Mutaciones genéticas en tumores GIST     Irene González García, Juan Francisco González Vera y Jorge Gorrín Ramos         ...
Genetic mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors     Irene González García, Juan Francisco González Vera y Jorge Gorrí...
INTRODUCCIÓN:       Los tumores del estroma gastrointestinal (GIST), son tumores mesenquimalesque se originan en el tracto...
Diagnóstico anatomopatológico       Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico de los GISTs esmorfológico e...
Dos de los parámetros que se han utilizado para predecir al riesgo de estostumores son el número de mitosis y el tamaño de...
Gleevec® (Imatinib) es un inhibidor de receptores de membrana con actividadtirosin-quinasa (TK), como c-Kit y PDGFRA, rele...
Fig. 1.   Mutación más frecuente es la del exón 11, con tres tipos de alteraciones (4, 5, 6):    1. Deleciones que suelen...
Mutaciones en PDGFRα (Fig. 2)        En un 7-10% de los GIST podemos encontrar mutaciones en otro receptor TK, elPDGFRα (4...
Por lo tanto, la presencia o ausencia de mutaciones aporta una valiosainformación desde el punto de vista diagnóstico y ad...
Hay evidencia en una pequeña proporción de pacientes (18.8%) de evoluciónclonal y/o mutaciones secundarias policlonales. A...
OBJETIVO:        Para poder conocer la presencia de mutaciones somáticas en los genes c-KIT yPGDFRα en los tumores GISTs, ...
Rastreo de mutaciones en el gen Kit   Amplificación por PCR (polimerase chain reaction) de los exones con mayornúmero de m...
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Preparación de reactivos:       Etanol 10%: preparar 1 litro de Etanol: 100ml Etanol Absoluto + 900ml agua          desti...
Condiciones para la reacción de secuenciación:      - 94ºC/3min[94ºC/30seg, 55ºC 5seg, 60ºC 2min]25ciclos      - 72ºC 4min...
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Fueron analizadas 34 muestras provenientes del HUC, de ellas, 25 (73,5%)presentaron alguna mutación en c-KIT y 4 (11,8%) m...
KIT es ligeramente inferior. Si determinamos el porcentaje total de casos que presentanalguna mutación en el exón 11 de es...
Durante la realización de los análisis en la Unidad de Investigación de la ULL-HUC hemos aprendido la mecánica de trabajo ...
BIBLIOGRAFÍA:   1. Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y, et al Gain of funtion mutations of c-kit in       human gastrointestin...
resected gastrointestinal stromal tumors. A study of the Spanish group for    sarcoma research (GEIS). Clin Oncol 2005; 23...
34. Lasota J, Corless CL, Heinrich MC, Debiec-Rychter M, Sciot R, Wardelmann    E, et al. Clinicopathologic profile of gas...
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Mutaciones genticas en tumores GIST

  1. 1. Mutaciones genéticas en tumores GIST Irene González García, Juan Francisco González Vera y Jorge Gorrín Ramos Tutor: Dr. Eduardo Salido Ruiz. Co-tutoras: Dra. Nieves Hernández León; Dra. Débora Riverol Martín.Introducción. Los tumores tipo GIST o tumores del estroma gastrointestinal seclasifican como sarcomas de tejido blando y son la neoplasia mesenquimal másfrecuente del tracto gastrointestinal. Fundamentalmente expresan mutaciones en losgenes c-KIT y PDGFRα, con pronósticos y tratamientos diferentes. El correctodiagnóstico patológico mediante pruebas inmunohistoquímicas así como el diagnósticomolecular constituyen procedimientos fundamentales para establecer las terapiasadecuadas.Objetivos. Aprender durante la realización del estudio sobre el diagnóstico de lostumores tipo GIST y profundizar en la mecánica de trabajo de un laboratorio así comoen el proceso de secuenciación genética. Nuestro estudio pretendía determinar asimismola frecuencia en la que se manifiestan las diferentes mutaciones.Material y Método. Contando con la colaboración de la unidad de Anatomía Patológicadel HUC, que nos proporcionó las muestras, procedimos a la extracción del DNA de lascélulas cancerosas. Posteriormente amplificamos el material mediante PCR ysecuenciamos los genes c-KIT y PDGFRα.Resultados. Durante el periodo de seguimiento fueron analizadas 34 muestrasprocedentes del HUC. El 11,8% de ellas presentaban mutaciones en el gen PDGFRα,mientras que el 73,5% las mostraba en el gen c-KIT. En el resto (14,7%) no fue posibledeterminar mutaciones.Conclusiones. Tras la realización de los análisis, nos hemos familiarizado con lamecánica de trabajo en un laboratorio de diagnóstico molecular y con la determinaciónde mutaciones somáticas en las células tumorales. Este tipo de pruebas, que conducen aun diagnóstico y un tratamiento más personalizados, suponen el inicio de una sanidadque será más efectiva.Palabras clave: tumores del estroma gastrointestinal, GIST, c-KIT, PDGFRα, Imatinib,anatomía patológica, diagnóstico molecular, secuenciación genética, opcionesterapéuticas. 1
  2. 2. Genetic mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors Irene González García, Juan Francisco González Vera y Jorge Gorrín Ramos (3th year students of Medicine). Supervised by: Eduardo Salido Ruiz, MD, PhD; Nieves Hernández León, MD; Débora Riverol Martín, MD.ABSTRACTBackground. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs), regarded as soft tissue sarcomas,are the most frequent mesenchymal neoplasms of the gastrointestinal tract. GISTsusually show certain mutations in the c-KIT and the PDGFRα genes, being bothassociated to different prognostic and therapeutic choices. Their molecular typing aswell as a more accurate pathological diagnosis by immunohistochemical testing seemessential to find suitable treatments.Objectives. This study aimed at refining our knowledge about GIST diagnosis andcertain typical lab genetic sequencing processes. Our purpose was also to determine theincidence of certain mutations.Materials and Methods. The Pathology Research Unit at our university hospital(Hospital Universitario de Canarias, HUC) provided us with the study samples. AfterDNA extraction from the cancer cells, we amplified the materials by polymerase chainreaction (PCR) and then sequenced the c-KIT and PDGFRα genes.Results. During the follow-up period 34 samples were analyzed. As much as 73.5% ofthem showed some kind of mutation in the c-KIT gene whereas only 11.8% presentedsome mutation in the PDGFRα gene. However, no cases could be determined in theremaining 14.7% of the samples.Conclusions. The present analysis allowed us to learn about somatic mutationdeterminations in tumor cells and other routine laboratory procedures in moleculardiagnosis. The evidence thus obtained may lead us to find more precise diagnoses andmore individualized treatment options that may show the way to a more effective healthcare service.Key words: gastrointestinal stromal tumors, GIST, c-KIT, PDGFRα, Imatinib,pathology, molecular diagnosis, genetic sequencing, treatment options. 2
  3. 3. INTRODUCCIÓN: Los tumores del estroma gastrointestinal (GIST), son tumores mesenquimalesque se originan en el tracto gastrointestinal, el epiplón, el mesenterio o el retroperitoneoy suponen el 2% de todos los tumores gastrointestinales. La localización más frecuentees el estómago (50%), seguido por el intestino delgado (20-30%), el intestino grueso(10%), el esófago (5%); la frecuencia en el epiplón, mesenterio o retroperitoneo esmenor del 5% (27, 29). Aunque suele afectar a adultos, y en un 75% en pacientes demás de 50 años, en raras ocasiones hay casos pediátricos que representan 1-2% de todoslos tumores GIST (31). El GIST se origina de las células intersticiales de Cajal, un entramado celularpropio del tubo digestivo que permite el peristaltismo, coordinando las contraccionesmusculares para que se produzcan en el momento preciso y con la intensidad ydirección adecuadas. Visión macroscópica de un GIST gástrico Desde la publicación en el año 2001 por Joensuu (22), de un paciente con buenarespuesta al tratamiento con Imatinib, ha existido un cambio radical en el tratamiento deestos pacientes en la enfermedad avanzada, con tasas de respuesta en torno al 50-60%.Así mismo, aunque el tratamiento de elección es el quirúrgico en la enfermedadlocalizada, existen controversias en ciertos pacientes con tumores localmenteavanzados, donde el tratamiento quirúrgico puede producir una alta frecuencia decomplicaciones o alteraciones funcionales. En estos casos, la toma de decisiones debeser realizada en un contexto multidisciplinario (cirujano, patólogo, radiólogo, oncólogoclínico, gastroenterólogo, medicina nuclear). (28). Junto con el correcto diagnóstico anatomopatológico y el diagnóstico diferencialcon otras entidades, en ocasiones de difícil resolución, otro aspecto muy importante, esel análisis de mutaciones en estos tumores, donde según los últimos estudios en curso,pueden tener implicaciones terapéuticas directas en la elección de la dosis inicial deltratamiento. En el último consenso multidisciplinario de la ESMO, así como en otrasguías (28) se recomienda la incorporación del estudio molecular sistemático a todos lostumores. 3
  4. 4. Diagnóstico anatomopatológico Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico de los GISTs esmorfológico e inmunohistoquímico (29). El análisis histopatológico revela dos patrones:fusocelular y epitelioide o mixto. A BA. Corte histológico con Hematoxilina-eosina donde se observa un GIST de patrónfusocelular, con moderada atipia nuclear. B. Corte histológico con Hematoxilina-eosina donde se observa la proliferación tumoral mesenquimal infiltrando la láminapropia de la mucosa gástrica. Con técnicas inmunohistoquímicas se demostró que setrataba de un GIST. El perfil inmunohistoquímico es crucial en el diagnóstico: CD-117 esgeneralmente positivo, aunque existe un 5% de los GISTs CD-117 negativos; CD34 espositivo en 60-70% de los casos y tan sólo el 5% lo es para S100; de los marcadoresmusculares del 30-40% son positivos para actina específica de músculo, 1-2% paradesmina (ambos de distribución focal e intensidad leve) y un 85% positivos para h-caldesmón lo que suele ser útil en los pocos casos que son CD117 negativos. Por últimose han descrito otros marcadores como DOG1 (36) que es positivo en el 85% de losGIST y de éstos sólo el 74% eran positivos para CD117; además el 79% de los GISTque tienen mutaciones en PDGFRα, fueron positivos para DOG1 y sólo el 9%expresaban CD117. Otro marcador en estudio es la protein kinasa (37) que parece tenerutilidad en los casos CD117 negativos. En estos casos es de gran importancia, ante lasospecha diagnóstica de un GIST, que se realice el análisis mutacional para confirmar eldiagnóstico.Imágenes inmunohistoquímicas de CD-117 y CD-34 donde se demuestra positividadintensa y difusa en las células tumorales para ambas. 4
  5. 5. Dos de los parámetros que se han utilizado para predecir al riesgo de estostumores son el número de mitosis y el tamaño del tumor y con ello se elaboró unesquema para el manejo de estos tumores por la NIH (38 y 39). Posteriormente seañadió según el Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas Americanas (AFIP) lalocalización como un parámetro importante a tener en cuenta para la valoración deriesgo. Como indica la siguiente tabla:Diagnóstico molecular En 1998 Hirota (1) publica un artículo en la revista Science donde demuestraque la mayoría de los tumores GIST presentan mutaciones activadoras en elprotooncogen KIT. El evento molecular que determina el desarrollo del GIST es laactivación de este receptor tirosin-quinasa KIT (c-KIT) o en menor proporción delreceptor tirosin-quinasa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα).Dichas activaciones producen señales de transducción que llegan finalmente al núcleo,donde activan la transcripción génica y contribuyen a la proliferación celularincontrolada y resistencia a la apoptosis (1, 3, 35). La mutación de uno u otro tieneimplicaciones en el comportamiento clínico de estos tumores. Actualmente existenfármacos diseñados para inhibir estos receptores (terapias diana dirigidas contra elreceptor) e inhibir por tanto el crecimiento de estas neoplasias. 5
  6. 6. Gleevec® (Imatinib) es un inhibidor de receptores de membrana con actividadtirosin-quinasa (TK), como c-Kit y PDGFRA, relevantes en GISTs. También inhibeotras moléculas con actividad tirosin-quinasa, como la molécula quimérica bcr-abl, de laleucemia mieloide crónica, donde el Imatinib cosechó su primer éxito terapéutico.Ejerce su acción mediante la unión competitiva al sitio activo tirosin-quinasabloqueando de este modo la cascada de señalización intracelular relacionada con lasupervivencia celular, proliferación celular y generación de metástasis. Imatinib (rojo) unido a la estructura 3D de la quinasa bcr-abl (verde).Esquema de la función del receptor TK (A) y de su interacción con el Imatinib (B).Espectro de mutaciones en GISTMutaciones en c-KIT (Fig. 1) En 1988 se demostró, que no solo los tumores GIST expresan KIT, sino que además 5 de cada 6 tumores analizados genéticamente eran portadores de mutaciones en la región del KIT que codifica para el dominio yuxtamembrana del receptor (exón 11) y que activa de forma constitutiva la actividad TK de KIT en ausencia de ligando (1). Actualmente, dependiendo de las series analizadas, la incidencia de mutaciones es del 60-92% (2, 30, 40). Las mutaciones se localizan fundamentalmente en los exones 9, 11, 13 y 17 (Fig 1) y en algunos estudios la técnica de HRM (high resolution melting) se ha usado como rastreo de las mutaciones (33). 6
  7. 7. Fig. 1. Mutación más frecuente es la del exón 11, con tres tipos de alteraciones (4, 5, 6): 1. Deleciones que suelen afectar a la región 5´ del exón (entre los codones 550 y 560) especialmente a los codones Trp557- Lys558 que se relacionaron con un peor pronóstico. 2. Mutaciones puntuales, que por lo general se limitan a cuatro codones (557, 559, 560 y 576). 3. Duplicaciones en el extremo 3´ de un determinado número de codones. Mutación en el exón 9 (dominio extracelular) se produce con una frecuencia del 9- 20%. De forma mayoritaria se encuentra un tipo de mutación correspondiente a la inserción de seis nucleótidos que resultan en la duplicación de los aminoácidos Ala501 y Tyr502, y se encuentran en los pacientes que carecen de la mutación en el exón 11 (7). Esta mutación se asocia a tumores de localización más frecuente a nivel intestinal y mayor potencial maligno. Por ello estos tumores que presentan la mutación en el exón 9 de KIT parecen tener mejor supervivencia libre de progresión con dosis más altas, siendo hoy en día un estándar en el tratamiento la dosis de 800 mg /día. Además el análisis mutacional permite excluir aquellos casos no sensibles a la terapia con Imatinib. Mutaciones del exón 13 y exón 17 son extremadamente raras. En un estudio de 54 (34) casos se concluyó que la mayoría tenían un patrón fusocelular, que los de localización gástrica con mutación en el exón 13 tenían un comportamiento más agresivo que otros con otro tipo de mutaciones y que aquellos localizados en el intestino delgado no había diferencias entre ellos. 7
  8. 8. Mutaciones en PDGFRα (Fig. 2) En un 7-10% de los GIST podemos encontrar mutaciones en otro receptor TK, elPDGFRα (40). Una característica importante en la patología molecular de estos tumoreses que las mutaciones en el KIT y en el PDGFRα son mutuamente excluyentes. Fig. 2 Como en el caso del KIT las mutaciones se localizan fundamentalmente en losexones 12, 14 y 18, equivalentes a los exones 11, 13 y 17 del KIT. Casi todos los casoscon este tipo de mutaciones son de localización gástrica, de patrón epiteliode y parecenser clínicamente menos agresivos con menor potencial de metástasis (30, 39). Muchosde esto tumores expresan de forma focal o son completamente negativos para CD117.Tumores sin mutaciones Existe un subgrupo de tumores (aproximadamente un 5% de los casos) que notienen ninguna de las mutaciones de c-KIT ni de PDGRFα aunque pueden ser positivospara CD117. Por contra existe un grupo que expresa muy débilmente o no expresanCD117 aunque cumplen los demás criterios, como la presentación clínica, lalocalización anatómica, la morfología para diagnosticarlos como GIST y puedenpresentan mutaciones del KIT o de PDGFRα en al menos 10-50% de los casos, los cualconfirma el diagnostico de GIST y además los hace candidatos a tratamiento coninhibidores de la tirosin-quinasa (8). Varios autores han encontrado una relación entre la presencia de mutaciones enel gen KIT y un peor pronóstico (10, 11, 12, 13 14), relación cuestionada por otros (15).Se han analizado la influencia entre la supervivencia libre de recidiva y el tipo ylocalización de las mutaciones en KIT (11, 5, 16, 13) y en dos estudios se hademostrado un peor pronóstico entres los pacientes que presentaban deleciones (13,17,18). Por otro lado, si la deleción afecta a los codones 557-558 del exón 11, habría unmayor riesgo de recidiva (5, 18); además se ha descrito que estado de homocigoto paraesta mutación se asocia de forma importante a un comportamiento más agresivo (34). 8
  9. 9. Por lo tanto, la presencia o ausencia de mutaciones aporta una valiosainformación desde el punto de vista diagnóstico y además ayuda a explicar elcomportamiento de los pacientes en cuanto a pronóstico y respuesta a los inhibidores dela TK (9). El Grupo Español de Investigación en Sarcomas (GEIS), publicó en 2008 elanálisis de la “mutación crítica” (la que afecta a los codones 557 y/o 558) durante unperiodo de más de 4 años. La variable mutación crítica se ha mantenido con valorpronóstico independiente durante todo el seguimiento (19).En relación a las mutaciones en el PDGFRα parece que tienen un pronóstico másfavorable, aunque no quiere decir que tengan un curso benigno, sobre todo la mutaciónexón 18 D842V (20, 21) (ver tabla 1). En un paciente afecto de GIST, si el tumor es resecable, el tratamiento deelección es la cirugía, estando el tratamiento adyuvante con Imatinib cuestionado(aunque hay algunos estudios donde se evidencia una mayor tiempo libre de recaída,pero no mejora de la supervivencia) (32). Estos enfermos en tratamiento con Imatinib pueden tener resistencia al fármaco,constituyendo un problema clínico importante. En la resistencia primaria, que es la quese produce en los primeros meses de la terapia, se evidencia una mayor frecuencia demutaciones en el exón 9. La resistencia secundaria puede darse con dos patronesclínicos: a) una parte de las lesiones o parte del tumor sufre crecimiento conestabilización del resto y b) todas las lesiones crecen por igual. El mecanismo másfrecuente es la aparición de una nueva mutación. Esta puede ser una mutación que por sisola no conferiría resistencia pero que, al asociarse a la mutación primaria en el exón11, produce hiperactivación del KIT y resistencia; o una mutación que confiereresistencia por sí misma (23). Las mutaciones secundarias en los exones 13, 14, 17 o 18se producen en el 62% de los GIST con mutación primaria del exón 11 del KIT y sóloen el 16% con una mutación primaria del exón 9; además no aparecen mutacionessecundarias en los GIST sin mutaciones primarias del KIT o PDGFRα (24). En losGIST con mutaciones primarias en el exón 11, la mutación secundaria más frecuenteaparece en el exón 17 (25). 9
  10. 10. Hay evidencia en una pequeña proporción de pacientes (18.8%) de evoluciónclonal y/o mutaciones secundarias policlonales. Así, en un mismo paciente, con eltiempo, pueden desarrollarse diferentes mutaciones secundarias en diferentes implantestumorales, hallazgo que habría que tener en cuenta en el enfoque terapéutico de estospacientes. (25,26) Como se mencionó en la introducción, la aparición en el tratamiento delImatinib, un inhibidor de la tirosin-quinasa, supuso una revolución en el manejo de lospacientes con enfermedad metastásica (22). En los enfermos que han recibidotratamiento quirúrgico, el tratamiento adyuvante con Imatinib está en estudio pues haytrabajos, que aunque no ven aumento en la supervivencia, si hay un aumento en elintervalo libre de recurrencia (Estudio ACOSOG-Z9001) (32). También se hananalizado en diversos estudios las probabilidades de respuesta y resistencia a Imatiniben función de la mutación. Aunque el tratamiento de elección para los GISTs nometastásicos es el quirúrgico, en el caso de GISTs metastásicos o enfermedadlocalmente avanzada inoperable está demostrada la efectividad del tratamiento coninhibidores de KIT o PDGFRα siendo el más utilizado Imatinib mesilato (Gleevec;Novartis) a una dosis de 400 mg/día, actualmente durante 3 años; sin embargo como semuestra más adelante las mutaciones del exón 9 aconsejan incrementar duplicar la dosisencontrándose un incremento del intervalo libre de enfermedad (ver las tres siguientesdiapositivas): 10
  11. 11. OBJETIVO: Para poder conocer la presencia de mutaciones somáticas en los genes c-KIT yPGDFRα en los tumores GISTs, es necesario realizar una prueba genética molecularque permita identificar los pacientes que presentan mutaciones en los exones relevantesde dichos genes. El objetivo de este estudio es determinar las mutaciones en estos genesde las células tumorales de los pacientes diagnosticados en el Hospital Universitario deCanarias (HUC). Con ello se pretende conformar un registro de este tipo de tumores en nuestromedio constituyendo un grupo multidisciplinar con todos los servicios implicados en eldiagnóstico, tratamiento y seguimiento de estos pacientes. Además queremos destacar laimportancia de este tipo de pruebas puesto que son relevantes tanto para elegircorrectamente el tratamiento como para predecir el curso de la enfermedad, por elloqueremos reclamar que se haga de manera habitual para todos aquellos procesostumorales susceptibles de ser diagnosticados como GIST.MATERIAL Y MÉTODOS: Para la realización de este estudio se procedió en primer lugar a la obtención delconsentimiento informado del paciente para la utilización del material biológico. Lainformación al paciente y la solicitud del consentimiento la realizó el facultativo delServicio de Oncología Médica que le atiende. Una copia de dicho consentimiento fueenviada a la historia clínica del paciente y otra copia fue remitida al Servicio deAnatomía Patológica. La detección del estado mutacional de estos tumores se puede llevar a cabosobre muestras de tejido tumoral fresco, congelado o incluido en parafina siendo válidostanto el tumor primario como las metástasis. Hemos recurrido al material incluido enparafina de los pacientes diagnosticados de GISTSelección del material: se seleccionó un bloque de tejido incluido en parafina quecontenga al menos un 70% de células tumorales.Microdisección manual: Se realizaron tres cortes de 10 µm en portaobjetos y seprocedió al desparafinado completo de las cortes (baños de xilol y alcohol de gradodecreciente hasta agua destilada). Posteriormente y bajo visión con lupa o microscopioel patólogo fue eliminando la fracción sana del material para enriquecimiento de lamuestra.Extracción de ADN: Mediante la utilización del kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen) se extrajo el ADN de los cortes anteriormente desparafinados; este kit esespecífico para la extracción de ADN de material incluido en parafina. 11
  12. 12. Rastreo de mutaciones en el gen Kit Amplificación por PCR (polimerase chain reaction) de los exones con mayornúmero de mutaciones descritas: Exones 9, 11, 13, y 17: - 13,5 l H2O - 5 l Polymejor - 2,5 l Buffer 10x - 1 l dNTPs Mix 2.5mM - 1 l Primer F+R 25uM - 1 l Taq polimerasa 1U/ul - 1 l DNA Termociclador MJ Research PTC-100 para procesamiento de PCRCondiciones para la reacción de PCR: - 95ºC/3min[94ºC 45seg, 60-50ºC 30seg, 72ºC30seg] x 35ciclos - 72ºC 10min / 15ºC (for ever) Indefinido.Nota: la temperatura de hibridación es 60ºC para los exones 9, 11 y 17 y 50ºC para elexón 17. Comprobar en un gel de agarosa al 2% TBE 0,5x la eficiencia de laamplificación.Polimorfismo Conformaciones de Cadenas Simples (SSCP). Para el rastreo de mutaciones de estas zonas codificante se emplea la técnica deSSCP (single stand conformational polimorphims).Separación electroforética: - 2l de cada producto de PCR + 4l de solución desnaturalizante. - Desnaturalizar a 90ºC durante 5minutos. Introducir en agua helada o hielo para evitar la renaturalización de las cadenas simples de ADN. - Electroforesis vertical: preparar un geles de poliacrilamida (10%, Acrilamida: Bisacrilamida 99:1) en buffer TBE 0,5X refrigerado a 4ºC. Cargar el volumen completo desnaturalizado (6ul). - Correr la electroforesis a 100 voltios entre 15-20 horas (dependerá del tamaño del fragmento) en la cámara fría a 4ºC. 12
  13. 13. Preparación de la solución desnaturalizante: 700ul sol. 1 + 500ul sol. 2. Estas soluciones se almacenan a -20ºC y la mezcla a 4ºC.  Solución 1: 9,5 ml Formamida, 200l EDTA 0,5mM, 10mgBromofenol- Xilencianol, 290l agua destilada MilliQ.  Solución 2: 50l SDS 10%, 100l EDTA 0,5mM4, 58ml agua destilada MilliQ). Tinción de plata: - La visualización de las bandas obtenidas tras aplicar SSCP se realiza a través de tinción con nitrato de plata. Una vez finalizada la electroforesis: - Levantar el gel y depositarlo en una batea limpia, aclarar con agua destilada MilliQ. Cada paso se decanta sujetando le gel con los dedos con guantes por las esquinas superiores, apretando contra la bates con cuidado. - Fijar las bandas al gel con Etanol al 10% en agitación durante 10min. Decantar evitando doblar el gel. - Añadir HNO3 al 1%. Agitar manualmente durante 3 minutos. Decantar. - Lavar con agua destilada MiliQ en agitación durante 3 minutos. Repetir 2 veces y luego decantar. - Añadir solución de Nitrato de Plata fresca (AgNO3) y agitar suavemente durante 20 minutos en oscuridad. Decantar (el Nitrato de Plata se puede reutilizar al menos 3 veces). - Lavar con agua destilada MilliQ 15 segundos 2 veces (AJUSTAR BIEN EL TIEMPO). Decantar. - Añadir 100ml de solución reveladora y agitar durante 1 minuto. Decantar - Lavar con agua destilada MilliQ 1 minuto. Decantar. - Añadir los 100ml restantes de solución reveladora y agitar suavemente hasta que las bandas aparezcan y se observen con nitidez. - Parar la reacción con 100ml de Acido Acético 10% (puede estar caliente de microondas aunque no hay variación si esta frio). - Lavar con agua destilada MilliQ 2 veces ates de escanear o secar. Ejemplos de geles hechos con la técnica SSCP y teñidos con plata para diferentes muestras de GIST. 13
  14. 14. Preparación de reactivos:  Etanol 10%: preparar 1 litro de Etanol: 100ml Etanol Absoluto + 900ml agua destilada MilliQ.  Nítrico: HNO3 65%. Preparar 1 litro: 15ml HNO3, rellenar hasta 1 litro con agua destilada MilliQ.  Nitrato de Plata: 0.1 gramo en 100ml agua destilada MilliQ.  Solución reveladora: 5.9 gramos de Carbonato Sódico Na2 CO3 en 200ml de agua destilada MilliQ. LA SOLUCIÓN DEBE PERMANECER FRIA A 4ºC HASTA SU USO. Justo antes de usarse se le añade 250 l de formaldehido.  Acido Acético 10%: 100ml Acido Acético 100% en 900ml de agua MilliQ destilada.Secuenciación directa por el método de Sanger: Analizador genético ABI 3130XL Tras el análisis del patrón electroforético SSCP de los diferentes exones de cadauno de los pacientes se procede a la secuenciación de los que presentan patrónaberrante, con el fin de localizar la mutación o polimorfismo causante. SecuenciadorPurificación enzimática del producto de PCR (EXOI-SAP):Vf de reacción =4.5l - 2.5l H2O - 0.25l ExoI(20U/l Fermentas) - 1l SAP(1U/l Fermentas) - 0.75lPCRCondiciones para la reacción de purificación enzimática: - 37ºC 30 min - 80ºC 15 min (inactivación de los enzimas)Reacción de secuenciación (ABI 3130XL): Vf de reacción =6.5l - 4.5l DNA purificado (viene del paso anterior) - 0.863 l H2O - 0.637l Primer F ó R 5M - 0.5l kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 1.1 (Applied Biosystems) 14
  15. 15. Condiciones para la reacción de secuenciación: - 94ºC/3min[94ºC/30seg, 55ºC 5seg, 60ºC 2min]25ciclos - 72ºC 4min/4ºC (for ever) Indefinido.(Si la reacción de secuenciación no se va a purificar en el mismo día, congelarla a -20ºCpreservando las muestras de la luz.) =Obviar completoPrecipitación de la reacción de secuenciación con Etanol/EDTA/Acetato Sódico: Recomendado por Applied Biosystems cuando se requiere una buena señaldesde la primera base del electroferograma. =Obviar completoVf reacción secuenciación =6,5Añadir al mismo tubo: - 0,65l EDTA 125 mM - 0,65lAcetato sódico (AC Na) 3M - 16,25l EtOH 100% - Mezclar invirtiendo unas 4 veces los tubos, sellar con papel de aluminio e incubar - 15min RT (Room Temperature).Temperatura ambiente - Centrifugar a 4ºC: 45min 1650xg o 30min 2000-3000xg = 12.000rpm - Decantar el sobrenadante - Añadir 22,75l EtOH 70% - Centrifugar a 4ºC: 15min 1650xg = 6270 rpm - Decantar el sobrenadante - Secar las muestras en la estufa ,37ºC, durante 10 min (mantener las muestras protegidas de la luz durante este tiempo). Si las muestras van a ser procesadas en el día Resuspender el pellet en 10 l debuffer de inyección (Formamida desionizada, Applied Biosystems,-20ºC) y transferir ala placa multiwell de 96 pocillos. Si las muestras van a ser almacenadas, cubrir conpapel de aluminio y guardar a -20ºC.Análisis de las secuencias mediante el software Sequencing Analysis v5.4Comparándolas con la secuencia wild type o salvaje, las mutaciones encontradaspueden ser contrastadas con la base de datos del Instituto Sanger siguiendo el link:http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=bygene&ln=KIT&start=1&end=977&coords=AA:AALas muestras en las que no hayamos encontrado ninguna mutación en el gen Kit leshacemos el mismo proceso de rastreo de mutaciones para el gen PDGFRα. 15
  16. 16. Ejemplo de una imagen del electroferograma donde se observa la mutación puntual,V559D, en el exón 11 de c-KitRastreo de mutaciones en el gen PDGFRα Amplificación por PCR (polimerase chain reaction) de los exones con mayornumero de mutaciones descritas: Exones 12, 14 y 18: - 13,5 l H2O - 5 l Polymejor - 2,5 l Buffer 10x - 1 l dNTPs Mix 2.5mM - 1 l Primer F+R 25uM - 1 l Tal polimerasa 1U/ul - 1 l DNACondiciones para la reacción de PCR: - 95ºC/3min[94ºC 45seg, 55ºC 30seg, 72ºC30seg] x 35ciclos - 72ºC 10min / 15ºC for ever.Nota: la temperatura de hibridación 55ºC es para los 3 exones, 12,14 y 18.Comprobar en un gel de agarosa al 2% TBE 0,5x la eficiencia de la amplificación.Seguir el resto de protocolo tal y como se ha indicado para el gen Kit, esto es, SSCP,secuenciación de las muestras con patrón aberrante y análisis de la secuencia de lasmismas.Las mutaciones encontradas pueden ser contrastadas con la base de datos del InstitutoSanger siguiendo el link:http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=bygene&ln=PDGFRA&start=1&end=1090&coords=AA:AAEmisión de informe: el diagnóstico definitivo se emite en informe preformateado comoprueba de Patología Molecular de nuestro servicio.Almacenamiento del material excedente: el ADN obtenido y excedente pasa a formarparte del Biobanco del hospital.RESULTADOS Y CONCLUSIONES: 16
  17. 17. Fueron analizadas 34 muestras provenientes del HUC, de ellas, 25 (73,5%)presentaron alguna mutación en c-KIT y 4 (11,8%) mutaciones en PDGFRα, en las 5restantes (14,7%) el resultado obtenido fue inconcluyente, ya sea por mala calidad en elDNA o porque no existe mutación en los exones secuenciados. Dentro del grupo quepresentó mutaciones en c-KIT el exón que con más frecuencia se ve afectado es el exón11, siendo en el 94% de los casos. En este exón se encontraron principalmente 3mutaciones: inserción-deleción en la posición 557 (31,8%), inserción-deleción en laposición 552-3 (22,7%) y un cambio simple de aminoácido de Valina por Ácidoaspártico, V559D (22,7%). En cuanto a las 4 muestras con mutaciones en PDGFRα, sehallaron dos mutaciones. Una de ellas en el exón 12 (25%), siendo una inserción-deleción en la posición 566, y la otra en el exón 18 (75%), viendo un cambio Ácidoaspártico por Valina (D842V). Comparando los datos obtenidos con los registrados en la bibliografía, elporcentaje de casos que presentan la mutación más frecuente que en este caso es en c- 17
  18. 18. KIT es ligeramente inferior. Si determinamos el porcentaje total de casos que presentanalguna mutación en el exón 11 de este gen, el porcentaje es muy similar al extraído enlos artículos revisados. Por otro lado, los resultados obtenidos en nuestro estudiomuestran una mayor frecuencia de casos diagnosticados de GIST con mutaciones en elgen PDGFRα. En el seguimiento del tratamiento y la evolución de los pacientes, de los 34casos, se han perdido 5, 19 recibieron tratamiento quirúrgico y 11 pacientes fuerontratados con Imatinib. De los pacientes tratados, en 8 casos no hay progresión de laenfermedad, un paciente falleció y en 2 casos la enfermedad ha seguido progresando.Respecto a los pacientes no tratados, 4 fallecieron por progresión de la enfermedad yotro por otras causas. El resto (15 pacientes) no manifiesta recaídas.Representación gráfica de los resultados: 18
  19. 19. Durante la realización de los análisis en la Unidad de Investigación de la ULL-HUC hemos aprendido la mecánica de trabajo en laboratorio de diagnóstico molecular,así como la determinación de mutaciones somáticas en las células tumorales. Este tipode pruebas conducen a un diagnóstico y un tratamiento más personalizado gracias a lasgrandes posibilidades que nos ofrece la terapia diana-dirigida, por tanto suponen elinicio de una sanidad que será más efectiva. 19
  20. 20. BIBLIOGRAFÍA: 1. Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y, et al Gain of funtion mutations of c-kit in human gastrointestinal tumors. Science 1998;279:577-580 2. Moskaluk.CA, Tian Q, Marsahall CR, et al. Mutations of c-kit JM domain are found in a minority of human gastrointestinal stromal tumors. Oncogene 1999; 18:1897-1902 3. Corless CL, Fletcher JA, Heinrich MC. Biology of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2004;22: 3813-3825 4. Rubin BP, Heinrich MC, Corless CL. Gastrointestinal stromal tumors. Lancet 2007;369:1731-1741 5. Wardelman E, Losen I, Hans V. Deletion of Trp-557 and Lys-558 in the juxtamembrane domain of the c-kit protooncogen is associated with metastasic behavoir of gastrointestinal stromal tumors. Int J Cancer 2003;106:887-895 6. Wardelman E, Neidt I, Bierhoff E. et al. c-kit mutations in gastrointestinal stromal tumors occur preferentially in the spindle rather than in the epithelioid cell variant. Mod Pathol 2002;15:125-136 7. Lux ML, Rubin BP, Biase TL, et al. KIT extracellular and kinase domain mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am J Pathol 2000;156:791-795. 8. Heinrich MC, Corless CL, Duensing A, et al. PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors. Science 2003;299:708-710. 9. Poveda A, Artigas V, Casado A, y cols. Guia de práctica clínica en los tumores del estroma gastrointestinal (GIST). Cir Esp 2008;84: extraordinario 1. 10. Ernst SI. Hubss AE, Przygodzki RM et al. KIT mutation portends poor prognosis in gastrointestinal stromal/smooth muscle tumors. Lab Invest 1998;78:1633-1636. 11. Taniguchi M, Nishida T, Hirota S, et al. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 1999;59:4297-4300. 12. Emile JF, Théou N, Tabone S, et al. Clinicopathologic, phenotypic, and genotypic characteristics of gastrointestinal mesenchymal tumors. Clin Gastroenterol Hepatol 2004;2:597-605. 13. Kim TW, lee H, Kang YK, et al. Prognostic significance of c-kit mutation in localized gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 2004;10:3076- 3081. 14. Lasota J, Jasinski M, Salomo-Rikala M, et al. Mutations in exon 11 of c-kit occur preferentially in malignat versus bening gastrointestinal stromal tumors and do not occur in leiomyomas o leiomyosarcomas. Am J Pathol 1999;154:53-60. 15. Corless CL, McGreevey Lm Haley A, et al. KIT mutations are common in incidental gastrointestinal stromal tumors one centimeter or less in size. Am J Pathol 2002;160:1567-1572. 16. Singer S, Rubin BO, Lus Ml, et al. Prognostic value of KIT mutation type, mitotic activity and histologic subtype in gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2002; 20: 3898-3905. 17. Emory TS, Sobin LH, Lukes L, et al. Prognosis of gastrointestinal smooth muscle (stromal) tumors: dependence on anatomic site. Am J Surg Pathol 1999;23:82-87. 18. Martín J, Poveda A, Llombart- Bosch A, et al. Deletions affecting codons 557- 558 of the c-kit gene indicate a poor prognosis in patiens with completely 20
  21. 21. resected gastrointestinal stromal tumors. A study of the Spanish group for sarcoma research (GEIS). Clin Oncol 2005; 23:6190-6198.19. Martín J, Gutierrez A, García del Muro X, et al. Time dependence of critical deletions as prognostic factor for relapse free survival (RFS) in localized GIST. A Spanish group for sarcomas research (GEIS) study. J Clin Oncol 2008;26 Suppl;10503.20. Lasota J, Dansonka-Mieszkowska A, Sobin LH, Miettinen M. A great majority of GISTs with PDGFRA mutations represent gastric tumors of low or no malignant potential. Lab. Invest 2004;84:874–883.21. Lasota J, Stachura J, Miettinen M. GISTs with PDGFRA exon 14 mutations represent subset of clinically favorable gastric tumors with epithelioid morphology. Lab. Invest. 2006; 86:94–10022. Joensuu H, Roberts PJ; Sarlomo-Rikala M, et al. Effect of the tyrosine kinase inhibitor STI571 in a patient with a metastatic gastrointestinal stromal tumor. N Engl J Med 2001;344:1052-1056.23. Fletcher JA,Rubin BP. KIT mutations in GIST. Curr Opin Genet Dev 2007;17:3-7.24. Heinrich MC, Maki RG, Corless CL, et al. Sunitinib (SU) response in imatinib-resistant (IM-R) GIST correlates with KIT ans PDGFRA mutation status. J. Clin Oncol 2006:24 Suppl 18: 9502.25. Antonescu CR. Besmer P, Guo T, et al. Acquired resistance to imatinib in gastrointestinal stromal tumors occurs through socondary gene mutation. Clin Cancer Res. 2005;11:4182-90. Clin Cancer Res 2005;11:4182-4190.26. Heinrich MC, Corless CL, Blanke CD, et al. Molecular correlates of imatinib resistance in gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2006;24:4764- 4774.27. Miettinen M, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors definition, clinical, histological, inmunohistochemical, and molecular genetic features and differential diagnosis. Virchows Arch. 2001;438:1-2.28. Demetri G, Benjamin R, Blanke CD, et al. NCCN Task Force report: optimal management of patiens with gastrointestinal stromal tumors (GIST)- Update of the NCCN Clinical Practice Guidelines. JNCCN. 2007; suppl 2: S1-29.29. Laurini JA, Carter Elliot. Gastrointestinal stromal tumors. Arch Pathol Lab Med 2010;134:134-141.30. Braconi C, Bracci R, Bearzi I, et al. KIT and PDGFRα mutations in 104 patients with gastrointestinal stromal tumors (GISTs): a population-based study. Ann Oncol. 2008;19:706–710.31. Agaram NP, Laquaglia MP, Ustun B, et al. Molecular characterization of pediatric gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 2008 May 15;14:3204-3215.32. DeMatteo R, Owzar K, Maki R, et al. Adjuvant imatinib mesylate increases recurrence free survival (RFS) in patients with completely resected localizae primary gastrointestinal stromal tumor (GIST): North American Intergroup Phase III trial ACOSOG Z9001. 2007 ASCO Annual Meeting. Abstract 10079.33. Holden JA, Willmore-Payne C, Coppola D, Garrett CR, Layfield LJ. High- resolution melting amplicon analysis as a method to detect c-kit and platelet- derived growth factor receptor alpha activating mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am J Clin Pathol. 2007;128:230-238. 21
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  23. 23. 23

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