Biotecnologia v14

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Biotecnologia v14

  1. 1. Departamento de Biología Celular Facultad de Ciencias, UNAM Manual de biotecnología Coordinadoras: Claudia Segal Kischinevzky y Beatriz Rodarte Murguía
  2. 2. Autores en orden alfabético: Luisa Alba Lois, Roberto Coria Ortega, Édgar Dantán González, María Isabel de la Cruz Laina, Juan Luis Chávez Pacheco, María Eugenia Muñiz Díaz de León, Ángela Victoria Forero Forero, Angélica González Oliver, Alejandra Abigaíl González Valdez, Laura Kawasaki Watanabe, Suri Martínez Yee, Beatriz Rodarte Murguía, Bibiana Rodríguez Ponce, María Isabel Saad Villegas, Claudia Andrea Segal Kischinevzky, Alfonso José Vilchis Peluyera, Beatriz Zúñiga Ruiz. Apoyado por PAPIME PE202707 “Hacia una enseñanza actual de la Biotecnología”2011
  3. 3. Manual de biotecnología 1a edición, 2011 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias ISBN Impreso y hecho en México
  4. 4. 5 Práctica 1. Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae 9 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 2. Inteligencia tecnológica competitiva 17 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 3. Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido 21 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Cuestionario Bibliografía Mapas de los plásmidos empleados en la práctica Contenido
  5. 5. 6 Práctica 4. Extracción de dna e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses 27 Introducción Objetivo general Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía Práctica 5. Sesión de bioinformática 33 Objetivos Metodología Discusión de resultados Bibliografía Práctica 6. Análisis de la actividad de catalasas 43 Introducción Objetivo general Objetivo específico Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía Práctica 7. Síntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnológicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum 47 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía
  6. 6. 7 Práctica 8. Emulsificación de diesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses 51 Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 9. Metabolismo secundario 55 Introducción Objetivos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliografía Práctica 10. Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas 61 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Primera parte. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes al petróleo Material y equipo Resultados Segunda parte. Actividad enzimática Material y equipo Resultados Bibliografía Cultivo de tejidos vegetales. Introducción 65 Práctica 11. Fitorremediación con helechos 67 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliografía
  7. 7. 8 Práctica 12. Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria 73 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Parte i. Germinación de semillas in vitro Parte ii. Inducción de callo embriogénico Parte iii. Embriogénesis Resultados Análisis Bibliografía Práctica 13. Organogénesis somática de Nicotiana glauca 79 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Parte i. Germinación de semillas in vitro Parte ii. Cultivo in vitro Parte iii. Inducción de brotes Parte iv. Rizogénesis Resultados Análisis Bibliografía Práctica 14. Identificación de organismos genéticamente modificados 85 Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Módulo i. Extracción de dna Módulo ii. Amplificación de dna Módulo iii. Electroforesis en geles de agarosa Resultados Bibliografía Anexo 93
  8. 8. 9 Práctica 1 Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae Introducción El vino El vino es un producto de la fermentación alcohólica que llevan a cabo las levaduras a partir del zumo de frutas y otros materiales ricos en azúcar. Los factores que determinan la calidad de un vino son el clima, el suelo, la variedad de uva empleada y el proceso de fermentación. Las levaduras implicadas en la fermentación del vino suelen ser de dos tipos: las llamadas levaduras silvestres, que se encuentran presentes en las uvas, y las levaduras de vino cultiva- das, como Saccharomyces cerevisiae, que se añaden al mosto para iniciar la fermentación. Los azúcares que contiene el mosto de la uva se convierten en alcohol (etanol), con des- prendimiento de CO2 como subproducto. El grado de etanol presente en el vino se encuentra entre 6 y 13° Gay Lussac (gl) y hasta 20 °gl en licores. Además contiene sustancias orgánicas como los ácidos tartárico, málico, succínico, etc., en concentraciones de 4-7 g/L de vino, así como sustancias albuminoides, gomas, sales minerales y agua. Microflora natural de la uva Las uvas están compuestas por el hollejo (cáscara), semillas y pulpa. Sobre la superficie de las uvas habitan levaduras y bacterias aerobias estrictas. Las levaduras que predominan en la su- perficie de las uvas maduras son Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora spp. En las uvas maduras se encuentran como microflora bacterias lácticas como Leuconostoc oenus, Lactobacillus spp, Pediococus parvulus, entre otras. Otros microorganismos presentes son las bacterias acéticas, como Acetobacter aceti y Gluconobacter spp. Cinética de la fermentación alcohólica Durante la fermentación alcohólica del mosto de la uva, las levaduras que participan en el proceso atraviesan tres fases: 1. Multiplicación. En dos días las cuentas totales (medida directa de la división celu- lar) y las viables alcanzan 107 células por mililitro. 2. Fermentación. Las cuentas totales se incrementan todavía más y después per- manecen constantes. Las cuentas viables alcanzan casi la misma concentración máxima de las totales, pero muestran una fase estacionaria muy corta debido principalmente a la falta de nutrientes, así como a que el etanol ejerce un efecto tóxico y a una alteración de la permeabilidad de la membrana celular.
  9. 9. Manualdebiotecnología|práctica1 10 3. Fase de declinación. La concentración de las levaduras totales no varía mucho, pero las cuentas viables disminuyen rápidamente a 105 células/ml, ya que al morir las levaduras se presenta un fenómeno de hidrólisis de la pared celular (autólisis) por su propia lisozima. Gracias a este proceso, el mosto es enriquecido con vitami- nas, aminoácidos y lípidos que estimulan el desarrollo de las bacterias lácticas. La cinética de consumo de los azúcares va a depender de la cepa de levadura utilizada, de la temperatura del proceso, de que no exista sustrato limitante y de la concentración de etanol que se genera. Bioquímica de la fermentación alcohólica La primera parte del metabolismo de los azúcares ocurre en presencia o en ausencia de oxí- geno, siguiendo las rutas de Embden-Meyerhof-Parnas (glucólisis) o la de Warburg-Dickens (pentosas-fosfato). Ambas vías funcionan simultáneamente, pero satisfacen diferentes exi- gencias: la glucosa difosfato se encarga de la síntesis de energía y la fructosa monofosfato de la creación de precursores para la síntesis celular y del Nadph necesario. Objetivo general Introducir al estudiante en el conocimiento de la biotecnología de las fermentaciones tradi- cionales. Objetivos específicos • Familiarizar al estudiante con el manejo de algunas técnicas microbiológicas. • Identificar las rutas metabólicas principales asociadas al proceso de fermentación alcohólica. • Determinar el grado alcohólico de las muestras y la concentración de azúcares re- ductores presentes al inicio y al final de la fermentación alcohólica. • Reconocer en la elaboración del vino un proceso biotecnológico de gran impacto en la industria y en constante transformación Material y equipo Parte I Material Equipo * 2 kg de uvas (verdes o rojas) Licuadora * 1 garrafón de plástico c/tapa de 5 litros Autoclave * 1 botella de vidrio c/tapa de 500 ml Incubadora con agitación * 1 botella de vidrio c/tapa de 1,000 ml Refrigerador 1 asa de siembra metálica Campana de flujo laminar 1 mechero 1 mechero * 6 gasas grandes * 100 gr de algodón, hilo y tijeras * 1 L cloro comercial *Material que deberán traer los alumnos
  10. 10. FermentaciónalcohólicaporSaccharomycescerevisiae|práctica1 11 Parte II Material Equipo Botella con el inóculo Refrigerador Botella con el macerado de uvas * 1 frasco Gerber *Material que deberán traer los alumnos Parte III Material Equipo 2 botellas para centrífuga de 500 ml Centrífuga de banco 1 alcoholímetro Balanza de 2 platos 1 matraz Erlenmeyer de 1,000 ml Refrigerador 1 jarra para jugo 1 baño de hielo 1 vaso de precipitados de 500 ml 1 colador de cocina * 1 frasco Gerber * 1 metro de manta de cielo * Garrafón con el fermentado de uvas *Material que deberán traer los alumnos Parte IV Material Equipo 10 tubos de ensayo de 5 ml Vórtex 1 gradilla Espectrofotómetro 1 micropipeta de 1,000 µl Baño maría Puntas para micropipeta Potenciómetro 1 vaso de precipitados de 50 ml 1 vaso de precipitados de 100 ml 2 celdas para espectrofotómetro 1 piceta 1 cronómetro Reactivos Muestra inicial (tomada en la parte II) Vino centrifugado Glucosa DNS
  11. 11. Manualdebiotecnología|práctica1 12 Metodología Parte I. Maceración e inóculo del medio de cultivo (preparación del mosto) 1. Lavar y moler 2 kg de uvas en la licuadora hasta obtener una pasta. 2. Colocar 250 ml de las uvas maceradas en una botella de 500 ml (inóculo). 3. Colocar el resto de la pasta en una botella de 1,000 ml, procurando no exceder ¾ del nivel de la botella, reservar los matraces obtenidos. 4. Esterilizar ambas botellas en autoclave —de 115 a 120 o C— por 10 minutos. 5. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 6. En el matraz de inóculo, aplicar tres veces con un asa de siembra Saccharomyces cerevisiae en condiciones de esterilidad. 7. Incubar a 37 o C por tres días u ocho días a temperatura ambiente. 8. Almacenar la botella de 1,000 ml a 4 °C hasta su utilización. 9. Esterilizar el garrafón, lavándolo con abundante agua y cloro concentrado, dejarlo secar y almacenarlo hasta su utilización. Parte II. Inoculación e incubación 1. Se depositan en el garrafón de plástico los 250 ml de inóculo cultivado y la pasta de uva restante (botella de 1,000 ml), agitando manualmente hasta su homogeneiza- ción. Tomar una muestra de 5 ml que se utilizará en la parte IV como muestra inicial (mantener a 4 °C, en el frasco Gerber hasta su utilización). 2. Incubar a 29 °C (los estudiantes se llevan el garrafón a casa, manteniéndolo en un sitio fresco en el que que no reciba luz directa) para no desviar la fermentación de los azúcares hacia la producción de ácido acético. 3. Agitar dos o tres veces al día (oxigenación) y liberar el CO2 formado girando levemen- te la tapa del recipiente para permitir la salida del gas. Se estima que la primera y segunda parte pueden llevarse a cabo al principio del se- mestre, mientras las partes III y IV se hacen al final para permitir una buena fermen- tación. Parte III. Obtención del producto por centrifugación 1. Filtrar el producto en una jarra, —con manta de cielo y colador—, hasta separar los componentes de la uva del líquido. 2. Mantener en frío (—baño de hielo—) el producto hasta el momento de la centrifuga- ción. 3. Colocar el producto en botellas para centrífuga y balancearlas. Centrifugar a 8 Krpm durante una hora. 4. Verter el sobrenadante en un matraz de 1,000 ml, limpio y previamente desinfectado con cloro concentrado. 5. Eliminar las células del microorganismo que se depositaron en el fondo de la botella (pastilla). 6. Volver a centrifugar todo el sobrenadante una vez más. Tomar una muestra de 5 mL que se utilizará en la parte IV como muestra final (mantener a 4 °C en un frasco Ger- ber). 7. Determinar la concentración de alcohol en grados Gl con ayuda de un alcoholímetro. a. Calibrar el alcoholímetro sumergiéndolo suavemente en agua; esta medida se toma como 0 °Gl. b. Sumergir suavemente el alcoholímetro en el vino, tomar la medida que indique la escala.
  12. 12. FermentaciónalcohólicaporSaccharomycescerevisiae|práctica1 13 Parte IV. Determinación de la concentración de azúcares reductores. 1. Determinar el pH de las muestras inicial y final (por duplicado). 2. Preparar, para todo el grupo, 30 ml de una solución de dns al 0.5% y 30 ml de solución de glucosa estándar (1.5 mg/ml). 3. Marcar los tubos de ensaye y agregarles las soluciones como se muestra en la si- guiente tabla: Tubo Sol. de glucosa (ml) Agua (ml) Muestra inicial (ml) Muestra final (ml) DNS (ml) 1 - 1.0 - - 0.5 2 0.2 0.8 - - 0.5 3 0.4 0.6 - - 0.5 4 0.6 0.4 - - 0.5 5 0.8 0.2 - - 0.5 6 1.0 - - - 0.5 7 - - 0.5 - 0.5 8 - - 0.5 - 0.5 9 - - - 0.5 0.5 10 - - - 0.5 0.5 Tubo Concentración de glucosa (mg/ml) 1 0.0 2 0.3 3 0.6 4 0.9 5 1.2 6 1.5 Tabla de concentraciones de glucosa para la curva estándar. 4. Agitar todos los tubos en vórtex -de 30 a 60 segundos aproximadamente. 5. Incubar los tubos tapados durante cinco minutos a baño María. 6. Sacar los tubos del baño y agregar 5 ml de agua destilada. 7. Agitar nuevamente en Vórtex. 8. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm. Resultados 1. pH de las muestras inicial y final: Muestra pH TI1 TI2 TF1 TF2
  13. 13. Manualdebiotecnología|práctica1 14 2. Construcción de una curva patrón de glucosa: Tubo Absorbancia (nm) Concentración de glucosa 1 0.0 2 0.3 3 0.6 4 0.9 5 1.2 6 1.5 Curva patrón de glucosa Concentración de glucosa (mg/ml) Absorbancia(nm) 3. Linealizar la curva anterior por regresión lineal y obtener la pendiente (m) y la orde- nada al origen (b), de acuerdo a la ecuación de la recta: y = mx + b Donde: x es la concentración de glucosa y es la absorbancia 4. Obtener las lecturas de la absorbancia de las muestras (por duplicado). Muestra Absorbancia (nm) TI1 TI2 TF1 TF2 5. Sustituir en la ecuación de la recta resultante de la regresión lineal, los datos de ab- sorbancia de las muestras.   x = y- b m
  14. 14. FermentaciónalcohólicaporSaccharomycescerevisiae|práctica1 15 Donde: x es la concentración de glucosa y la absorbancia m pendiente (obtenida en el paso 3) b ordenada al origen (obtenida en el paso 3) Tiempo Absorbancia (nm) Concentración de glucosa (mg/ml) TI1 TI2 TF1 TF2 6. Registrar la concentración de alcohol en el producto (resultado de la determinación con el alcoholímetro). Bibliografía Madigan, M.T. J.M. Martinko, y J. Parker (2003) Brock. Biología de los microorganismos. 10a ed. Prentice Hall, Madrid. Reyes, D.A. H.L. Escalilla, y C.J.R. Verde, (1992) Elaboración de los vinos de mesa, vol. I, uam Izta- palapa, México.
  15. 15. Manualdebiotecnología|práctica1 16
  16. 16. 17 Práctica 2 Inteligencia tecnológica competitiva Introducción El primer paso en cualquier proyecto de investigación, básica o aplicada es buscar información publicada acerca del tema. Contar con información suficiente del área tecnológica en la que se pretende incursionar, que incluya tanto fuentes bibliográficas como patentes publicadas y datos económicos y comerciales, resulta indispensable para desarrollar proyectos exitosos, técnicamente factibles y con un alto impacto social y económico. Esto es importante para los grupos de investigación de universidades e institutos, públicos y privados, pero resulta de es- pecial relevancia para las empresas. Las nuevas disposiciones legales en materia de propiedad intelectual en México y en el entorno mundial que cada vez resulta más competitivo, obligan a las empresas mexicanas a observar atentamente el entorno tecnológico en el cual se insertan. La información tecnológi- ca es actualmente condición indispensable del éxito en cualquier proceso relacionado con los sistemas productivos: investigación, planificación industrial, desarrollo, fabricación, comercia- lización y gestión. Se sabe que, incluso, existe una fuerte correlación entre el nivel de desarrollo tecnológico de los países y la capacidad de sus estructuras productivas para acceder a la información y utilizarla libremente. La inteligencia tecnológica competitiva establece una excelente base para administrar y desarrollar proyectos tecnológicos, porque permite identificar oportunidades y ventajas com- petitivas, elegir las tecnologías adecuadas y responder de forma oportuna y acertada a los cambios del entorno. Para acceder a información estratégica de un área tecnológica es indispensable utilizar fuentes de información electrónica, porque cada año aparecen publicados cientos de miles de artículos científicos en miles de revistas especializadas. La mayor parte de los artículos publicados son del área médica, en segundo lugar están las publicaciones químicas, en tercero las de biología, en cuarto las del área física y después los artículos relacionados con las ciencias sociales. Para tener una idea certera de lo que ocurre en el mundo alrededor de un objetivo par- ticular, es importante hacer una búsqueda sistemática y rigurosa que considere tanto la in- formación científica, como las patentes y la información comercial del sector tecnológico de interés. En los últimos años el proceso de diseño de las nuevas tecnologías ha visto incrementada su complejidad y su dificultad. Se hace así más necesario en cada momento disponer de un buen sistema de seguimiento de las tendencias del progreso tecnológico, tanto en la investi- gación aplicada como en el resto de las actividades del proceso de innovación. La información de patentes puede ser una herramienta muy eficaz, no sólo para el seguimiento, sino para la
  17. 17. Manualdebiotecnología|práctica2 18 previsión y la planificación del proceso de desarrollo tecnológico, así como en la realización de investigaciones económicas, científicas y tecnológicas con diferentes propósitos. El monitoreo y el análisis sistemático de la información permite construir el mapa com- pleto del área tecnológica de interés. Se identifica cuál es la oferta tecnológica global y den- tro de ella, cuáles son las tecnologías emergentes, las maduras y las que están por entrar al mercado; a quién pertenecen esas tecnologías, cuál es su tendencia de desarrollo y el posible impacto a nivel nacional e internacional de cada una de ellas. Con esta información es po- sible determinar cuáles son las tecnologías estratégicas para el grupo con el fin de diseñar programas de investigación y desarrollo, así como localizar socios potenciales para establecer alianzas tecnológicas en el nivel nacional e internacional; o bien, se puede identificar posibles licenciatarios de tecnología o tecnologías de libre acceso. Objetivo general Hacer una búsqueda sistemática de artículos científicos y de patentes, en torno a un tema de investigación biotecnológico, en bases de datos especializadas Objetivos específicos • Detectar a los mejores proveedores de bases de datos relacionados con el tema. • Identificar las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. • Encontrar las palabras clave idóneas. • Aprender a recuperar las listas bibliográficas y los artículos específicos. • Aprender a recuperar patentes de las bases públicas de Internet. Material y equipo Equipo Material (individual) Computadora con acceso a Internet conectada a la red unam * Unidad de memoria usb * Un tema de investigación biotecnológico lo suficientemente preciso *Material que deberán traer los alumnos Metodología La práctica se llevará a cabo en un aula de cómputo en dos sesiones de tres horas. En la primera sesión se realizará una búsqueda de fuentes bibliográficas, en la segunda, se efectuará una búsqueda de patentes. Los alumnos podrán hacer búsquedas individuales o formar equipos de dos integrantes. La información obtenida será utilizada para determinar el estado del arte de un tema biotec- nológico particular elegido libremente o sugerido por los profesores.
  18. 18. Inteligenciatecnológicacompetitiva|práctica2 19 Primera sesión: búsqueda de fuentes bibliográficas 1. La búsqueda bibliográfica se realiza en la página de la Dirección General de Bibliote- cas de la UNAM: <http://www.dgbiblio.unam.mx/> 2. En donde dice colecciones, selecciona: Bases de datos. 3. Aparece un buscador que localiza las bases de datos disponibles por tema. La bús- queda en esta sección se hace en español. Dependiendo del tema particular, pueden utilizarse palabras clave como: biología, biotecnología o medicina. 4. Aparece una lista de bases de datos, con los temas particulares que cada base inclu- ye y las empresas proveedoras del servicio. 5. Se selecciona un proveedor. 6. Se seleccionan bases de datos individuales que pueden resultar útiles para la bús- queda 7. Se hace una búsqueda en la base seleccionada utilizando palabras clave en inglés. Se anota el número de publicaciones encontradas en la base de datos. 8. Se localizan otras bases de datos útiles, se realiza la búsqueda con las mismas pala- bras clave y se comparan resultados. 9. Se realiza una búsqueda simultánea en las bases de datos que tienen el mayor nú- mero de citas, utilizando palabras clave en inglés. 10. La búsqueda se acota si es necesario (a los últimos años, buscando las palabras clave sólo en el título o localizando sólo revisiones) hasta obtener un número manejable de citas (entre 150 y 200). 11. Las citas se revisan y se seleccionan las que resultan pertinentes. 12. Las citas seleccionadas se guardan en la unidad Usb. 13. Se pide al buscador que cree la lista de la bibliografía consultada y se guarda en la unidad Usb. 14. Se regresa a la página de las citas seleccionadas y se obtienen los artículos comple- tos que se encuentran disponibles en formato Pdf. 15. Los artículos completos se guardan en la unidad Usb. Segunda sesión: búsqueda de patentes 1. Ingresar a la oficina de patentes europea: (http://ep.espacenet.com/quickSearch?locale=en_EP) 2. Se realiza una búsqueda con palabras clave (en inglés) localizadas en título y abstract. 3. Se seleccionan de la lista las patentes de Internet. 4. Los datos generales de la patente se copian y se pegan en un archivo de Microsoft Word. Resultados El alumno debe entregar: 1. La historia de la búsqueda. a. Una lista de las bases de datos consultadas. b. Las palabras clave utilizadas y el número de referencias obtenidas. c. La estrategia para acotar la información. 2. Una lista de las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. 3. Unarchivoelectrónicoconlalistadereferenciasbibliográficasylosartículosrecuperados. 4. Un documento impreso con la bibliografía de los artículos encontrados. 5. Un archivo electrónico con la información bibliográfica de las patentes recuperadas.
  19. 19. Manualdebiotecnología|práctica2 20 Bibliografía Cruz, E, P. Escorsa, R. Maspons, G. Izquierdo e I. Ortiz (2003), La detección de las tecnologías emergentes: El caso de los biomateriales, Seminario ALTEC 2003 Código ES.03.145. Zhu, D. y A. Porter. (2002) “Automated extraction and visualization of information for technolo- gical intelligence and forecasting”, Technological forecasting & social change 69: 495–506. Las patentes como fuente de información tecnológica, Oficina Española de Patentes y Marcas, <http://www.oepm.es/internet/inftecn/primera.htm.>
  20. 20. 21 Práctica 3 Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido Introducción El sistema de doble híbrido en levadura se desarrolló con la idea de identificar genes que co- difican para proteínas que se asocian físicamente con una proteína dada in vivo. En contraste con los métodos bioquímicos que detectan interacciones proteína-proteína, el sistema de do- ble híbrido se basa en un ensayo genético en donde la interacción entre dos proteínas se mide por la reconstitución de un activador transcripcional funcional en la levadura. Aun descono- ciendo específicamente dónde y cómo actúa una proteína particular, es posible encontrar las proteínas con las que interactúa y potencialmente utilizar esta información para conocer más sobre la posible función de dicha proteína. Enestesistemaseconstruyeunafusiónconeldominiodeuniónadna proporcionadoporel represor LexA de Escherichia coli y se expresa en un plásmido que contiene el marcador selectivo His3 (plásmido “carnada”). Por otra parte, se construye una fusión con el dominio de activación de la transcripción B42 (“acid blob”) que se expresa en un plásmido que contiene el marcador Trp1. Cuando las proteínas fusionadas interactúan, se reconstituye el factor transcripcional y se activa la transcripción ya sea del reportero LexAoperador-lacZ (localizado en un tercer plásmido) o bien, de LexAoperador-Leu2 (localizado río arriba del gen cromosómico Leu2 en la cepa EGY48). La mayoría de las proteínas pueden utilizarse de manera exitosa en el sistema del doble híbrido; sin embargo, antes de intentar buscar posibles proteínas que interactúen con la pro- teína de interés (“carnada”), es recomendable establecer si ésta es adecuada para el proceso. El sistema del doble híbrido tiene restricciones que impiden que algunas proteínas funcionen adecuadamente, por ejemplo, aquellas que tienen dominios transmembranales podrían tener dificultades al momento de la translocación al núcleo, o bien, puede ser que no se genere el plegamiento adecuado de la proteína. Objetivo general El alumno aprenderá a utilizar el sistema de doble híbrido en la levadura Saccharomyces cerevisiae como una herramienta para el análisis de posibles interacciones entre proteínas.
  21. 21. Manualdebiotecnología|práctica3 22 Objetivos específicos • El alumno aprenderá a transformar a la levadura S. cerevisiae. • El alumno podrá discriminar si dos proteínas interactúan o no mediante el ensayo genético del doble híbrido. Material y equipo Material Equipo 1 mechero Vórtex Puntas estériles blancas, azules y amarillas Incubadora a 30°C 3 tubos eppendorf estériles de 1.5 ml Incubadora a 42°C Agua destilada, estéril Microcentrífuga * 1 masking tape Micropipetas de 1,000 ml, 200 ml y 20 ml * 1 encendedor Espectrofotómetro * 1 marcador indeleble Centrífuga * 1 asa de vidrio o 3 pipetas pasteur de tallo largo Termomixer * Cajas petri estériles * Palillos de dientes estériles Hielo Tubos para centrífuga, estériles Reactivos elaborados previamente por el profesor Medio YPD Medio SD + Leu Medio SGal + Leu + XGal Medio SGal + rafinosa Solución PEG/acetato de litio/TE DMSO * Material que deberán traer los alumnos. Material biológico: 150 ml de células competentes de Saccharomyces cerevisiae EGY48 150 ml de DNA de esperma de salmón (10 mg/ml) Plásmidos: • 1 mg de pEG202+Gpa1 • 500 ng de pJG4-5+Ste4 • 500ng de pJG4-5+endoquitinasa • 1 mg de pSH18-34 Cepas, plásmidos, soluciones y medios. 1. Saccharomyces cerevisiae EGY48 (Matα,trp1, his3, ura3,6, LexAop-Leu2) 2. Los tres plásmidos empleados son multicopia, contienen orígenes de replicación de E. coli (pBR ori) y de levadura (2m) y tienen el marcador selectivo AmpR para bacterias.
  22. 22. Transformacióndelevadurayensayodedoblehíbrido|práctica3 23 a. El plásmido pEG202 contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (Adh1) y se utiliza para la expresión de las proteínas fusionadas a LexA. El sitio múltiple de clona- ción se localiza río arriba del terminador Adh1 y el marcador selectivo para levadura es His3 (figura A). b. El plásmido pJG4-5 contiene el promotor inducible Gal1 y los sitios únicos EcoRI y XhoI para obtener una fusión con la secuencia de localización nuclear de SV40 (NLS), el dominio B42 (activador de la transcripción) y la etiqueta de hemaglutinina (HA). El marcador selectivo es Trp1 (figura B). c. El plásmido pSH18-34 contiene un sitio de unión a LexA seguido del gen reportero lacZ de E. coli. Ura3 es el marcador selectivo para levadura. Metodología Parte I. Protocolo para transformar levadura 1. Inocular 5 ml de YPD con la cepa EGY48 de Saccharomyces cerevisiae y dejarlo creciendo toda la noche a 30°C y 250 rpm (profesor). 2. Al día siguiente, inocular 30 ml de YPD nuevo con aproximadamente 1 ml del cultivo de la noche anterior. Medir la densidad óptica (do) inicial a 600 nm. Incubar a la misma tempe- ratura y rpm. 3. Medir la do y sacar el cultivo cuando llegue a una do (600 nm) de 0.5-0.6 (aproximada- mente 1 x 107 células/ml). 4. Centrifugar 5 min a 2 500 rpm, eliminar el sobrenadante y agregar un volumen igual de agua destilada estéril. Resuspender en el vórtex. 5. Volver a centrifugar igual que en 4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de agua. Resuspender en el vórtex y pasar las células a un tubo de 1.5 ml estéril. 6. Centrifugar en la microfuga 5 seg a máxima velocidad. 7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de TE/acetato de litio 1X (prepa- rado fresco a partir de TE 10X y acetato de litio 10X) 8. Centrifugar igual que en el paso 6, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 300 ml de TE/acetato de litio. 9. En un tubo eppendorf limpio, colocar 50 ml de células y agregar 50 mg de dna de esperma de salmón sonicado y hervido. Repetir el proceso con otros dos tubos. Marcar los tubos con números (1, 2 y 3). 10. Preparar los tubos de la siguiente manera: Tubo 1: agregar 500 ng del plásmido pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5+Ste4 y 500 ng de pSH18-34. Tubo 2: agregar 500 ng de pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5 + endoquitinasa y 500 ng de pSH18. Tubo 3: no agregar plásmidos. 11. Agregar 300 ml de PEG40%/Litio/TE (preparado fresco con 1 vol de TE 10X, 1 vol de acetato de litio 10X y 8 vol de PEG4000 al 50%). 12. Mezclar en el vórtex e incubar 30 min a 30°C 13. Agregar 40 ml de DMSO, mezclar en el vórtex 14. Dar un choque de calor a 42°C por 15 min. Meter en hielo. 15. Centrifugar durante 5 segundos, eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 100 ml de agua con ayuda del vórtex.
  23. 23. Manualdebiotecnología|práctica3 24 16. Plaquear las células de cada tubo en medio SD+leucina e incubar a 30°C por dos días. Transcurrido este tiempo, debe observarse el crecimiento de las colonias. Parte II. Ensayo de doble híbrido 1. Una vez que hayan crecido las colonias de levaduras transformadas, sembrar 5 o 6 colo- nias de las cajas 1 y 2 en medio SGal + leucina pH 7.0, en el cual previamente se plaquea- ron 50 ml de X-Gal. Para sembrar las transformantes se emplean palillos planos estériles, tomando una sola colonia cada vez. 2. Incubar la caja a 30°C por 2 días. Resultados 1. Transformación de levadura: anotar y explicar por qué hubo crecimiento o no en cada una de las tres cajas. 2. Doble híbrido: anotar si las transformantes obtenidas generaron un color azul o no en el medio SGal + X-Gal + leucina. ¿Cómo interpretas los resultados obtenidos? Plásmidos utilizados Crecimiento en medio SD + Leu Coloración en medio SGal + Leu (pH7) + XGal pEG202 + GpaI pJG4-5 + Ste4 pSH18-34 pEG202 + GpaI pJG4-5 + endoquitinasa pSH18-34 Sin plásmidos Cuestionario 1. ¿Por qué crees que es importante sembrar las transformantes en un medio que sólo con- tiene leucina? 2. ¿Cuáles son las diferencias entre un medio selectivo y un medio completo? ¿Qué crees que hubiera pasado si hubieras sembrado tus transformantes en un medio completo? 3. ¿En qué consiste el ensayo de doble híbrido y para qué sirve? Menciona un ejemplo. 4. ¿Cuál es la función del gen reportero lacZ? 5. ¿Para qué sirve el compuesto X-Gal? ¿Qué pasaría si olvidaras adicionar este compuesto a tus cajas de SGal + Leu?
  24. 24. Transformacióndelevadurayensayodedoblehíbrido|práctica3 25 Bibliografía Adams, A., D.E. Gottschling, C.A. Kaiser y T. Stearns, (1997), Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Fields, S. y O. Song (1989), “A novel genetic system to detect protein-protein interactions”, Na- ture 340: 245-246. Fields, S. y R. Sternglanz (1994), “The two-hybrid system: an assay for protein-protein interac- tions”, Trends in Genetics 10: 286-292. Guthrie, C. y G.R. Fink (1991), “Guide to yeast genetics and molecular biology”, Methods in En- zymology, vol. 194. Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989), Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mapas de los plásmidos empleados en la práctica Figura A. pEG202: plásmido para la fusión a LexA.
  25. 25. Manualdebiotecnología|práctica3 26 Figura B. pJG4-5: plásmido para la fusión al dominio de activación de la transcripción. NLS HA TagB42 domain Fusion cassette ATG GGT GCT CCT CCA AAA AAG AAG … CCC GAA TTC GGC CGA CTC GAG AAG CTT … M G A P P K K K … P E F G R L E K L … EcoRI XhoI Figura C. Plásmido pSH18-34: plásmido con el gen reportero lacZ.
  26. 26. 27 Extracción de dna e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses Práctica 4 Introducción En el campo de las ciencias sociales, la antropología estudia el origen del hombre. Esta discipli- na integra los descubrimientos de otras ciencias, como la sociología, la economía, la historia, la psicología y la biología. La antropología ha sido subdividida en áreas especializadas entre las que está la antropología física o biológica, que estudia la evolución y biología de las poblacio- nes humanas. Tradicionalmente, antes del nacimiento de un bebé se tiene la expectativa de cuál será su sexo. La identificación del género es importante en muchos aspectos biológicos y sociales en la vida de una persona. Por otra parte, uno de los primeros registros que se realiza en ex- cavaciones arqueológicas es la identificación del sexo en restos humanos; este dato es fun- damental para reconstruir el contexto arqueológico con la finalidad de entender a) aspectos culturales en las poblaciones antiguas, por ejemplo, la participación del hombre y la mujer en las sociedades prehistóricas, la interpretación de artefactos y arte prehistóricos, la selección de víctimas en casos de infanticidio, etc., y b) la historia evolutiva humana relacionada con de- mografía, relaciones de parentesco entre individuos recuperados del mismo entierro, etcétera. Distintos métodos morfológicos permiten identificar el sexo en restos de esqueletos hu- manos de adultos. Para este análisis la pelvis es considerada el hueso ideal, ya que permite identificar el sexo con un índice de certeza de aproximadamente 95%. Sin embargo, la identi- ficación mediante análisis morfométrico resulta incierta o imprecisa en restos óseos de niños y preadolescentes debido a la ausencia de dimorfismo sexual, o en restos incompletos de ado- lescentes y adultos. En estos casos el método molecular, basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es la herramienta idónea para la identificación del sexo en los restos óseos incompletos. Esta identificación por análisis molecular también es utilizada con frecuencia en antropología forense. La amelogenina es una proteína del esmalte dental. En los humanos hay dos genes que la codifican, éstos se localizan en los cromosomas Y y X y fueron secuenciados en su totalidad en 1991. Existen varias técnicas de PCR que se basan en la amplificación de la amelogenina para identificar el sexo, las cuales funcionan adecuadamente en muestras forenses, individuos modernos y restos arqueológicos. Así, recientemente el grupo de investigación en antropolo- gía molecular del laboratorio de bioquímica de la Facultad de Ciencias de la unam, propuso un método que se basa en la amplificación del intrón 1 del gen de la amelogenina para identificar el sexo en restos óseos humanos. El método utiliza dos primers específicos para las secuencias de los alelos de la amelogenina en los cromosomas Y y X y un primer común a ambos alelos; el tamaño de los productos de amplificación es diferente en los dos alelos. El sexo masculino se identifica por la presencia del producto que proviene del cromosoma Y, mientras que el feme- nino se identifica por su ausencia. Las reacciones de amplificación por PCR fueron optimizadas
  27. 27. Manualdebiotecnología|práctica4 28 y establecidas con dna humano moderno, por lo que este método funciona adecuadamente para analizar dna contemporáneo y antiguo. Los productos de PCR son detectados directa- mente en electroforesis en gel de agarosa y/o poliacrilamida. Objetivo general Identificar el sexo en los alumnos que cursan la materia de biotecnología con la finalidad de que aprendan tres metodologías básicas en el área de la biología molecular. Objetivos específicos 1. Con el método de extracción de dna el alumno conocerá las características reque- ridas para obtener y manipular la muestra biológica de mucosa bucal y adquirirá la capacidad para extraer dna de ésta. 2. Con el método de PCR el alumno amplificará las regiones específicas del gen de la amelogenina de los cromosomas X y Y para identificar el sexo en humanos, lo cual le permitirá entrenarse en una técnica ampliamente utilizada en la antropología mo- lecular y la biología. 3. Con la técnica de electroforesis en gel de agarosa el alumno aprenderá a visualizar el ex- tracto de dna y los productos de amplificación de PCR.También aprenderá a cuantificar dna por comparación con un marcador de tamaño molecular. La electroforesis en gel es una herramienta que se realiza de manera rutinaria en la investigación científica. Material y equipo Material Equipo Tubos de 1.5 ml y de PCR de 0.2 ml Baño a 56°C Hisopos estériles Vórtex Micropipetas de 0.2–1ml y de 0.05 - 0.1 ml Baño a ebullición Microfuga Cámara de electroforesis Soluciones 1. PBS 20X 2. 200ml de cloro al 30% 3. Solución de lisis 4. Primers (200 ng c/u) 5. dNTPs (200 mM) 6. Buffer c/MgCl2 (1X) 7. Agua inyectable 8. Taq DNA polimerasa (1U) 9. GelRed 10. Agarosa 11. TAE 50X 12. Marcador de peso molecular para DNA
  28. 28. Extraccióndeadneidentificacióndelsexoenhumanos:suimportanciaenlascienciasantropológicasyforenses|práctica4 29 Metodología La práctica se lleva a cabo en tres módulos: I) Extracción de dna de las muestras II) Amplificación del dna III) Electroforesis en geles de agarosa MÓDULO I. Extracción de dna Obtención de células 1. Hacer un raspado de mucosa bucal con un hisopo de algodón estéril, raspar 30 veces la parte interna de cada mejilla para obtener las células. 2. Colocar el hisopo en un tubo de 1.5 ml, añadir 1 ml de buffer PBS, enjuagar el hisopo en el fondo y contra las paredes del tubo. 3. Colocar el hisopo en una solución de cloro (blanqueador para ropa) al 30% para des- cartarlo. Extracción de dna • Transferir las células/PBS a tubos de 1.5 ml y centrifugar a 14 000 rpm durante 1 min. • Descartar el sobrenadante y resuspender en 150 µL de solución de lisis. Resuspender con cuidado utilizando la micropipeta. • Incubar a 56°C x 15 minutos. • Enfriar a temperatura ambiente por 30 segundos. • Agitar durante 15 segundos. • Calentar en baño a ebullición por 10 minutos. • Enfriar a temperatura ambiente por 2 minutos. • Agitar vigorosamente por 2 minutos. • Centrifugar a 14 000 rpm durante 2 minutos • Obtener el sobrenadante y transferirlo a un tubo limpio de 1.5 ml. • Guardar en hielo o a –20 0 C. Visualizar y cuantificar de manera aproximada en un gel de agarosa 1%/TAE MÓDULO II. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1. Marcar tubos de pared delgada de 0.2 o 0.5 ml de acuerdo con el termociclador que se utilizará. 2. Poner en cada tubo: Reactivo Mezcla de reacción Concentración final Agua cbp ajustar a 25 µl Amortiguador 10X 2.5 µl 1X MgCl2 25 mM 2.5 µl 2.5 mM dNTP´s 1.25 mM 2.0 µl 0.1 mM BSA 2.5 µg/l 0.5 µl 1.25 µg/µl Primer COM 5 µM 1.0 µl 0.2 µM Primer XSP 5 µM 0.5 µl 0.1 µM Primer YSP 5 µM 0.5 µl 0.1 µM
  29. 29. Manualdebiotecnología|práctica4 30 dna 10 - 20ng 1 - 3 µl Taq dna polimerasa 1 U 3. Agregar una gota de aceite mineral en caso de que el tipo de termociclador lo requiera. 4. Colocar los tubos en el termociclador y programar: Desnaturalización inicial: 94°C por 5 minutos 94°C por 30 segundos 40 ciclos { 57 °C por 30 segundos 72 °C por 1 minuto Extensión final: 72 °C por 7 minutos Guardar a 4 °C MÓDULO III. Electroforesis en gel de agarosa Preparación del gel de agarosa 1. a) Para dna genómico (agarosa al 1%): Pesar 0.3 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X. 1. b) Para productos de PCR (agarosa al 2.5%): Pesar 0.75 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X. 2. Calentar la agarosa en un horno de microondas por aproximadamente 1 minuto hasta que se disuelva completamente. Evitar que hierva, para lo cual se detendrá el horno cada vez que sea necesario. 3. Enfriar la agarosa aproximadamente a 50 °C. 4. En una superficie plana nivelada colocar la base acrílica que soportará el gel y colocar el peine para hacer los pozos 5. Vaciar la solución de agarosa evitando la formación de burbujas. 6. Dejar el gel solidificando a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minu- tos. El gel polimerizado tiene una apariencia opaca. Preparación de la cámara de electroforesis y las muestras (extracto de dna y los productos de PCR) 1. Colocar el gel dentro de la cámara de electroforesis. 2. Añadir TAE 1X hasta cubrir completamente el gel. 3. Preparar las muestras de la siguiente forma: a) Tomar 5 µl de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm, agregar 1µl de GelRed para monitorear la movilidad electroforética y para visualizar en UV. Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación. b) Colocar cuidadosamente ~6 µl de muestra en cada pozo utilizando la micropi- peta de 10 µl. Poner todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra del marcador de tamaño molecular. c) Conectar la cámara de electroforesis, el cable y la fuente de poder. Unir los electrodos positivos (rojos) y por separado los negativos (negros) entre la cá- mara, el cable y la fuente de poder.
  30. 30. Extraccióndeadneidentificacióndelsexoenhumanos:suimportanciaenlascienciasantropológicasyforenses|práctica4 31 d) Encender la fuente de poder y seleccionar el voltaje en 100 voltios. Cuando el equipo funciona correctamente se producen burbujas que son visibles. Las muestras de DNA deben dirigirse hacia el electrodo positivo. e) Desplazar las muestras tres cuartos del tamaño del gel. f) Apagar la cámara de electroforesis para detener el desplazamiento de las muestras. Resultados Visualización del dna • El extracto de dna y los productos de PCR en el gel de agarosa se observarán con una lám- para de luz UV o sobre un transiluminador. El tamaño de los fragmentos amplificados es de 192 pb en el cromosoma X y de 158 pb para el cromosoma Y. • Tomar un registro fotográfico del gel con una cámara digital. Agradecimientos Se agradece al Dr. Alfonso Torre-Blanco del Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Cien- cias por su participación. Este método fue diseñado como parte de un proyecto apoyado por papiit, unam y por el CONACyT. Bibliografía De la Cruz, I., A. González-Oliver, B.M. Kemp, J.A. Román, D.G. Smith, y A. Torre-Blanco (2008), “Sex identification of children sacrificed to the ancient Aztec rain gods in Tlatelolco”, Cu- rrent Anthropology 49: 519-526. Brown, K.A. (2001), “Identifying the sex of human remains by ancient DNA analysis”, Ancient Biomolecules 3:215-225. Jurmain, R., L. Kilgore, W. Trevathan y H. Nelson (2003), Introduction to physical anthropology, 9 ed., Thomson, Wadsworth, Canada, 522 p.
  31. 31. 33 Sesión de Bioinformática Bases de datos y herramientas bioinformáticas Práctica 5 ¿Qué es la bioinformática? La bioinformática es el campo científico que integra a la biología, las ciencias computacionales y la tecnología de la información en una disciplina única. Al inicio de la “revolución genómica” la bioinformática se entendió como la creación y mantenimiento de bases de datos en las cua- les se guardara información biológica tales como secuencias de nucleótidos (genes, secuen- cias reguladoras, etc.) y de aminoácidos (proteínas). Conforme estas bases de datos fueron creciendo, fue necesario desarrollar nuevas inter- fases entre los remitentes de secuencias y los usuarios de tales bases. De esta manera, las bases de datos iniciales –Pir (Protein Information Resource) y GenBank– fueron ampliando sus recursos informáticos para incluir programas de búsqueda y comparación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, traducción de secuencias de nucleótidos a aminoácidos o búsque- da de señales estructurales o funcionales en las secuencias. Así, para el resguardo y análisis de las bases de datos de dna, a principios de 1980 se crea el Centro Nacional de Información Biotecnológica (Ncbi, por sus siglas en inglés), dependiente de los institutos nacionales de salud en Bethesda, Maryland, Estados Unidos, la Biblioteca de Datos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (Embl) y el Banco de Datos de dna en Japón (DDBJ). Por su parte, las se- cuencias de proteínas fueron depositadas en la base de datos Pir y, más recientemente, en la base de datos Protein DataBank (Pdb). Como se mencionó anteriormente, todas estas bases de datos cuentan con recursos bioinformáticos muy amplios con los cuales se pueden llevar a cabo múltiples análisis de las secuencias. Con el desarrollo de la Red Internacional –internet–, todas estas bases de datos han sido puestas a disposición de todo el público de manera gratuita a través de diferentes páginas Web. ¿Qué es el ncbi? Establecido en 1988 como un recurso computacional para el manejo de información en bio- logía molecular, el Centro Nacional de Información Biotecnológica (ncbi) crea bases de datos públicas de dna, conduce investigación en biología computacional, desarrolla herramientas de software para análisis de datos genómicos y disemina información biomédica para inves- tigación básica y clínica. Además de Ncbi y sus Bases de Datos asociadas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), exis- ten otras Bases de Datos tales como embl/Ebi del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (http://www.ebi.ac.uk/embl), el dna Databank de Japón (ddbj; http://www.ddbj.nig.ac.jp) y Ensembl, que es un proyecto conjunto del embl/ebi y el Instituto Sanger de Inglaterra (http:// www.ensembl.org). Todas estas bases de datos cuentan con múltiples recursos bioinformá- ticos para la recuperación, comparación y análisis de secuencias de nucleótidos y proteínas.
  32. 32. Manualdebiotecnología|práctica4 34 Objetivos • Presentar al alumno los conceptos básicos y las herramientas computacionales en el campo de la bioinformática. • Formalizar lo anterior mediante un ejemplo de búsqueda, recuperación y análisis de se- cuencias de genes y proteínas. Metodología 1. Recuperación de secuencias En esta sesión de bioinformática se accederá a la base de datos del ncbi, se hará una búsqueda de una secuencia determinada y se utilizarán algunas de las herramientas computacionales que el ncbi pone a disposición de la comunidad académica mundial. Nota: Las bases de datos no sólo incrementan constantemente sus contenidos, sino que también varía el diseño de las páginas, sin embargo, siempre será posible llevar a cabo el ejercicio propuesto, mediante una búsqueda cuidadosa en toda la página. Para recuperar una secuencia de un gen o una proteína, la nomenclatura aceptada en las ba- ses de datos señala lo siguiente: • Se puede buscar la secuencia del gen o de la proteína señalando las tres primeras letras del nombre o identificador en inglés; de esta manera, si se pretende recuperar la secuencia del gen de la insulina teclear Ins, mientras que para una deshidrogenasa teclear Deh. • Si el identificador de la proteína cuenta con dos o más palabras, teclear las iniciales de dichas palabras; así, para recuperar la secuencia de la Heat Shock Protein teclear Hsp. Nota: Se pueden utilizar indistintamente mayúsculas y minúsculas en la escritura del identificador. Para entrar en la base de datos del ncbi teclear la siguiente dirección: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov> y aparecerá la página de presentación del sitio:
  33. 33. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 35 Como se muestra, la página contiene el localizador Search (búsqueda) y una ventana en la que aparecen diversas bases de datos; al seleccionar Nucleotides (nucleótidos) se está escogiendo una base de datos específica y en la ventana del localizador escribir el nombre del gen que se desea recuperar; en este caso, el del gen codificante de la proteína de choque térmico Hsp10. El programa de búsqueda generará un reporte de todas las entradas que existen en la base de datos en las que aparece el registro Hsp10: This search in Gene shows 164 results, including: hsp10 (Arthroderma benhamiae CBS 112371): mitochondrial heat shock protein Hsp10 HSP10 (Bifidobacterium bifidum PRL2010): 10 kDa chaperonin GROES hsp10 Hsp10hsp10 (Salmo salar): heat shock protein 10 Por otra parte, si se quiere restringir la búsqueda al gen que codifica a la proteína Hsp10 hu- mana, habrá que escribir Hsp10 human. De esta manera el programa de búsqueda recuperará la secuencia deseada: This search in Gene shows 4 results, including: HSPE1 (Homo sapiens): heat shock 10kDa protein 1 (chaperonin 10) HSPD1 (Homo sapiens): heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) Hspd1 (Mus musculus): heat shock protein 1 (chaperonin) Al seleccionar la primera entrada de la lista de secuencias correspondiente a Hsp10 human se obtendrán muchos descriptores. Explóralos y busca en el apartado de regiones genómicas, transcritos y productos, en donde dice GenBank, para obtener la secuencia genómica de nu- cleótidos del gen Hsp10 a partir de la Base de Datos Genbank: ORIGIN 1 acccgcgcag ggtgtgctag cgcgctcagc cctctccggc cggcttagtc tagttcccgg 61 gcctcgctcg gttccagaac tttccagaaa atgccgcgct ccctacggct caagggtcaa 121 atcgcgtcat ttccgggagg ggacgaaggg gtagttcttt cacctcggct gggcgcctag 181 aaaagcctag aaacagctcc ttttttcttc cgcctccgag tcttcgcgtc agcgtcctgc 241 gcagggccct tggggcgaat cgcggtgcgc gtcggggcga ccgccctccc tccctgggag 301 gggcgagggg gctagcggcg accgctgggg cgagcgcgcc tgcgcgctgg gtgatttttt 361 cacgtgtcgc cagggccgga ctgcgagtct ctttgcggcg ctacactaga gcagagtacg 421 agtctgaggc ggagggagta atggtgagtc ccgcgtggcc ccgaggcctg caggcccggg 481 cctgtctgag gcgtacgggg atccctgacg cccctctttt gttgggctgg gcgggaggga 541 ttggtggcca ctcagtgacc agcgcccgat ggcaccttgg agcggcaagg cccgcccgac 601 ccttttctcc cccagggctc tttgcacgcg cgtgtgctgc cggtgtgtaa ggcagggggg 661 cgagaacccg ggcgcacgcg cagcgtctca cctgcttctg cagggccttt gtggatgtgt 721 aatatcttgg gtaaaaatca tggtgccagg cagggagctt gacccagcgt ttcctgaaaa 781 tttctggaaa aacctgaaga aggaaaacat ttgaccttgg aataaactaa ggttgacctt 841 aaagctggtc tggttgctca ccggaggagc gacaacgacc cctaacagac gtaaggaatc 901 gggaattaaa cttggaatat tggttagtac attcaaatgc gcttccttaa cgaataagct 961 gaggtttggt gttaactttc aaagccaaaa cgtgttgaga tgtatagcac ggtggcgttg 1021 cctgttgata atgtgattac atttagtttt tgtttcaaaa catttctctt cctacaggca 1081 ggacaagcgt ttagaaagtt tcttccactc tttgaccgag tattggttga aaggagtgct 1141 gctgaaactg taaccaaagg aggcattatg cttccagaaa aatctcaagg aaaagtattg 1201 caagcaacag tagtcgctgt tggatcgggt tctaaaggaa aggtaaatgg gagctgcagt 1261 ggaactattt tttatagtgt gcagtggagg gaaaagaagt aattctggag tattaaaagt 1321 cgcttattaa gtagagttta tgtcgttttc aagatcatta actgctttgg ttctaatctg 1381 tttcttaaag ggaaatgact aatataaagt tgcttatttt atatgaccaa tgctatgatg 1441 cttattttat gtgatagttt cagagtatta aaaattgtcc tcaataggcc gggtgcggtg
  34. 34. Manualdebiotecnología|práctica4 36 1501 gctctcgcct gtaatctcag cactttggga ggccgaggtg tgcggatcac aaggtcagga 1561 gttcaagacc agcctgacca acatggtgaa accccgtctc tactaaagat acaaaaatta 1621 gccgggtgtg gtggcatgcg cctgtaatcc cagctactgg ggaggctgag gcaggagaat 1681 catttgaacc ctggaggcgg aggttgcaag gagccgaggt tgcaaggcgc ccctgcattc 1741 cagtatgggg gacagggcga gattctgtct caaaaaaaaa aaaaaaaaat cccctcaata 1801 gcaatttggt agcctagtgt gatcagtgtt tgccttacat tctaaatttt taataagaca 1861 aaagaggctg tgcgtggtgg ctcacacctg taatccttgc attttgggag gccaaagcag 1921 gaggatcgtt tgagctcagg attcaaaatc aggagttcaa aatcagtctg ggcaacataa 1981 tgagacctcc tgtctacaaa ataaataaat acaaaagatg tgcttcaagg taaaatgagg 2041 gggcatttaa gaattgagag gaaacttgga ctgttcgttt aacccctaac acattgaaat 2101 tgccctaatc ttaaccagtt ggtatacctg gttgtatacc taccagagga acaggttggt 2161 cagtcttgtc caatctgcag cctgggacag ctctgaatgc cgcctaacgc aaatccctaa 2221 actttcttaa aacctgatat ttcttttgca atttttttta agcttaccag ctactgctaa 2281 tgttagtgta ttttatgtgt ggcccaacac agttcttcca gtgtggccca gggaagccaa 2341 aagattgcac acctctgttt tagatgttcc tcagttaatt gtttaggcct cgggcttcta 2401 aagatctcag ccaaaataca cagtaaacgc cgttggggcc aaataatgtt aactgcattg 2461 ttctagttgc ttctgaggag gaaagctcta ctgaggagct gtcatggagt taggaatagg 2521 aagactttgg ggagtggaca cttagctgca gtccctttcc ccaaatctgt tctttggagg 2581 gaacaaaaca atcacaagag tatgttctaa atccaaaaaa actttaaatt tttgtatgtt 2641 gaaagaagga aaatatgacc atttgtatat ggcattttct gggtgctggc tactgttgca 2701 ggtttatttc atatagttga taagttatgt taatatttaa cagttataaa gttagcttta 2761 gttaactaaa gttagctttt ccagaatatt ttcttgaact tttacgttgg agtcaggttt 2821 tagtttaagc cactgtgtat tatttcaaag tgtaactaca gtggtatttt tgagtgaaga 2881 tctgtaattc tagtatgagt cgtatcactt agccacgaaa tatattttta atataattgg 2941 atttgagtga ccatgtttca ttagttgtag tgatttaaaa gttaactgtt tatgttgggt 3001 gaactagata tctttgctaa taaacatcct tcctttttta agggtggaga gattcaacca 3061 gttagcgtga aagttggaga taaagttctt ctcccagaat atggaggcac caaagtagtt 3121 ctagatgaca aggtgtgtaa acttaataat tctaaaaaga agtcagatat ttgcaattag 3181 ttgtcttaac taatggtttt tttcacttgc aggattattt cctatttaga gatggtgaca 3241 ttcttggaaa gtacgtagac tgaaataagt cactattgaa atggcatcaa catgatgctg 3301 cccattccac tgaagttctg aaatctttcg tcatgtaaat aatttccata tttctctttt 3361 ataataaact aatgataact aatgacatcc agtgtctcca aaattgtttc cttgtactga 3421 tataaacact tccaaataaa aatatgtaaa tgagtggtta atcttta // Como se puede observar, la secuencia contiene una numeración que facilita la búsqueda de una subsecuencia particular. De igual forma se puede recuperar, dando clic en transcript, la secuencia del rna mensajero del gen, y en este caso, la secuencia “NM_002157.2” recuperada solamente muestra los exones que conforman el rna mensajero maduro: /gene=”HSPE1” HSPE1/RNAm ORIGIN 1 acccgcgcag ggtgtgctag cgcgctcagc cctctccggc cggcttagtc tagttcccgg 61 gcctcgctcg gttccagaac tttccagaaa atgccgcgct ccctacggct caagggtcaa 121 atcgcgtcat ttccgggagg ggacgaaggg gtagttcttt cacctcggct gggcgcctag 181 aaaagcctag aaacagctcc ttttttcttc cgcctccgag tcttcgcgtc agcgtcctgc 241 gcagggccct tggggcgaat cgcggtgcgc gtcggggcga ccgccctccc tccctgggag 301 gggcgagggg gctagcggcg accgctgggg cgagcgcgcc tgcgcgctgg gtgatttttt 361 cacgtgtcgc cagggccgga ctgcgagtct ctttgcggcg ctacactaga gcagagtacg 421 agtctgaggc ggagggagta atggcaggac aagcgtttag aaagtttctt ccactctttg 481 accgagtatt ggttgaaagg agtgctgctg aaactgtaac caaaggaggc attatgcttc 541 cagaaaaatc tcaaggaaaa gtattgcaag caacagtagt cgctgttgga tcgggttcta 601 aaggaaaggg tggagagatt caaccagtta gcgtgaaagt tggagataaa gttcttctcc 661 cagaatatgg aggcaccaaa gtagttctag atgacaagga ttatttccta tttagagatg 721 gtgacattct tggaaagtac gtagactgaa ataagtcact attgaaatgg catcaacatg 781 atgctgccca ttccactgaa gttctgaaat ctttcgtcat gtaaataatt tccatatttc
  35. 35. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 37 841 tcttttataa taaactaatg ataactaatg acatccagtg tctccaaaat tgtttccttg 901 tactgatata aacacttcca aataaaaata tgtaaatgag tggttaatct ttaaaaaaaa 961 aaaaa // Con la secuencia del gen, ya sea en forma de secuencia completa con intrones o en la forma de rna mensajero, se iniciará una búsqueda de secuencias relacionadas en otros genomas, con la finalidad de explorar el grado de divergencia de ambas secuencias o de comparar la presencia de inserciones o deleciones de nucleótidos a lo largo de la evolución de ambas secuencias a partir de un ancestro común. Para esto el Ncbi cuenta con un programa de comparación de secuencias denominado blast (Basic Local Alignment Search Tool o Herramienta Básica de Bús- queda por Alineamiento Local). Este algoritmo está basado en la comparación de similitudes de nucleótidos o aminoácidos entre secciones cortas (locales) de la secuencia de búsqueda (query) y cada una de las secuencias de la base de datos; para proteínas, la longitud de las se- cuencias comparadas es de tres aminoácidos y para nucleótidos la longitud mínima es de 11. Cuando el algoritmo encuentra regiones idénticas o similares, amplía la búsqueda en regiones contiguas, extendiendo el alineamiento hasta que ya no encuentre identidades o similitudes y evaluando el grado de sustituciones o de inserciones y deleciones de nucleótidos o aminoáci- dos entre las secuencias. Al seleccionar en la página de entrada la opción blast, aparecerá una ventana con la siguiente información: En esta página se selecciona nucleotide blast para realizar la búsqueda con una secuencia de nucleótidos. Aparecerá una ventana en la que se inserta la secuencia del mRna obtenida anterior- mente. Más abajo, en selección de programa, conviene seleccionar blastn (somewhat similar sequences [blast n]) para permitir una búsqueda amplia. Entre los parámetros opcionales más importantes del algoritmo figuran: Expect threshold: Número de secuencias que pueden ser encontradas al azar (Valor de Expect con elevada significación estadística: 0.000001 = (1 x 10-6 )). Word Size: La longitud de la secuencia que comienza el alineamiento entre secuencias relacionadas.
  36. 36. Manualdebiotecnología|práctica4 38 Filter: Elimina secuencias con baja complejidad composicional, por ejemplo: AAAAAAAAAA….., TATATATATAT…., AGAGAGAGAG…. Pulsar la tecla Blast, con lo cual el programa buscará en la bases de datos las secuencias que muestren identidad total o parcial, según se mencionó antes. El resultado de la búsqueda aparecerá en el siguiente formato: Las barras horizontales indican las secuencias con mayor índice de similitud con la secuencia de búsqueda, expresado esto como el valor de Score (puntuación), que va en decremento des- de la línea superior a la inferior en función de los valores de puntuación señalados: < 40 hasta > 200. Al colocar el cursor sobre una línea determinada aparecerá en la pantalla la secuencia correspondiente. Si en vez de hacer el Blast contra todos los genomas, se selecciona en la ventana previa sólo la base de datos de humano, se puede obtener una visión cromosómica de las ubicacio- nes de las secuencias obtenidas con la opción Human genome view y el programa desplegará una pantalla mostrando las ubicaciones de las secuencias recuperadas por cromosoma, tal como se observa en la siguiente ventana:
  37. 37. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 39 Chromosome view hsp10 human 2. Comparación de secuencias La base de datos del ncbi también da la opción de llevar a cabo búsquedas de secuencias relacionadas con la de interés en muy diversos genomas totalmente secuenciados, tanto pro- cariontes como eucariontes, lo que permite hacer comparaciones evolutivas y construir re- laciones filogenéticas entre diversos organismos. Un ejemplo de lo anterior lo representa la recuperación de la secuencia homóloga del gen de Hsp10 humano en el genoma del chim- pancé; en la pantalla siguiente se muestra el formato de la ventana configurada en la opción Blast (Blast Home), listando una pequeña muestra de los genomas secuenciados hasta la fe- cha con la opción Blast Assembled RefSeq Genomes: BLAST Assembled Genomes Choose species genome to search or list all Genomic BLAST databases Human Mouse Rat Arabidopsis thaliana Oryza sativa Bos taurus Danio rerio Drosophila melanogaster Gallus gallus Pan troglodytes Microbes Apis mellifera También con la opción list all Genomic Blast databases se tendrá acceso a las bases de datos de todos los genomas secuenciados hasta la fecha. Si se selecciona el genoma del chimpancé (Pan troglodytes) para buscar en él la secuencia del gen de interés, -Hsp10-, y se repite el procedimiento anterior de copiar y pegar la secuencia
  38. 38. Manualdebiotecnología|práctica4 40 de Hsp10 en el cuadro en blanco de la pantalla Blast y se pulsa la opción Begin Search (comen- zar la búsqueda), el programa dará por resultado un alineamiento pareado entre la secuencia del gen de Hsp10 humano y las secuencias homólogas de Hsp10 en el genoma del chimpancé. La primera entrada corresponde al gen tal como se muestra en el siguiente recuadro: Se puede observar que el programa indica el porcentaje de identidad registrado entre las dos secuencias –en este caso de 93%–, el valor de Expect, probabilidad de alineamientos al azar entre dos secuencias no relacionadas, que en este caso es del orden de 1 x 10-6 y en donde no hay línea, las sustituciones que han ocurrido en estas proteínas desde el tiempo de divergen- cia entre las dos especies. Para el caso de recuperar y comparar secuencias de aminoácidos, un recurso bioinformá- tico muy útil es UniProt, el cual es una base de datos combinada de tres depositorios inter- nacionales de secuencias de proteínas, PIR, SwissProt y TrEMBL; el sitio Web es <http://www. uniprot.org/>. Al entrar a la base de datos de UniProt y teclear el comando Hsp10 human en la casilla de búsqueda (QUERY), se obtendrá el siguiente resultado:
  39. 39. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 41 La primera entrada corresponde a la proteína de humano. Al dar un “clic” en esa entrada se obtiene toda la información disponible sobre dicha proteina, incluyendo la secuencia de ami- noácidos: Esta secuencia corresponde a la de 102 aminoácidos de Hsp10; una vez recuperada, la secuen- cia se copia en formato FASTA y se lleva a cabo una nueva búsqueda de su secuencia homóloga en diversos organismos, de manera similar a como se realizó con la secuencia del gen. La base de datos de UniProt también cuenta con el recurso bioinformático del blast, así que se puede conducir una búsqueda entre secuencias de proteínas utilizando el algoritmo blast. El programa realiza búsquedas de similitud entre proteínas de todos los organismos que están en las bases de datos. En el siguiente ejemplo, la búsqueda mediante blast produjo los alineamientos entre las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de diversas especies, saliendo primero los de mamífero; se muestra el ejemplo del alineamiento de la secuencia de Hsp10 humana con la secuencia de Hsp10 de cerdo, Q6WSP6:
  40. 40. Manualdebiotecnología|práctica4 42 En este ejemplo, el programa blast recuperó y alineó las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de cerdo (Sus scrofa) que muestran una identidad de 100%. Discusión de resultados Puntos a discutir: a) Explicar cuál es el método de búsqueda del algoritmo blast. b) Analizar, desde el punto de vista estadístico, por qué se deben filtrar las secuencias de baja complejidad. c) Señalar cuál es el significado estadístico del valor de Expect en el programa bioinfor- mático Blast. d) Discutir el impacto de la bioinformática en la biología. Los alumnos presentarán un informe sobre el desarrollo de la sesión que incluya la discusión de los incisos a), b), c), y d). Bibliografía Burks, C., et al. (1990), “GenBanK: Current status and future directions”, Methods in enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Collado, J. y A. Medrano (2003), “La biología computacional antes, durante y después de los genomas”, Fronteras de la biología en los inicios del siglo Xxi. Módulo 1: Genómica, proteó- mica y bioinformática. Bolívar F. (coord.), El Colegio Nacional, México. Collins, J. y A. Coulson (1990), “Significance of protein sequence similaritie”, Methods in Enzi- mology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Proteinand Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Dolittle, R. (1990), “Searching through sequence databases”, Methods in Enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Se- quences, Academic Press, Inc. Mount, D. (2004), Bioinformatics. Sequence and genome análisis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, N.Y.
  41. 41. 43 Análisis de la actividad de catalasas Práctica 6 Introducción El oxígeno es una molécula altamente reactiva que se reduce parcialmente dando lugar a di- versos agentes químicamente reactivos conocidos como especies reactivas de oxígeno (Ros, por sus siglas en inglés). Estas formas de oxígeno son altamente dañinas para los componen- tes celulares, incluyendo a los ácidos nucleicos, los lípidos y las proteínas. Además de estas mo- léculas muy reactivas, tanto el peróxido de hidrógeno (H2 O2 ) como el anión superóxido (O2 - ), son incluidos también como ros, ya que llevan a la producción de más especies reactivas, par- ticularmente en presencia de iones metálicos. Las Ros se pueden generar endógenamente en las células como consecuencia de los procesos metabólicos. También se forman por la exposi- ción de las células a agentes ionizantes, radiación y recicladores redox presentes en el medio y por la exposición a metales pesados. Así, todos los organismos aeróbicos están expuestos con- tinuamente al ataque de agentes oxidantes a través de estos mecanismos. El estrés oxidativo ocurre cuando la concentración de estos oxidantes se incrementa por encima de la capacidad amortiguadora antioxidante de la célula. Dada la ubicuidad de las Ros no es sorprendente que todos los organismos hayan desarrollado medios para proteger a sus componentes celulares contra estos oxidantes altamente reactivos. Para defenderse contra estas especies reactivas de oxígeno las células contienen enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa, las catalasas y varias peroxidasas, además de que también producen moléculas antioxidantes como el ascorbato, el tocoferol y el glutatión. Las catalasas son un sistema de enzimas hemoproteicas cuyo papel es la detoxificación de los metabolitos de oxígeno generados en los diversos procesos celulares: 2 H2 O2 O2 + 2 H2 O La ingeniería genética es la técnica que se utiliza con el fin de cambiar alguna o algunas carac- terísticas del código genético. Estos cambios pueden consistir en retirar, modificar o agregar genes al dna de un organismo. Al modificar esta información, la ingeniería genética cambia el tipo o cantidad de proteínas que puede producir un organismo, con lo cual hace posible que éste elabore sustancias nuevas o desempeñe funciones distintas. En esta práctica se utilizarán dos cepas que han sido genéticamente manipuladas y su cepa parental, con el fin de que mediante un experimento muy sencillo los estudiantes pue- dan apreciar la diferencia en la expresión genética entre una cepa silvestre y cepas genética- mente alteradas, además de que comprendan y analicen tanto el poder como los alcances y limitaciones de la manipulación genética.
  42. 42. Manualdebiotecnología|práctica6 44 Objetivo general Identificar cómo a través de la ingeniería genética se puede alterar la expresión genética de los organismos. Objetivo específico Determinar la actividad de catalasa en cepas bacterianas usando un ensayo de liberación de oxígeno. Material y equipo Material Equipo Círculos de 3 cm de diámetro de papel filtro Vórtex Perlas de vidrio para romper 2 vasos de precipitados de 250 ml Centrífuga 1 pipeta de 5 ml Incubadora con agitación 1 pipeta de 10 ml Cronómetro 1 probeta de 1 00 ml Cámara de video 1 probeta de 1,000 ml Reactivos 2 tubos de cultivo de vidrio estériles a Triptona Tubos eppendorf de 1.5 ml a Extracto de levadura Tubos para centrífuga a NaCl Baño de hielo Agua destilada Pinza para papel filtro a KCl a Na2 HPO4 a KH2 PO4 a NaOH a Ampicilina(50 mg/ml) Hielo * Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada, H2 O2 ) * Material que deberán traer los alumnos a Reactivos para preparar medios de cultivo. La elaboración de los medios de cultivo está en el anexo. Material biológico: cepas de Rhizobium etli CFN42, cepa silvestre, contiene cromosoma y 6 plásmidos CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del plásmido p42f complementada para actividad de catalasa ++) CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del pásmido p42f, catalasa –)
  43. 43. AnálisisdelaactividaddeCatalasas|práctica6 45 Metodología 1. Inocular las tres cepas (silvestre, catalasa- y catalasa+ ) cada una por separado en tu- bos de cultivo que contengan 3 ml de PY con 10 ml de ampicilina 50 mg/ml. Incubar a 37 0 C con agitación constante (250 rpm) durante 12 hrs. 2. Centrifugar los cultivos tres minutos a 13,000 g. 3. Resuspender las pastillas en 200 µl de PBS, añadir perlas de vidrio cubriendo hasta ¾ del líquido y romper 5 intervalos de 1 min por uno de reposo en el vórtex. 4. Centrifugar a 13,000 g por cinco minutos y trasladar los sobrenadantes a un tubo nuevo. 5. En este momento preparar 400 ml de una solución al 1% de H2 02 en agua destilada y distribuir 200 ml en tres vasos de precipitados de vidrio. 6. Empapar los círculos de papel filtro con el sobrenadante de cada cepa, tener cuidado de marcar antes con lápiz cada uno de los círculos. Tener lista la cámara y el cronó- metro. 7. Cada uno de los círculos mojados se toman con las pinzas por una orilla y se colocan en la solución de H2 O2 depositándolos hasta al fondo del vaso. 8. Se observa durante cinco minutos. Resultados 1. De acuerdo con los resultados, discutir los siguientes puntos: 2. ¿En qué vaso se formaron más burbujas? ¿En cuál vaso no se formaron? ¿Por qué? 3. ¿Por qué se forman estas burbujas? 4. ¿Las burbujas se generarían de la misma forma con otro reactivo? 5. ¿Qué aplicaciones potenciales tiene una cepa con gran actividad de catalasa? Agradecimientos Se agradece al Dr. Alejandro García de los Santos del Centro de Ciencias Genómicas por permi- tirnos utilizar sus cepas. Bibliografía Díaz, A. (2003), La estructura de las catalasas, REB 22 (2): 76-84. Luque, J. y A. Herráez (2001), Biología molecular e ingeniería genética, Harcourt.
  44. 44. Manualdebiotecnología|práctica7 46
  45. 45. 47 Síntesis de celulosa bacteriana de Gluconacetobacter xylinum para aplicaciones biotecnológicas Práctica 7 Introducción La celulosa es el polímero de mayor abundancia natural, conformado por una larga cadena lineal de moléculas de D-glucopiranosa enlazadas mediante los carbonos C1 y C4 (enlace ß1- 4, ver figura). Estructura lineal de la celulosa. Diversas especies dentro de los géneros Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Escheri- chia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Sarcina, Zoogloea y Gluconacetobacter producen celulosa, siendo G. xylinum la bacteria que tiene la mayor capacidad de síntesis. Al estudiar la fermentación de vinagre se observó que se formaba una masa gelatinosa sobre la superficie del medio de cultivo a la que se denominó “madre del vinagre”. Análisis pos- teriores determinaron que la masa estaba compuesta por celulosa y que la bacteria Bacterium aceti era el organismo responsable de su producción. Posteriormente, la bacteria fue referida como Acetobacterium xylinum ó Bacterium xyli- nodes; el nombre derivó a Acetobacter xylinum y finalmente la denominación actual de esta bacteria es Gluconacetobacter xylinum. G. xylinum es un miembro de la familia Acetobactereaceae; es una bacteria Gram negati- va con forma de bacilo cuyo tamaño varía entre 0.6 – 0.8 µm x 1.0 – 1.4 µm. Es un microorga- nismo aerobio estricto, con metabolismo respiratorio que oxida en forma incompleta azúcares y alcoholes —fermentación oxigénica—. Su hábitat natural son frutas y vegetales en proceso de descomposición. En cultivo estático, la bacteria secreta microfibrillas de celulosa, las cuales en el exterior se ensamblan formando una nata gruesa o “película”. Se ha propuesto que la celulosa permite a las células alcanzar la superficie del medio de cultivo, donde existe mayor disponibilidad de O2 para su crecimiento.
  46. 46. Manualdebiotecnología|práctica7 48 La película de celulosa posee funciones de vital importancia para G. xylinum: aumenta su capacidad para colonizar sustratos, evita la desecación y protege a la bacteria contra la radia- ción ultravioleta. La celulosa producida por G. xylinum tiene alta pureza y una estructura similar a la de la celulosa vegetal. La estructura de la celulosa depende de las condiciones de cultivo: en con- diciones de cultivo estático se genera una “película” en la interfase aire/líquido mientras que en cultivo agitado se forman gránulos irregulares, cadenas fibrosas o ramificadas de celulosa. El mecanismo de síntesis de celulosa bacteriana le confiere una pureza superior a la de la celulosa vegetal y posee características peculiares: alto grado de cristalización, alta resistencia a la presión, elasticidad y durabilidad, elevada absorción de agua y mayor área superficial que la que presenta la celulosa vegetal. Además, es inerte metabólicamente, no es tóxica ni provo- ca reacción alérgica al contacto, propiedades de particular importancia para fines biomédicos y cosméticos. G. xylinum no lleva a cabo glucólisis (carece de la enzima fosfofructocinasa-1), pero en cambio a partir de triosas fosfato realiza gluconeogénesis; la ruta de las pentosas fosfato y el ciclo de Krebs son las vías anfibólicas más activas en la bacteria. Mediante estas vías se pro- duce la celulosa tanto a partir de la poza de hexosas fosfato (glucosa, fructosa, manosa) como por síntesis a través de la vía gluconeogénica. La síntesis de celulosa es un proceso costoso debido a los requerimientos de energía y fuente de carbono; sin embargo, la película permite a G. xylinum situarse cerca de la superficie del medio y obtener así un mayor acceso a los nutrientes y sobre todo al oxígeno, indispensa- ble para la síntesis de Atp. Aplicaciones biotecnológicas La celulosa bacteriana (cb) generada por G. xylinum tiene cualidades únicas que no están pre- sentes en la celulosa vegetal: es un producto de alta pureza que no posee lignina ni ningún otro material común en la celulosa de otras fuentes. La celulosa nativa exhibe un alto grado de hidrofilicidad, puede retener una cantidad de agua aproximada a 600 veces su peso seco, se ha demostrado que el 99% de la cb es agua. La Cb es permeable a gases, tiene una alta fuerza tensil y resistencia a la presión; es inerte metabólicamente y no tiene propiedades alergénicas; estas últimas características le permiten una variedad de aplicaciones en la industria cosméti- ca, farmacéutica y biomédica (ver cuadro). Industria Aplicaciones Turística Ropa deportiva, equipo para acampar. Textil Material de alta absorción acuosa. Papel Restauración de documentos, papel de alta calidad. Alimentos Aditivo de alimentos, emulsificante, fibra dietética. Refinería Material para la absorción de aceites. Maquiladora Componente de partes y refacciones para autos, aviones, etc. Tecnología Diafragmas de alta sensibilidad en micrófonos y audífonos. Investigación Inmovilización de proteínas y células, resinas para cromatografía. Médica Fabricación de piel artificial en terapia de quemaduras. Componente en implantes dentales. Aplicaciones industriales de la celulosa de origen bacteriano.
  47. 47. SíntesisdecelulosabacterianadeGluconacetobacterxylinumparaaplicacionesbiotecnológicas|práctica7 49 Objetivo general Que el alumno obtenga celulosa de origen bacteriano de alta pureza. Objetivos específicos • Demostrar las aplicaciones biotecnológicas industriales de los productos del meta- bolismo bacteriano. • Que el alumno compare las ventajas y desventajas de la producción de la celulosa bacteriana vs la celulosa vegetal. Material y equipo Material Equipo 200 ml de medio BEGG Potenciómetro 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Balanza analítica Pipeta serológica de 5 ml Horno (opcional) * Caja Petri (estéril) Campana de flujo laminar Pinza (estéril) * Recipiente para colocar la película de celulosa en NaOH Papel aluminio 1 bisturí (con navaja estéril) 50 ml de NaOH 0.5 M * Algodón y gasas para elaborar un tapón *Material que deberán traer los alumnos. Metodología Inocular G. xylinum —cultivada por el profesor durante una semana anterior a la fecha de la práctica a una temperatura ~ 30°C. Para inocular se utilizará un fragmento de la película de celulosa formada en el cultivo estático, ya que G. xylinum crece en la matriz de la película de celulosa en estas condiciones. Para hacer más fácil la inoculación de G. xylinum, se sugiere que en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar o cerca del mechero) se coloque, con la ayuda de unas pinzas, la película de celulosa formada en una caja de Petri vacía y una sola persona corte cinco fragmentos con el bisturí; cada equipo inoculará su respectivo matraz con un fragmento de celulosa. Dejar los matraces en reposo a temperatura ambiente durante una o dos semanas (es importante no mover estos matraces para evitar que la película de celulosa se hunda).
  48. 48. Manualdebiotecnología|práctica7 50 Resultados Transcurrido el tiempo, se obtiene la película de celulosa. Determinar el peso húmedo y el pH final del medio de cultivo. La película de celulosa se coloca en NaOH O.5 M por 30 min. a 100 °C, con el fin de blan- quearla; posteriormente, se lava con abundante agua y se deja secar a temperatura ambiente para determinar su peso seco. De no contar con un horno se puede dejar en la sosa a tempe- ratura ambiente por varios días. El alumno reportará el rendimiento de celulosa tanto en peso húmedo como seco. Tam- bién debe reportar, con base en este rendimiento, cuál es el porcentaje de humedad que retie- ne la película de celulosa. Agradecimientos Se agradece al Dr. José Edgardo Escamilla Marván, investigador del Instituto de Fisiología Celu- lar de la unam por la donación de la cepa de Gluconacetobacter xylinum IFO 13693. Bibliografía Brown, A.J. (1886), “On acetic ferment which forms cellulose”J. Chem. Soc. 49: 432-439. Englehardt, J. (1995), “Sources, industrial derivatives, and commercial applications of cellulo- se”, Carbohydr. Eur, 12: 514. Ross, P., R. Mayer y M. Benziman (1991), “Cellulose biosynthesis and function in bacteria”, Mi- crobiol 55: 35-58. Yamanaka, S. y K. Watanabe (1994), Applications of bacterial cellulose in cellulosic polymers, Chapter 11, Gilbert, R. (ed.), Hanser Publishers Inc, Cincinnati, OH. Yamanaka, S. y K. Watanabe, N. Kitamura y M. Iguchi (1989), “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose”, J. Mater. Sci. 24: 3141-3145.
  49. 49. 51 Emulsificación de diesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses Práctica 8 Introducción Los ramnolípidos son moléculas tensoactivas que actúan como biosurfactantes. La función principal de los biosurfactantes es permitir a los microorganismos crecer en sustratos inmis- cibles en agua a través de la reducción de la tensión superficial. Los ramnolípidos están for- mados por una molécula hidrofóbica que generalmente es un dímero de ácido ß-hidroxideca- noico y una parte hidrofílica constituida por una (monorramnolípido) o dos (dirramnolípido), moléculas de ramnosa. En particular, los ramnolípidos producidos por P. aeruginosa han sido estudiados para su aplicación en distintas áreas, que incluyen la detoxificación de suelos con- taminados con petróleo, la eliminación de metales tóxicos de suelos, recuperación terciaria de petróleo, protección contra plagas, así como en la industria cosmética y farmacéutica. Son también una fuente importante de L-ramnosa, que es usada en química fina y como materia prima para la síntesis de compuestos orgánicos. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental que puede proliferar en diversos há- bitats, incluyendo agua, suelo y plantas. Esta bacteria secreta numerosos compuestos que se encuentran involucrados en el éxito de colonizar diferentes ambientes. Dentro del género Pseudomonas, solo P. fluorescens (viscocina) y P. aeruginosa tienen la capacidad de producir biosurfactantes llamados ramnolípidos. Los factores de virulencia son expresados de una ma- nera coordinada a altas densidades celulares por un mecanismo llamado respuesta sensora de quórum (Qs). Aunque la función fisiológica de los ramnolípidos en P. aeruginosa no ha sido completa- mente establecida, se les ha considerado como factores de virulencia y antimicrobianos y se les ha implicado en el establecimiento de la estructura y en la disgregación de las biopelículas, así como en la movilidad tipo “swarming”de esta bacteria. La síntesis de ramnolípidos se lleva a cabo por la ramnosiltranferasa I (Rt 1), codificada por el operón rhlAB; rhlA produce el dímero de ácidos grasos (HAAs), el papel de RhlB es el de trans- ferir una molécula de dTDP-L-ramnosaal dímero de HAAs. La ramnosiltranferasa II (Rt 2), toma una segunda molécula de dTDP-L-ramnosa. La producción de ramnolípidos por P. aeruginosa depende de factores nutricionales y medioambientales, como la limitación de nitrógeno, el pH, y la temperatura. La biosíntesis de ramnolípidos ocurre durante la fase exponencial tardía y la fase estacionaria de crecimiento, bajo condiciones de limitación de nitrógeno o de fosfatos.
  50. 50. Manualdebiotecnología|práctica8 52 Objetivo Evaluar la emulsificación del diesel y del aceite de maíz por las cepas Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcenses y Escherichia coli. Material y equipo Material Equipo 4 matraces Erlenmeyer de 125 ml Incubadora a 30 °C Tubos para centrífuga Incubadora a 37 °C 1 gradilla Centrífuga 12 tubos con tapa de 15 ml Vórtex Pipetas de 10 ml Reactivos * Papel periódico Medio PPGAS * Regla Medio PG Tritón X-100 *10 ml de gasolina *10 ml de diesel *10 ml de aceite de maíz *Material que deberán traer los alumnos Metodología Obtención de los biosurfactantes producidos por las cepas Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses. 1. Inocular, en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PPGAS, una colonia fresca de la cepa Pseudomonas aeruginosa y en otro matraz con el mismo medio ino- cular una colonia de Escherichia coli, e incubar ambos matraces a 37 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. Al mismo tiempo, inocular en otro matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PG, una colonia fresca de la cepa Serratia marcenses, e incubar a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. 2. Transferir los cultivos crecidos a tubos para centrífuga. Centrifugar a 4 000 rpm por diez minutos y guardar el sobrenadante (fuente de biosurfactantes) a 4 °C. 3. Esterilizar los paquetes celulares para desecharlos. Prueba de emulsificación. 1. Cubrir la mesa de trabajo con papel periódico antes de comenzar. 2. Poner 3 ml de diesel a c/u de los tres tubos de ensaye, 3 ml de gasolina a c/u de los otros tres tubos, 3 ml de aceite de maíz a c/u de los tres tubos y a un último se le colocan 3 ml de tritón, que será utilizado como blanco de reacción. Los tubos deben etiquetarse de la siguiente manera: PaD (por P. aeruginosa Diesel, y así los demás tubos), PaG, PaA, PaT, SmD, SmG, SmA, SmT, EcD, EcG,EcA y EcT. Agregar 2 ml del sobrenadante de cada cepa a evaluar; los que están marcados con Pa corresponden al sobrenadante de Pseudomonas aeruginosa, mientras que los que llevan las letras Sm corresponden a la cepa de Serratia marcenses y los que van etiquetados con
  51. 51. Emulsificacióndediesel,gasolinayaceitedemaízporPseudomonasaeruginosaySerratiamarcenses|práctica8 53 las letras Ec corresponden al sobrenadante de Escherichia coli, de acuerdo con la siguiente tabla: Diesel Gasolina Aceite de maíz Tritón Sobrenadante P. aeruginosa Sobrenadante S.marcenses Sobrenadante E.coli PaD 3 ml - - - 2 ml - - PaG - 3 ml - - 2 ml - - PaA - - 3 ml - 2 ml - - PaT - - - 3 ml 2 ml - - SmD 3 ml - - - - 2 ml - SmG - 3 ml - - - 2 ml - SmA - - 3 ml - - 2 ml - SmT - - - 3 ml - 2 ml - EcD 3 ml - - - - - 2 ml EcG - 3 ml - - - - 2 ml EcA - - 3 ml - - - 2 ml EcT - - - 3 ml - - 2 ml 3. Agitar en el vórtex cada tubo a velocidad máxima durante dos minutos y dejar re- posar 30 minutos, hasta que se forme una nata blanca que es el indicador de emul- sificación. Resultados Cada equipo deberá determinar los mililitros de nata que se forman en cada tubo y obtener el porcentaje de emulsificación, con base en la siguiente apreciación: si la nata blanca que se forma es de 5 ml y existe una sola fase, el porcentaje de emulsificación es del 100%; en caso de que la nata formada sea de menor volumen y coexistan dos fases se deberá hacer una relación con una regla de proporciones. Anotar el porcentaje (%) de emulsificación en la siguiente tabla: Diesel Gasolina Aceite de maíz Tritón X-100 P. aeruginosa S. marcenses E. coli En el pizarrón se anotarán los resultados de todos los equipos y con éstos se obtendrá el pro- medio y la desviación estándar de cada muestra.
  52. 52. Manualdebiotecnología|práctica8 54 Bibliografía De Kievit, T.R., R. Gillis, S. Marx, C. Brown y B.H. Iglewski (2001), “Quorum-sensing genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms: their role and their expression patterns”, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1865-1873. Maier, R.M. y G. Soberón-Chávez (2000), “Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:625-633. Medina, G., K. Juárez, B. Valderrama y G. Soberón-Chávez (2003), “Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter”, J. Bacteriol 185: 5976- 5983. Medina, G., K. Juárez y G. Soberón-Chávez (2003), “The Pseudomonas aeruginosa rhlAB operon is not expressed during the logarithmic phase of growth even in the presence of its acti- vator RhlR and the autoinducer N-butyryl-homoserinelactone”, J. Bacteriol. 185: 377-380. Soberón-Chávez, G., F. Lépine y E. Déziel (2005), “Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:718-725.
  53. 53. 55 Metabolismo secundario Práctica 9 Introducción A medida que en las plantas se generan los compuestos primarios como son los aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, ácidos carboxílicos, a través de las mismas o similares vías de biosíntesis, de manera paralela, se originan también otro tipo de compuestos que de acuerdo con sus características particulares y específicas se denominan compuestos o metabolitos secundarios. Las vías están interrelacionadas con el metabolismo primario; éste provee un cierto nú- mero de pequeñas moléculas que son empleadas como precursores de todas las vías metabó- licas secundarias importantes. Existen tres precursores principales: 1. El ácido shikímico, precursor de muchos compuestos aromáticos, incluyendo los aminoácidos aromáticos, los ácidos cinámicos y ciertos polifenoles. 2. Los aminoácidos que dan origen a los alcaloides y a los antibióticos peptídicos inclu- yendo las penicilinas y las cefalosporinas. 3. El acetato, precursor de los poliacetilenos, las prostaglandinas, antibióticos macrocí- clicos, polifenoles e isoprenoides. Entre los numerosos grupos de metabolitos secundarios producidos por una planta se encuen- tran los alcaloides, terpenos, glucósidos, flavonoides, fenoles, etc., por mencionar los principa- les y más comunes. Estos compuestos pueden o no encontrarse en un determinado vegetal; por su abundancia o ausencia, proporcionan a la planta características químicas útiles para su sobrevivencia, su clasificación botánica y su aprovechamiento por parte del hombre, y como principios activos que pueden presentar alguna actividad biológica para un gran número de organismos, aún de diferentes reinos. Las pruebas específicas para la determinación de grupos de metabolitos secundarios se llevan a cabo con un extracto de planta y a través de las técnicas colorimétricas y de precipi- tación reportadas por Domínguez. Se identifica cualitativamente la presencia o ausencia de cada uno de los grupos según el cambio de coloración o la precipitación: • Terpenos: se determinan mediante la prueba de Libermann-Burchard. • Alcaloides: se determinan mediante la prueba de Draguendorff. • Flavonoides: se determinan mediante la prueba de Shinoda. • Glucósidos: se determinan mediante la prueba de Mölish.
  54. 54. Manualdebiotecnología|práctica9 56 Objetivos • Que el alumno determine, a través de pruebas químicas preliminares la presencia de grupos de metabolitos secundarios en el extracto hexánico de hoja de planta. • Determinar el efecto del extracto de la planta sobre el crecimiento de Escherichia coli. Material y equipo Parte I Material Equipo * 2 frascos Gerber * Alcohol de curación (para elaborar el extracto) 3 goteros Vórtex 1 espátula Propipeta 1 vaso de precipitados de 500 ml 4 pipetas serológicas de 5 ml Cloroformo 5 tubos de ensaye Ácido clorhídrico Espátula Draguendorff 1 vaso de precipitados de 500 ml para el baño de agua – hielo Ácido sulfúrico Metanol Mölish Liebermann-Burchard Viruta de Mg Material biológico *a Extracto de planta *Material que deberán traer los alumnos Parte II Material Equipo * 3 cajas de Petri Mechero Perlas estériles para espatular Campana de flujo laminar Sensi-discos o papel filtro (1 cm diámetro) Incubadora a 37 o C Pinzas Reactivos * Regla o Vernier Agar nutritivo Violeta de genciana Hexano Material biológico Cepa de Escherichia coli GM2163, cultivada en LB entre 8-24 horas previo a la práctica *a Extracto de planta
  55. 55. Metabolismosecundario|práctica9 57 a Preparación del extracto: Una semana antes de llevar a cabo la práctica, colocar clavo entero (especia), hasta aproxima- damente ¼ de volumen de un frasco de Gerber limpio y cubrir hasta la mitad del frasco con etanol al 70%; tapar y dejar macerar. El día anterior a que se lleve a cabo la práctica, tomar ~ 10 ml del extracto líquido y transferir a otro frasco Gerber limpio. Dejar destapado para evaporar el etanol. Una vez reducido el volumen, tapar y llevar ambos frascos a la clase. Metodología Esta práctica se lleva a cabo en dos partes, en la primera se determinarán los grupos de meta- bolitos secundarios del extracto de la planta y en la segunda parte se determinará la actividad biológica del extracto mediante un ensayo biológico con bacterias. Parte I. Determinación de los grupos de metabolitos secundarios 1. Se prepara una solución madre del extracto y se toma 1 ml colocándolo en un tubo de ensaye, procedimiento que se repite para cada una de las pruebas (5 tubos de ensaye). 2. Se agrega el reactivo que corresponde a cada grupo: Tubo 1. Control. Sólo se agrega 1ml del extracto. Tubo 2. Terpenos. El extracto se disuelve en 1 ml de cloroformo concentrado, se agita un minuto y se deja reposar, si se llegaran a formar dos fases se retira la superior. A la fase inferior se le agrega 1 ml de reactivo de Libermann-Burchard. Se considera posi- tiva la prueba si se observa un cambio de coloración al azul-verdoso o rojo-naranja. Tubo 3. Alcaloides. Al mililitro de extracto se le añade una gota de ácido clorhídrico concentrado y dos gotas del reactivo Draguendorff. La prueba se considera positiva si se observa un precipitado de color naranja-marrón. Tubo 4. Flavonoides. Se le agrega al extracto un trocito de viruta de magnesio (2–4 mm) y dos gotas de ácido clorhídrico concentrado, si se observa un cambio de colo- ración hacia el verde o naranja la prueba se considerará positiva. Tubo 5. Glucósidos. A 1 ml de extracto se le agrega 1 ml de metanol; después, se le agregan dos gotas de Mölish. Se coloca el tubo en un baño agua–hielo y se añade 1 ml de H2 SO4 concentrado dejando que éste se deslice por las paredes del tubo de en- saye formando así una interfase. Se toma lectura de la coloración del anillo formado en la interfase, se considera la prueba positiva si se observa un color violeta. 3. Observar y anotar la presencia o ausencia de los grupos funcionales, de acuerdo al viraje o precipitado según la prueba. Parte II. Determinación de la actividad biológica de un extracto de planta 1. Preparar agar nutritivo: Pesar 2.0 g de agar nutritivo y suspender en 90 ml de agua purificada. Calentar agitando suavemente hasta su completa disolución y esterilizar en autoclave a 121 0 C a 15 lb de presión por 15 minutos. Dejar enfriar a 45 – 50 0 C. 2. Vaciar ~25 ml del medio en cada una de tres cajas Petri y dejar solidificar. 3. Distribuir, con perlas estériles, 0.2 ml de cultivo líquido de Escherichia coli GM2163. 4. Impregnar los discos de papel filtro con cuatro diferentes cantidades del extracto del frasco 1 (20, 40, 60 y 80 ml) y uno más que será el control positivo, que se impregnará con 20 ml de violeta de genciana. Realizar el ensayo por triplicado. 5. Dejar secar los discos por aproximadamente 10 min antes de colocarlos en la caja, para que se evapore el solvente.
  56. 56. Manualdebiotecnología|práctica9 58 6. Distribuir los cinco discos por caja, separándolos de manera que se alejen lo más posible entre ellos y del borde de la caja (ver figura). Distribución de los discos 7. Incubar las cajas por 24 horas a 37 °C. 8. Observar las cajas a las 18 y a las 24 horas y determinar si hubo actividad bacteriostáti- ca, esto es, presencia de un halo de inhibición alrededor de los filtros, con una densidad celular menor que la presentada en el resto de la caja, asumiendo que esto se debe a la inhibición parcial del crecimiento bacteriano; o bien bactericida, inhibición total de crecimiento bacteriano alrededor del disco, observado como un halo transparente. 9. Medir con una regla o Vernier el diámetro de los halos Resultados Para las pruebas colorimétricas y de precipitación, completar la tabla siguiente y asignar valo- res (+), (++), (+++) y (++++) según la intensidad de la reacción y (-) para aquéllas en las que no se observa reacción. Grupo químico Intensidad Terpenos Alcaloides Glucósidos Flavonoides Para el ensayo con E. coli, elaborar una tabla como la indicada abajo, en donde se especifique el diámetro de los halos, indicando con un asterisco (*) los que tuvieron actividad bactericida. Caja 20µl 40 µl 60 µl 80 µl 1 2 3 4 5
  57. 57. Metabolismosecundario|práctica9 59 Graficar el promedio de los halos por la cantidad de extracto en una gráfica de línea: Diámetrodelhalo(mm) 20 40 60 extracto (µl) 80 Discusión 1. De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas colorimétricas y de precipi- tación, analizar los valores asignados (+) según la intensidad de la reacción y deter- minar la abundancia de los grupos de metabolitos secundarios. 2. Para el bioensayo con E. coli, analizar en la tabla si presenta o no halo de inhibición en cada una de las concentraciones y de qué tipo principalmente (bacteriostático o bactericida). 3. En la gráfica, al observar la media del diámetro de los halos de inhibición, analizar si la actividad biológica (bacteriostática o bactericida) depende de la cantidad de extracto. Bibliografía Anaya, L. A. L. (2003), Ecología química, Instituto de Ecología, unam/ Plaza y Valdés, México. Domínguez, X. A. (1988), Métodos de investigación fotoquímica, Limusa, México. Romeo, J. T. (2004), Secondary metabolism in model systems, Elsevier, Amsterdam. Hui, Y. H. (2008), Food drying science and technology: microbiology, chemistry applications, Lan- caster Pennsylvania.
  58. 58. 61 Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas Práctica 10 Introducción La biorremediación es el proceso que se ocupa de la utilización de sistemas biológicos para degradar compuestos tóxicos, contaminantes y sustancias de importancia ambiental (deno- minados genéricamente compuestos xenobióticos) en suelos, aguas y aire, generando com- puestos de menor o ningún impacto ambiental, o bien aislando la sustancia tóxica. Algunas de estas degradaciones o cambios ocurren usualmente en la naturaleza —en- tonces se denomina “atenuación natural”— sin embargo, la velocidad de tales cambios es baja. Mediante una adecuada manipulación, los sistemas biológicos pueden ser optimizados para aumentar la velocidad de cambio o degradación para que puedan ser usados en sitios con una elevada concentración de contaminantes. Una gran variedad de contaminantes pueden ser eliminados por biorremediación: pestici- das, herbicidas, petróleo y sus hidrocarburos derivados, gasolinas y metales pesados, entre otros. Entre los sistemas más interesantes para la biorremediación se encuentran los hongos ligninolíticos. Estos organismos degradan la madera a través de un conjunto de enzimas oxi- dasas poco específicas que pueden usar como sustrato un sinnúmero de compuestos xeno- bióticos. Entre estas enzimas, las lacasas han sido más estudiadas ya que son enzimas robus- tas y con un amplio rango de sustratos. Las lacasas pertenecen al grupo de las fenol oxidasas y contienen cuatro átomos de cobre en su sitio activo que son los que llevan a cabo las reaccio- nes de óxido reducción. En esta práctica se harán ensayos destinados a demostrar la importancia de las lacasas en la capacidad de crecimiento de diversos hongos ligninolíticos, así como su determinación por métodos colorimétricos. Objetivo general Determinar la actividad enzimática de lacasas y relacionarla con su función como agentes de biorremediación. Objetivos específicos • Determinar el crecimiento de diversas cepas de hongos ligninolíticos en presencia de petróleo. • Determinar la actividad de lacasa de los hongos crecidos en el inciso anterior.

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