que son CD117 negativos. Por último
se han descrito otros marcadores como DOG1 (36) que es positivo en el 85% de los
GIST y de éstos sólo el 74% eran positivos para CD117; además el 79% de los GIST
que tienen mutaciones en PDGFRα, fueron positivos para DOG1 y sólo el 9%
expresaban CD117. Otro marcador en estudio es la protein kinasa (37) que parece tener
utilidad en los casos CD117 negativos. En estos casos es de gran importancia, ante la
sospecha diagnóstica de un GIST, que se realice el análisis mutacional para confirmar el
diagnóstico.
Imágenes inmunohistoquímicas de CD-117 y CD-34 donde se demuestra positividad
intensa y difusa en las células tumorales para ambas.
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5. Dos de los parámetros que se han utilizado para predecir al riesgo de estos
tumores son el número de mitosis y el tamaño del tumor y con ello se elaboró un
esquema para el manejo de estos tumores por la NIH (38 y 39). Posteriormente se
añadió según el Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas Americanas (AFIP) la
localización como un parámetro importante a tener en cuenta para la valoración de
riesgo. Como indica la siguiente tabla:
Diagnóstico molecular
En 1998 Hirota (1) publica un artículo en la revista Science donde demuestra
que la mayoría de los tumores GIST presentan mutaciones activadoras en el
protooncogen KIT. El evento molecular que determina el desarrollo del GIST es la
activación de este receptor tirosin-quinasa KIT (c-KIT) o en menor proporción del
receptor tirosin-quinasa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα).
Dichas activaciones producen señales de transducción que llegan finalmente al núcleo,
donde activan la transcripción génica y contribuyen a la proliferación celular
incontrolada y resistencia a la apoptosis (1, 3, 35). La mutación de uno u otro tiene
implicaciones en el comportamiento clínico de estos tumores. Actualmente existen
fármacos diseñados para inhibir estos receptores (terapias diana dirigidas contra el
receptor) e inhibir por tanto el crecimiento de estas neoplasias.
5

6. Gleevec® (Imatinib) es un inhibidor de receptores de membrana con actividad
tirosin-quinasa (TK), como c-Kit y PDGFRA, relevantes en GISTs. También inhibe
otras moléculas con actividad tirosin-quinasa, como la molécula quimérica bcr-abl, de la
leucemia mieloide crónica, donde el Imatinib cosechó su primer éxito terapéutico.
Ejerce su acción mediante la unión competitiva al sitio activo tirosin-quinasa
bloqueando de este modo la cascada de señalización intracelular relacionada con la
supervivencia celular, proliferación celular y generación de metástasis.
Imatinib (rojo) unido a la estructura 3D de
la quinasa bcr-abl (verde).
Esquema de la función del receptor TK (A) y de su interacción con el Imatinib (B).
Espectro de mutaciones en GIST
Mutaciones en c-KIT (Fig. 1)
En 1988 se demostró, que no solo los tumores GIST expresan KIT, sino que
además 5 de cada 6 tumores analizados genéticamente eran portadores de
mutaciones en la región del KIT que codifica para el dominio yuxtamembrana
del receptor (exón 11) y que activa de forma constitutiva la actividad TK de KIT
en ausencia de ligando (1). Actualmente, dependiendo de las series analizadas, la
incidencia de mutaciones es del 60-92% (2, 30, 40). Las mutaciones se localizan
fundamentalmente en los exones 9, 11, 13 y 17 (Fig 1) y en algunos estudios la
técnica de HRM (high resolution melting) se ha usado como rastreo de las
mutaciones (33).
6

7. Fig. 1.
 Mutación más frecuente es la del exón 11, con tres tipos de alteraciones (4, 5, 6):
1. Deleciones que suelen afectar a la región 5´ del exón (entre los codones 550 y
560) especialmente a los codones Trp557- Lys558 que se relacionaron con un
peor pronóstico.
2. Mutaciones puntuales, que por lo general se limitan a cuatro codones (557, 559,
560 y 576).
3. Duplicaciones en el extremo 3´ de un determinado número de codones.
 Mutación en el exón 9 (dominio extracelular) se produce con una frecuencia del 9-
20%. De forma mayoritaria se encuentra un tipo de mutación correspondiente a la
inserción de seis nucleótidos que resultan en la duplicación de los aminoácidos
Ala501 y Tyr502, y se encuentran en los pacientes que carecen de la mutación en el
exón 11 (7). Esta mutación se asocia a tumores de localización más frecuente a nivel
intestinal y mayor potencial maligno. Por ello estos tumores que presentan la
mutación en el exón 9 de KIT parecen tener mejor supervivencia libre de progresión
con dosis más altas, siendo hoy en día un estándar en el tratamiento la dosis de 800
mg /día. Además el análisis mutacional permite excluir aquellos casos no sensibles a
la terapia con Imatinib.
 Mutaciones del exón 13 y exón 17 son extremadamente raras. En un estudio de 54
(34) casos se concluyó que la mayoría tenían un patrón fusocelular, que los de
localización gástrica con mutación en el exón 13 tenían un comportamiento más
agresivo que otros con otro tipo de mutaciones y que aquellos localizados en el
intestino delgado no había diferencias entre ellos.
7

8. Mutaciones en PDGFRα (Fig. 2)
En un 7-10% de los GIST podemos encontrar mutaciones en otro receptor TK, el
PDGFRα (40). Una característica importante en la patología molecular de estos tumores
es que las mutaciones en el KIT y en el PDGFRα son mutuamente excluyentes.
Fig. 2
Como en el caso del KIT las mutaciones se localizan fundamentalmente en los
exones 12, 14 y 18, equivalentes a los exones 11, 13 y 17 del KIT. Casi todos los casos
con este tipo de mutaciones son de localización gástrica, de patrón epiteliode y parecen
ser clínicamente menos agresivos con menor potencial de metástasis (30, 39). Muchos
de esto tumores expresan de forma focal o son completamente negativos para CD117.
Tumores sin mutaciones
Existe un subgrupo de tumores (aproximadamente un 5% de los casos) que no
tienen ninguna de las mutaciones de c-KIT ni de PDGRFα aunque pueden ser positivos
para CD117. Por contra existe un grupo que expresa muy débilmente o no expresan
CD117 aunque cumplen los demás criterios, como la presentación clínica, la
localización anatómica, la morfología para diagnosticarlos como GIST y pueden
presentan mutaciones del KIT o de PDGFRα en al menos 10-50% de los casos, los cual
confirma el diagnostico de GIST y además los hace candidatos a tratamiento con
inhibidores de la tirosin-quinasa (8).
Varios autores han encontrado una relación entre la presencia de mutaciones en
el gen KIT y un peor pronóstico (10, 11, 12, 13 14), relación cuestionada por otros (15).
Se han analizado la influencia entre la supervivencia libre de recidiva y el tipo y
localización de las mutaciones en KIT (11, 5, 16, 13) y en dos estudios se ha
demostrado un peor pronóstico entres los pacientes que presentaban deleciones (13,
17,18). Por otro lado, si la deleción afecta a los codones 557-558 del exón 11, habría un
mayor riesgo de recidiva (5, 18); además se ha descrito que estado de homocigoto para
esta mutación se asocia de forma importante a un comportamiento más agresivo (34).
8

9. Por lo tanto, la presencia o ausencia de mutaciones aporta una valiosa
información desde el punto de vista diagnóstico y además ayuda a explicar el
comportamiento de los pacientes en cuanto a pronóstico y respuesta a los inhibidores de
la TK (9).
El Grupo Español de Investigación en Sarcomas (GEIS), publicó en 2008 el
análisis de la “mutación crítica” (la que afecta a los codones 557 y/o 558) durante un
periodo de más de 4 años. La variable mutación crítica se ha mantenido con valor
pronóstico independiente durante todo el seguimiento (19).
En relación a las mutaciones en el PDGFRα parece que tienen un pronóstico más
favorable, aunque no quiere decir que tengan un curso benigno, sobre todo la mutación
exón 18 D842V (20, 21) (ver tabla 1).
En un paciente afecto de GIST, si el tumor es resecable, el tratamiento de
elección es la cirugía, estando el tratamiento adyuvante con Imatinib cuestionado
(aunque hay algunos estudios donde se evidencia una mayor tiempo libre de recaída,
pero no mejora de la supervivencia) (32).
Estos enfermos en tratamiento con Imatinib pueden tener resistencia al fármaco,
constituyendo un problema clínico importante. En la resistencia primaria, que es la que
se produce en los primeros meses de la terapia, se evidencia una mayor frecuencia de
mutaciones en el exón 9. La resistencia secundaria puede darse con dos patrones
clínicos: a) una parte de las lesiones o parte del tumor sufre crecimiento con
estabilización del resto y b) todas las lesiones crecen por igual. El mecanismo más
frecuente es la aparición de una nueva mutación. Esta puede ser una mutación que por si
sola no conferiría resistencia pero que, al asociarse a la mutación primaria en el exón
11, produce hiperactivación del KIT y resistencia; o una mutación que confiere
resistencia por sí misma (23). Las mutaciones secundarias en los exones 13, 14, 17 o 18
se producen en el 62% de los GIST con mutación primaria del exón 11 del KIT y sólo
en el 16% con una mutación primaria del exón 9; además no aparecen mutaciones
secundarias en los GIST sin mutaciones primarias del KIT o PDGFRα (24). En los
GIST con mutaciones primarias en el exón 11, la mutación secundaria más frecuente
aparece en el exón 17 (25).
9

10. Hay evidencia en una pequeña proporción de pacientes (18.8%) de evolución
clonal y/o mutaciones secundarias policlonales. Así, en un mismo paciente, con el
tiempo, pueden desarrollarse diferentes mutaciones secundarias en diferentes implantes
tumorales, hallazgo que habría que tener en cuenta en el enfoque terapéutico de estos
pacientes. (25,26)
Como se mencionó en la introducción, la aparición en el tratamiento del
Imatinib, un inhibidor de la tirosin-quinasa, supuso una revolución en el manejo de los
pacientes con enfermedad metastásica (22). En los enfermos que han recibido
tratamiento quirúrgico, el tratamiento adyuvante con Imatinib está en estudio pues hay
trabajos, que aunque no ven aumento en la supervivencia, si hay un aumento en el
intervalo libre de recurrencia (Estudio ACOSOG-Z9001) (32). También se han
analizado en diversos estudios las probabilidades de respuesta y resistencia a Imatinib
en función de la mutación. Aunque el tratamiento de elección para los GISTs no
metastásicos es el quirúrgico, en el caso de GISTs metastásicos o enfermedad
localmente avanzada inoperable está demostrada la efectividad del tratamiento con
inhibidores de KIT o PDGFRα siendo el más utilizado Imatinib mesilato (Gleevec;
Novartis) a una dosis de 400 mg/día, actualmente durante 3 años; sin embargo como se
muestra más adelante las mutaciones del exón 9 aconsejan incrementar duplicar la dosis
encontrándose un incremento del intervalo libre de enfermedad (ver las tres siguientes
diapositivas):
10

11. OBJETIVO:
Para poder conocer la presencia de mutaciones somáticas en los genes c-KIT y
PGDFRα en los tumores GISTs, es necesario realizar una prueba genética molecular
que permita identificar los pacientes que presentan mutaciones en los exones relevantes
de dichos genes. El objetivo de este estudio es determinar las mutaciones en estos genes
de las células tumorales de los pacientes diagnosticados en el Hospital Universitario de
Canarias (HUC).
Con ello se pretende conformar un registro de este tipo de tumores en nuestro
medio constituyendo un grupo multidisciplinar con todos los servicios implicados en el
diagnóstico, tratamiento y seguimiento de estos pacientes. Además queremos destacar la
importancia de este tipo de pruebas puesto que son relevantes tanto para elegir
correctamente el tratamiento como para predecir el curso de la enfermedad, por ello
queremos reclamar que se haga de manera habitual para todos aquellos procesos
tumorales susceptibles de ser diagnosticados como GIST.
MATERIAL Y MÉTODOS:
Para la realización de este estudio se procedió en primer lugar a la obtención del
consentimiento informado del paciente para la utilización del material biológico. La
información al paciente y la solicitud del consentimiento la realizó el facultativo del
Servicio de Oncología Médica que le atiende. Una copia de dicho consentimiento fue
enviada a la historia clínica del paciente y otra copia fue remitida al Servicio de
Anatomía Patológica.
La detección del estado mutacional de estos tumores se puede llevar a cabo
sobre muestras de tejido tumoral fresco, congelado o incluido en parafina siendo válidos
tanto el tumor primario como las metástasis. Hemos recurrido al material incluido en
parafina de los pacientes diagnosticados de GIST
Selección del material: se seleccionó un bloque de tejido incluido en parafina que
contenga al menos un 70% de células tumorales.
Microdisección manual: Se realizaron tres cortes de 10 µm en portaobjetos y se
procedió al desparafinado completo de las cortes (baños de xilol y alcohol de grado
decreciente hasta agua destilada). Posteriormente y bajo visión con lupa o microscopio
el patólogo fue eliminando la fracción sana del material para enriquecimiento de la
muestra.
Extracción de ADN: Mediante la utilización del kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit
(Qiagen) se extrajo el ADN de los cortes anteriormente desparafinados; este kit es
específico para la extracción de ADN de material incluido en parafina.
11

12. Rastreo de mutaciones en el gen Kit
Amplificación por PCR (polimerase chain reaction) de los exones con mayor
número de mutaciones descritas: Exones 9, 11, 13, y 17:
- 13,5 l H2O
- 5 l Polymejor
- 2,5 l Buffer 10x
- 1 l dNTPs Mix 2.5mM
- 1 l Primer F+R 25uM
- 1 l Taq polimerasa 1U/ul
- 1 l DNA
Termociclador MJ Research PTC-100 para procesamiento de PCR
Condiciones para la reacción de PCR:
- 95ºC/3min[94ºC 45seg, 60-50ºC 30seg, 72ºC30seg] x 35ciclos
- 72ºC 10min / 15ºC (for ever) Indefinido.
Nota: la temperatura de hibridación es 60ºC para los exones 9, 11 y 17 y 50ºC para el
exón 17. Comprobar en un gel de agarosa al 2% TBE 0,5x la eficiencia de la
amplificación.
Polimorfismo Conformaciones de Cadenas Simples (SSCP).
Para el rastreo de mutaciones de estas zonas codificante se emplea la técnica de
SSCP (single stand conformational polimorphims).
Separación electroforética:
- 2l de cada producto de PCR + 4l de solución desnaturalizante.
- Desnaturalizar a 90ºC durante 5minutos. Introducir en agua helada o hielo para
evitar la renaturalización de las cadenas simples de ADN.
- Electroforesis vertical: preparar un geles de poliacrilamida (10%, Acrilamida:
Bisacrilamida 99:1) en buffer TBE 0,5X refrigerado a 4ºC. Cargar el volumen
completo desnaturalizado (6ul).
- Correr la electroforesis a 100 voltios entre 15-20 horas (dependerá del tamaño
del fragmento) en la cámara fría a 4ºC.
12

13. Preparación de la solución desnaturalizante: 700ul sol. 1 + 500ul sol. 2. Estas
soluciones se almacenan a -20ºC y la mezcla a 4ºC.
 Solución 1: 9,5 ml Formamida, 200l EDTA 0,5mM, 10mgBromofenol-
Xilencianol, 290l agua destilada MilliQ.
 Solución 2: 50l SDS 10%, 100l EDTA 0,5mM4, 58ml agua destilada
MilliQ).

Tinción de plata:
- La visualización de las bandas obtenidas tras aplicar SSCP se realiza a través de
tinción con nitrato de plata. Una vez finalizada la electroforesis:
- Levantar el gel y depositarlo en una batea limpia, aclarar con agua destilada
MilliQ. Cada paso se decanta sujetando le gel con los dedos con guantes por las
esquinas superiores, apretando contra la bates con cuidado.
- Fijar las bandas al gel con Etanol al 10% en agitación durante 10min. Decantar
evitando doblar el gel.
- Añadir HNO3 al 1%. Agitar manualmente durante 3 minutos. Decantar.
- Lavar con agua destilada MiliQ en agitación durante 3 minutos. Repetir 2 veces
y luego decantar.
- Añadir solución de Nitrato de Plata fresca (AgNO3) y agitar suavemente durante
20 minutos en oscuridad. Decantar (el Nitrato de Plata se puede reutilizar al
menos 3 veces).
- Lavar con agua destilada MilliQ 15 segundos 2 veces (AJUSTAR BIEN EL
TIEMPO). Decantar.
- Añadir 100ml de solución reveladora y agitar durante 1 minuto. Decantar
- Lavar con agua destilada MilliQ 1 minuto. Decantar.
- Añadir los 100ml restantes de solución reveladora y agitar suavemente hasta
que las bandas aparezcan y se observen con nitidez.
- Parar la reacción con 100ml de Acido Acético 10% (puede estar caliente de
microondas aunque no hay variación si esta frio).
- Lavar con agua destilada MilliQ 2 veces ates de escanear o secar.
Ejemplos de geles hechos con la técnica SSCP y teñidos con plata para diferentes
muestras de GIST.
13

14. Preparación de reactivos:
 Etanol 10%: preparar 1 litro de Etanol: 100ml Etanol Absoluto + 900ml agua
destilada MilliQ.
 Nítrico: HNO3 65%. Preparar 1 litro: 15ml HNO3, rellenar hasta 1 litro con
agua destilada MilliQ.
 Nitrato de Plata: 0.1 gramo en 100ml agua destilada MilliQ.
 Solución reveladora: 5.9 gramos de Carbonato Sódico Na2 CO3 en 200ml de
agua destilada MilliQ. LA SOLUCIÓN DEBE PERMANECER FRIA A
4ºC HASTA SU USO. Justo antes de usarse se le añade 250 l de
formaldehido.
 Acido Acético 10%: 100ml Acido Acético 100% en 900ml de agua MilliQ
destilada.
Secuenciación directa por el método de Sanger: Analizador genético ABI 3130XL
Tras el análisis del patrón electroforético SSCP de los diferentes exones de cada
uno de los pacientes se procede a la secuenciación de los que presentan patrón
aberrante, con el fin de localizar la mutación o polimorfismo causante.
Secuenciador
Purificación enzimática del producto de PCR (EXOI-SAP):
Vf de reacción =4.5l
- 2.5l H2O
- 0.25l ExoI(20U/l Fermentas)
- 1l SAP(1U/l Fermentas)
- 0.75lPCR
Condiciones para la reacción de purificación enzimática:
- 37ºC 30 min
- 80ºC 15 min (inactivación de los enzimas)
Reacción de secuenciación (ABI 3130XL):
Vf de reacción =6.5l
- 4.5l DNA purificado (viene del paso anterior)
- 0.863 l H2O
- 0.637l Primer F ó R 5M
- 0.5l kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 1.1 (Applied Biosystems)
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15. Condiciones para la reacción de secuenciación:
- 94ºC/3min[94ºC/30seg, 55ºC 5seg, 60ºC 2min]25ciclos
- 72ºC 4min/4ºC (for ever) Indefinido.
(Si la reacción de secuenciación no se va a purificar en el mismo día, congelarla a -20ºC
preservando las muestras de la luz.) =Obviar completo
Precipitación de la reacción de secuenciación con Etanol/EDTA/Acetato Sódico:
Recomendado por Applied Biosystems cuando se requiere una buena señal
desde la primera base del electroferograma. =Obviar completo
Vf reacción secuenciación =6,5
Añadir al mismo tubo:
- 0,65l EDTA 125 mM
- 0,65lAcetato sódico (AC Na) 3M
- 16,25l EtOH 100%
- Mezclar invirtiendo unas 4 veces los tubos, sellar con papel de aluminio e
incubar
- 15min RT (Room Temperature).Temperatura ambiente
- Centrifugar a 4ºC: 45min 1650xg o 30min 2000-3000xg = 12.000rpm
- Decantar el sobrenadante
- Añadir 22,75l EtOH 70%
- Centrifugar a 4ºC: 15min 1650xg = 6270 rpm
- Decantar el sobrenadante
- Secar las muestras en la estufa ,37ºC, durante 10 min (mantener las muestras
protegidas de la luz durante este tiempo).
Si las muestras van a ser procesadas en el día Resuspender el pellet en 10 l de
buffer de inyección (Formamida desionizada, Applied Biosystems,-20ºC) y transferir a
la placa multiwell de 96 pocillos. Si las muestras van a ser almacenadas, cubrir con
papel de aluminio y guardar a -20ºC.
Análisis de las secuencias mediante el software Sequencing Analysis v5.4
Comparándolas con la secuencia wild type o salvaje, las mutaciones encontradas
pueden ser contrastadas con la base de datos del Instituto Sanger siguiendo el link:
http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=bygene&ln=KIT&start=1&
end=977&coords=AA:AA
Las muestras en las que no hayamos encontrado ninguna mutación en el gen Kit les
hacemos el mismo proceso de rastreo de mutaciones para el gen PDGFRα.
15

16. Ejemplo de una imagen del electroferograma donde se observa la mutación puntual,
V559D, en el exón 11 de c-Kit
Rastreo de mutaciones en el gen PDGFRα
Amplificación por PCR (polimerase chain reaction) de los exones con mayor
numero de mutaciones descritas: Exones 12, 14 y 18:
- 13,5 l H2O
- 5 l Polymejor
- 2,5 l Buffer 10x
- 1 l dNTPs Mix 2.5mM
- 1 l Primer F+R 25uM
- 1 l Tal polimerasa 1U/ul
- 1 l DNA
Condiciones para la reacción de PCR:
- 95ºC/3min[94ºC 45seg, 55ºC 30seg, 72ºC30seg] x 35ciclos
- 72ºC 10min / 15ºC for ever.
Nota: la temperatura de hibridación 55ºC es para los 3 exones, 12,14 y 18.
Comprobar en un gel de agarosa al 2% TBE 0,5x la eficiencia de la amplificación.
Seguir el resto de protocolo tal y como se ha indicado para el gen Kit, esto es, SSCP,
secuenciación de las muestras con patrón aberrante y análisis de la secuencia de las
mismas.
Las mutaciones encontradas pueden ser contrastadas con la base de datos del Instituto
Sanger siguiendo el link:
http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=bygene&ln=PDGFRA&start
=1&end=1090&coords=AA:AA
Emisión de informe: el diagnóstico definitivo se emite en informe preformateado como
prueba de Patología Molecular de nuestro servicio.
Almacenamiento del material excedente: el ADN obtenido y excedente pasa a formar
parte del Biobanco del hospital.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES:
16

17. Fueron analizadas 34 muestras provenientes del HUC, de ellas, 25 (73,5%)
presentaron alguna mutación en c-KIT y 4 (11,8%) mutaciones en PDGFRα, en las 5
restantes (14,7%) el resultado obtenido fue inconcluyente, ya sea por mala calidad en el
DNA o porque no existe mutación en los exones secuenciados. Dentro del grupo que
presentó mutaciones en c-KIT el exón que con más frecuencia se ve afectado es el exón
11, siendo en el 94% de los casos. En este exón se encontraron principalmente 3
mutaciones: inserción-deleción en la posición 557 (31,8%), inserción-deleción en la
posición 552-3 (22,7%) y un cambio simple de aminoácido de Valina por Ácido
aspártico, V559D (22,7%). En cuanto a las 4 muestras con mutaciones en PDGFRα, se
hallaron dos mutaciones. Una de ellas en el exón 12 (25%), siendo una inserción-
deleción en la posición 566, y la otra en el exón 18 (75%), viendo un cambio Ácido
aspártico por Valina (D842V).
Comparando los datos obtenidos con los registrados en la bibliografía, el
porcentaje de casos que presentan la mutación más frecuente que en este caso es en c-
17

18. KIT es ligeramente inferior. Si determinamos el porcentaje total de casos que presentan
alguna mutación en el exón 11 de este gen, el porcentaje es muy similar al extraído en
los artículos revisados. Por otro lado, los resultados obtenidos en nuestro estudio
muestran una mayor frecuencia de casos diagnosticados de GIST con mutaciones en el
gen PDGFRα.
En el seguimiento del tratamiento y la evolución de los pacientes, de los 34
casos, se han perdido 5, 19 recibieron tratamiento quirúrgico y 11 pacientes fueron
tratados con Imatinib. De los pacientes tratados, en 8 casos no hay progresión de la
enfermedad, un paciente falleció y en 2 casos la enfermedad ha seguido progresando.
Respecto a los pacientes no tratados, 4 fallecieron por progresión de la enfermedad y
otro por otras causas. El resto (15 pacientes) no manifiesta recaídas.
Representación gráfica de los resultados:
18

19. Durante la realización de los análisis en la Unidad de Investigación de la ULL-
HUC hemos aprendido la mecánica de trabajo en laboratorio de diagnóstico molecular,
así como la determinación de mutaciones somáticas en las células tumorales. Este tipo
de pruebas conducen a un diagnóstico y un tratamiento más personalizado gracias a las
grandes posibilidades que nos ofrece la terapia diana-dirigida, por tanto suponen el
inicio de una sanidad que será más efectiva.
19

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