1. Efecto post-Antibiótico (PAE)
Juando

2. Introducción
Se describe como, la supresión del
crecimiento bacteriano que
persiste después de una corta
exposición del microorganismo a
los antimicrobianos.
Supresión del desarrollo bacteriano
después de una breve exposición a
un antimicrobiano.
Capacidad del ATB de suprimir el
nuevo crecimiento bacteriano pese
a que su concentración sérica cae
por debajo de la CIM. El efecto
persiste hasta que la concentración
disminuye y las bacterias
sobrevivientes comienzan a
multiplicarse . 3-6h.

3. Determinación in vitro del PAE
Eliminación rápida del fármaco:
El lavado repetido de los microorganismos es el método mas
comúnmente usado para la remoción rápida de los
medicamentos.
• Se realiza por centrifugación de las colonias de crecimiento a 1200 X g por 5-
10 min, se remueve el sobrenadante, y se resuspende el botón en un medio
libre de medicamento. (2 veces)
• Descartando el 90% del sobrenadante, 2 lavados reducen la concentración del
medicamento hasta 100 veces menos.
• Descartando completamente el sobrenadante, 2 lavados pueden reducir la
concentración mucho mas de 10,000 veces.

4. • Un método mas rápido y simple para
remover el medicamento es la
inactivación del mismo. (ß-lactámicos)
• Otros investigadores han usado filtros
para remover el medicamento que se
difunde en la superficie del agar. La
ventaja es que no se expone al
microorganismo a factores que puedan
afectar su crecimiento.
• También se ha usado la tecnología E-
test, en la cual se transfiere a un tubo o
superficie de agar y se mide la
concentración.

5. Cuantificación del PAE
Conteo de viables:
Generalmente se usa el conteo de UFC/ml para el seguimiento del
crecimiento bacteriano después de la eliminación de los
medicamentos.
PAE: T-C
T: tiempo (en horas) que tarda el cultivo de microorganismos tratados
en incrementar 1 log10 su concentración a partir del tiempo O
(dilución del antimicrobiano).
C: tiempo (en horas) que tarda el cultivo control en incrementar 1
log10 su concentración a partir del tiempo 0.
Se ha usado también la técnica por filtro de membrana para la
cuantificación del PAE.

6. Mediciones mecánicas
• La mediciones ópticas y de impedancia han sido usados por muchos
investigadores para medir PAE de antibióticos contra bacterias, tanto gram
negativas como gram positivas.
• La densidad óptica y la impedancia no pueden detectar números
bacterianos menores a 106 UFC/ml, la determinación logarítmica del
crecimiento bacteriano por estos métodos presenta un aparente exceso
en el numero del umbral de detección.

7. Mediciones bioquímicas
• La medición de ATP por ensayos de
bioluminiscencia ha sido también
usado para la determinación del
PAE.
• Este método se basa en la reacción
entre luciferasa de luciérnaga y la
reducción a luciferina, que, en
presencia de ATP y Mg, da un
complejo de rendimiento ATP-
luciferina. Cuando se introduce
también oxigeno, este complejo se
disocia y se libera energía de
luz, que puede ser medida por una
variedad de instrumentos que
detectan luz.

8. Morfología
• Diversos estudios han usado un microscopio de
contraste de fases para evaluar los cambios
morfológicos que se presentan cuando se expone
algún tipo de bacteria (E.coli) a ciertos
medicamentos (cipro y amp) a la mitad de la
concentración de la CIM. Esta exposición resulta en
la formación de filamentos.
• Tiempo para que la población bacteriana se revierta
a 90% bacilos 10% formas aberrantes.(arbitraria)

9. • Las alteraciones que se han
visto no son uniformes en todos
los microorganismos, pero sin
embargo, persiste una buena
correlación con la
determinación del PAE
determinado por el conteo de
viables.
The effects of both
b-lactam antibiotics were apparent at the first time point at
which the cells were examined, which was 15 min after the
antibiotics were removed. All of the cells in both suspensions
appeared as long filaments of 25 to 60 mm in length, whereas
in negative control cultures the cells were 1.5 to 6.0 mm long.
Very few of the elongated rods were motile, and those that
were moved much more slowly than the cells in the negative
control cultures. No change in either antibiotic-containing medium
was apparent until 75 min after antibiotic removal, when
control
a few short, motile cells began to appear

10. Métodos específicos
• Técnica de crecimiento
o Se recomiendan los medios Mueller-Hilton y tripticasa soya para los microorganismos indicados.
o La dilución de antimicrobianos se hace en agua estéril a una concentración 100 veces mayor a la designada. Se
agrega una alícuota de 100 µl de esta solución a 8.9 ml del medio a analizar previamente calentado a 37°C.
o El organismo analizado debe estar en la fase logarítmica de crecimiento al tiempo de exposición a los
antimicrobianos. Se escoge el cultivo que después de incubado a 37°C toda la noche no sobrepase 0.3 de la
densidad óptica medida a 580 nm.
o Se incuban los tubos a 37°C agitándolos por el periodo de exposición.
o Se remueve el antimicrobiano por uno de estos métodos:
1. Centrifugación a 1200Xg por 10 minutos
2. Adición de B-lactamasas para inhibir completamente a los susceptibles
3. Diluciones 10-2 10-3 en el medio precalentado
4. Filtración por membrana
o Se mantiene en agitación a 37°C
o Adicionar los tubos controles para asegurar que hay crecimiento después de los lavados
o Conteo de UFC/ML en la hora 0, luego de los lavados diluciones e inactivación con B-lactamicos y cada 1-1.5
horas.
o Realizar graficas de las UFC/ml

11. • Técnica membrana/agar
o debe ser realizado en el medio adecuado para cada caso. La concentración debe
ser 4 o 5 veces el MIC.
o Se coloca en el agar varios filtros de membrana de poros de 0.3 µm y se deja a
temperatura ambiente de 5-10 minutos.
o Una alícuota de 100 µl de diluciones de 1:10 o 1:100 del inoculo bacteriano, es
colocado en las membranas y propagado en un tubo de vidrio en forma de L. se
incuba a 37°C por 2-3 horas para obtener la fase logarítmica de crecimiento.
o Se extraen las membranas con pinzas, se pone en agar precalentado con
medicamento y se reincuba.
o Luego se llevan las membranas a un medio libre de medicamento por 10 minutos
lo que permite que el medicamento se difunda en el agar.
o Las membranas son analizadas después de la inoculación, antes y después de la
exposición a los medicamentos y por intervalos de 1-2 horas. Después se coloca las
membranas en tubos con hielo NaCl se vorterizan y se remueve las bacterias de la
membrana. Se hace conteo de las colonias en 10 diluciones seriadas en s.s.
o Se procesan las membranas control
o Se expresan los resultados en UFC/filtro y se grafican.

12. Modelos farmacocinéticos
• la exposición a los medicamentos difiere
considerablemente de la situación en vivo en
que los organismos son usualmente expuestos
a niveles fluctuantes de medicamentos. Se usa
entonces 2 modelos:
o Modelo de diluciones
o Modelo de diálisis

13. Modelo de diluciones Modelo de diálisis
• Consiste de un cultivo en frasco Consisten en un sistema cerrado que
que se le añade un medio fresco y contiene el microorganismo
del cual el mismo volumen será
removido. Si el antimicrobiano es separado por una membrana
añadido directamente dentro del semipermeable que proviene de un
frasco, la dilución continua del sistema de medio fresco.
fármaco simula los niveles de
antimicrobianos después de la
administración en bolo
intravenoso.
• El mayor problema con este
modelo es que tanto los
microorganismos como el
medicamento se diluyen.

14. Factores que afectan la medición in
vitro del PAE
• El microorganismo (tipo)
• El antimicrobiano (clase)
• Condiciones del experimento
• Tamaño del inoculo
• Fase de crecimiento del microorganismo
• Mecanismo de extracción del cultivo
• pH y temperatura
• Efecto de re-exposición
• Sub MIC’s
• Combinación de antimicrobianos

15. Factores que afectan el PAE
Tipo de microorganismo y Concentración
antimicrobiano
• Eagle. Penicilina G y varios cocos gram
positivos. El PAE solo fue observado en la
• La presencia del PAE puede diferir ultima concentración que fue letal para el
significativamente con una combinación organismo.
organismo/antimicrobiano especifico.
• La duración del PAE incrementa con
concentraciones crecientes pero alcanza un
• En contraste con los datos que se observan máximo en la concentración de penicilina
con cocos gram positivos, se marcan mas rápidamente bactericida para el
diferencias en la supresión post-antibiótica organismo.
observada para diferentes antimicrobianos • Ensayos realizados con
en bacilos gram negativos. rifampicina, tetraciclina y cefamandole
contra cepa estándar de E.coli, se observo
que el PAE fue medible solo cuando se
observaba concentración igual o mayor que
el CIM.
La duración del PAE con antibióticos β-lactámicos es
relativamente corta, según varios estudios.

16. Duración de la exposición Tamaño del inoculo
• El alargamiento del tiempo de • No se observa el PAE con altas
exposición al antimicrobiano concentraciones del inoculo
se ha visto también que (S.aureus-penicilina) en bacilos
prolonga la duración del PAE. gram negativos el efecto del
• En cocos gram positivos la aumento del inoculo es mucho
duración del PAE se da en 4 de mas pequeño (imipenem).
9 cepas, siguiendo la duración
del incremento de la
exposición a penicilinas.
• En bacilos gram negativos, se
ha observado que la duración
del PAE es mucho mas larga
expuestos a B-lactámicos.

17. Fase de crecimiento del Agitación mecánica
organismo
Siempre se ha probado los No se ha observado
estudios de PAE en la fase diferencias significativas
logarítmica de crecimiento. entre el PAE de ensayos
Pero diversos estudios estacionarios y de ensayos
demuestran que tanto en la en agitación
fase logarítmica como en la
fase de retraso la duración
del PAE es muy similar.

18. pH Temperatura
• Muy pocos estudios han • Se ha observado que tiene un
estudiado la influencias del pH efecto variable en la
en el PAE. farmacocinética de los
antimicrobianos.
• La actividad de
aminoglucosidos y • El incremento de la
fluoroquinolonas se ve temperatura resulta en una
bastante afectada por los reducción de 4 veces el
pH, no tanto como los β- MIC, pero en otros ensayos
lactámicos. solo se ven alteraciones
mínimas del PAE.
• La corrección del pH puede
ayudar a corregir los ensayos.

19. Oxígeno Tipo de medio
• Vancomicina, aminoglucosidos, y • Diferentes medios muestras
quinolonas son alteradas por diferentes efectos variables en el
cambios en la tensión de oxigeno. PAE.
• El efecto mas pronunciado se ha
observado con trimetoprin, con
• Sin embargo, la baja tensión de S.aureus en tripticasa soya y en
oxigeno representa la tensión Mueller Hilton. La diferencia fue
normal encontrada en los tejidos, explicada por el contenido de
que no influencia la duración del timina que se sabe inhibe la
PAE actividad del trimetoprin.
• Estudios realizados en agar
solidos y líquidos, revela que el
efecto del PAE es similar o
ligeramente mayor en agar que
en medio liquido.

20. Suero humano Leucocitos y plaquetas
• La influencia del suero humano no ha • Los leucocitos pueden también
sido ampliamente estudiada en la afectar la duración del PAE. Se ha
determinación del PAE, algunos demostrado que los organismos en la
estudios revelan un comportamiento fase de PAE son mas susceptibles a la
muy similar del PAE tanto en agar actividad antibacteriana de los
como en suero humano, otros en leucocitos humanos. Esto también es
cambio, muestras diferencias llamado PALE, fenómeno de realce de
significativas (E.coli, tetraciclina) leucocitos post-antibíoticos.
• Las plaquetas secretan proteínas
plaquetarias microbicidas, que se ha
demostrado inducen reducción del
antibiótico e incremento de la
duración del PAE.

21. Sub-MICs Re-exposición
• Se ha demostrado que los Se ha demostrado que múltiples
microorganismos en la fase exposiciones de un m.o a un
PAE son mas susceptibles a los medicamento produce
efectos inhibitorios de la decremento significativo del PAE,
concentración del con reducción concomitante en la
medicamento sub-MIC. muerte bacteriana, pero se ha
• Han usado el nombre de observado aumentos del MIC.
“efecto post-antibiótico sub-
MIC”, para describir la
combinación del efecto aditivo
del PAE de exposición a niveles
sub-MIC.

22. Combinación de antimicrobianos
• En general estas combinaciones producen
PAEs en S.aureus y otros Estreptotococcus que
son aditivos o sinérgico, pero en otros
microorganismos no se observa.
• El aumento del nivel del PAE en BGN por
combinación de antimicrobianos depende en
primer lugar de la habilidad individual de cada
medicamento para inducir el PAE.

23. Determinación in vivo del PAE
• Se podría examinar el PAE en vivo en tejidos y
fluidos corporales cuando es posible hacer
ensayos de UFC y concentración del
medicamento.
• Se define como la diferencia en el tiempo para
que el número de bacterias en tratamiento y el
control de tejidos o fluidos biológicos incremente
en 1 log10 sobre los valores cuando la
concentración del medicamento en suero o el
sitio de la infección cae por debajo del MIC.

24. Modelo de infección Modelo de neumonía Modelo meningitis en
en ratones en ratones conejos
PAE K.pneumoniae
Normales o neutropénicos
Cuantificación
[ ] ATB se PAE in vivo,
bacteriana
mide directa/ por separado.
14 h < ATB
El inoculo es [ ] en Infección de tejidos en
mas variable suero, ˂ATB?? conejos
[ ] exacta en el [ ] suero, [ ]
sitio de la antimicrobiana en
infección. los fluidos
musculares.
Endocarditis en ratas
Tratado Sin Tratar
Curso de la actividad
antimicrobiana
P.aeuroginosa E.faecalis

25. Métodos específicos
• Modelo de infección en ratones neutropenicos:
o Se inyecta ciclofosfamida 150 mg/kg intraperitoneal en el día 0 y 3. Lo que produce
una severa neutropenia.
o Se inyecta aproximadamente 106UFC en 0.1ml en 40-60 ratones, se pueden
estudiar 2 diferentes organismos si se inyectan en músculos opuestos.
o Después que el microorganismo a crecido por 2 horas, se aplica una inyección de
antimicrobiano vía subcutánea a aproximadamente el 60% de los ratones.(hora 0)
o Ratones con tratamiento son sacrificados por dislocación cervical a la
1,2,3,4,6,8,10,12,16,24 horas después de la dosis antimicrobiana. Los ratones
control sin tratamiento pueden ser sacrificados al menos en la -1,0,2,4,6 y 8 horas.
o Los músculos son removidos y homogenizados en 9 ml de NaCL 0.85% helado, y se
determina el conteo de viables en el agar apropiado.
o El conteo de UFC son graficados y la duración del PAE se calcula por l siguiente
ecuación: PAE: T-C-M
M:tiempo en que los niveles en suero exceden el MIC
T: tiempo requerido para el conteo de UFC en el musculo de ratones tratados
C: tiempo requerido para el conteo de UFC en el musculo de los ratones control

26. Factores que afectan el PAE in vivo
• Tipo de microorganismo
• La clase de antimicrobiano
• La dosis del medicamento
• Simulación de la farmacocinética humana
• Presencia de leucocitos
• Sitio de infección

27. Mecanismos del PAE
• El mecanismo por el cual el antimicrobiano
induce la supresión del crecimiento
postantibiotico es ampliamente desconocido.
Esto claramente no se debe a un cambio en la
población en los medios de cultivo por variantes de
lento crecimiento, porque la curva de crecimiento
de los cultivos de ensayo y de control son paralelos
en la fase post-PAE. Esto sugiere que existen varias
vías y mecanismos metabólicos envueltos en este
proceso.

28. Persistencia limitada en los sitios de
acción
• Algunos medicamentos se unen
reversiblemente a las subunidades especificas
de las bacterias susceptibles. Esto podría
representar el tiempo que toma el antibiótico
para difundirse por los ribosomas. Esto no
representa a todos los microorganismo, por
ejemplo, una proteína de baja peso molecular
es usualmente el mayor PBP para bacilos pero
no para cocos.

29. Recuperación de daños no letales
• Se ha visto que la alteraciones ultra
estructurales en las bacterias durante el PAE
son muy similares a las observadas durante
continua exposición a concentraciones
inhibitorias. Estas alteraciones retornan al
estado anterior de crecimiento, y es
determinado por conteo de viables.

30. Resintensis de proteínas y enzimas
• Los aminoglucosidos tiene una letal e irreversible fijación a
las subunidades del ribosoma, esto demuestra la dificultad
de determinar el PAE in vitro con este medicamento.
• Los largos PAE’s observados en in vivo con los
aminoglucosidos puede representar la unión de cantidades
sub-letales de medicamento, con la subsecuente ruptura de
la síntesis de proteínas.
• Podría concluirse que durante la exposición a los
medicamentos que inhiben la síntesis de proteínas y de
ácidos nucleicos los microorganismos agotan las proteínas
funcionales necesarias para sus metabolismo intermediario
y crecimiento sin obstáculos. El PAE puede representar un
periodo de resintesis de estas proteínas.

31. Significado biológico del PAE
• La presencia del PAE puede ser solo una
curiosidad microbiológica de cuestionable valor a
menos que la relevancia para la situaciones
clínicas sea demostrada.
• el PAE tiene su mayor importancia en el régimen
de dosis de antimicrobianos.
• La combinación de antimicrobiano/medicamento
que no demuestre PAE requiere administración
mas frecuente de antimicrobianos que aquellos
que exhiben el PAE.

32. Implicación del régimen de
dosificación
• Algunas experiencias clínicas con penicilina G
sugieren que algunas infecciones pueden ser
tratadas adecuadamente con terapia
antimicrobiana intermitente aunque los niveles
de penicilina en suero y tejidos caigan por debajo
del MIC por algunas horas.
• Esto depende de el microorganismo que cause la
infección y el medicamento usado. Los regimenes
de dosificación pueden ser aplicados en principio
a combinación de organismo/medicamento que
muestre un PAE prolongado.

33. Decrecimiento de la actividad
bactericida durante el PAE.
• Se cree que los organismos en la fase del PAE
pueden demostrar alteración de la
susceptibilidad a la actividad bactericida de
ciertos antimicrobianos.

34. Ensayos clínicos
• Hay muy pocos ensayos clínicos que hayan examinado
la eficacia de concentración intermitente contra
mayores dosis de antimicrobianos.
• Estudios con antibióticos orales en infecciones
respiratorias altas han demostrado que un par de dosis
diarias es tan efectivo como la administración del
medicamento 3 o 4 veces por día.
• La administración de dosis intermitentes en modelos
animales ha resultado en la reducción de la oto y
nefrotoxicidad.