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Referencias
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  1. 1. 1 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Práctica de laboratorio No. 1. Uso y Calibración de Micropipetas Objetivo Medir volúmenes precisos mediante el uso de micropipeta. Calibrar una micropipeta Marco teórico Una micropipeta es un dispositivo diseñado para medir volúmenes muy pequeños de líquidos con un alto nivel de precisión, tales líquidos no deben atacar el polipropileno o el policarbonato, materiales de los cuales está construido el dispositivo de medida, por igual no pueden usarse líquidos con elevadas presiones de vapor. En cualquier caso, el volumen de líquido a medir JAMAS debe tocar el cono de polipropileno de acoplamiento para puntas; CUALQUIER CANTIDAD DE DISOLUCIÓN PRESENTE EN EL INTERIOR DE LA MICROPIPETA, DATERIORA EL SISTEMA DE MEDIDA. En ningún caso se debe dejar la micropipeta en posición horizontal mientras tenga algún líquido en la punta La micropipeta posee un sistema con cojín de aire para el pipeteado de soluciones acuosas con densidad media y viscosidad baja a media, siempre y cuando se lo utilice bajo las siguientes limitaciones: – +15 °C a +40 °C (de aparato y reactivos: pueden obtenerse otras temperaturas si así se desea), presión de vapor de hasta 500 mbar y viscosidad: 260 mPas, Brand, 2012, p 66. Los líquidos viscosos y humectantes pueden afectar a la exactitud del volumen, por igual, los líquidos cuya temperatura difiera en más de ±1 °C de la temperatura ambiente. La micropipeta en referencia permite medir entre 100 y 1000 microlitros (aunque los topes inferior y superior son de 28 y 1108 L respectivamente). Descripción de la micropipeta A continuación, en la gráfica No. 1.1 se muestra una fotografía, Brand, 2012, donde se señalan las partes de una micropipeta, para este caso, de 100 – 1000 L.
  2. 2. 2 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Gráfica No. 1.1 Descripción de la micropipeta de 0 a 1000 L Eyector de puntas
  3. 3. 3 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Procedimiento Una vez insertada la punta apropiada en el cono de acoplamiento, esta se debe enjuagar con el líquido a transferir, de acuerdo la Norma ISO 8655. El proceso de micropipeteado se describe en tres momentos: aspirar la disolución, transferirla y expulsar la punta, a saber: Aspirar el reactivo 1. Seleccionar el volumen a transferir utilizando el selector de volumen; si al intentar girarlo este se resiste, es necesario mover hacia arriba el seguro de protección contra cambio de volumen, tal como se muestra en la gráfica No. 1.2: Gráfica No. 1.2. Definición del volumen a transferir Ahora girarlo por ejemplo hasta 48 L y baja el seguro de protección contra cambio de volumen, tal como lo muestra la gráfica No. 1.3. Gráfica No. 1.3. Activación del seguro contra cambio de volumen. Sumerge la punta 2 a 3 milímetros en el líquido a transferir, presiona el pulsador de pipeteado hasta el primer tope, , tal como se indica en la gráfica No. 1.4: Seguro de protección contra cambio de volumen desactivado Seguro de protección contra cambio de volumen activado Pulsador de pipeteado
  4. 4. 4 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Gráfica No.1.4. Aspirando la muestra Ahora sin sacar la punta del líquido a transferir, suelta lentamente el pulsador de pipeteado, para aspirar el líquido, dejando la punta sumergida durante 1 o 2 segundos para permitirle al equipo la succión precisa de líquido, tal como se ilustra en la gráfica No. 1.5.: Gráfica No. 1.5. Aspirando la muestra. Expulsar el reactivo Para expulsar el volumen medido, saca la micropipeta de la disolución permitiendo un ligero toque de la punta con la pared del recipiente, ahora apoya la punta en la pared del recipiente donde va a transferirse el volumen medido con un ángulo de 30o a 45o y presiona lentamente el pulsador de pipeteado con velocidad uniforme hasta el primer tope y mantenerlo así, tal como se muestra en la gráfica No. 1.6: Gráfica No. 1.6. Expulsión del volumen medido. Luego, presiona el pulsador de pipeteado hasta el segundo tope para vaciar completamente la punta y durante este tiempo escurre la punta de la pipeta contra la
  5. 5. 5 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA pared del recipiente deslizándola una distancia de aproximada de 10 mm, tal como se indica en la gráfica No. 1.7. Gráfica No. 1.7. Expulsando el volumen medido Expulsar la punta Una vez efectuadas todas las mediciones pertinentes debes expulsar la punta, para ello presiona hacia abajo el expulsor, hasta el tope, momento en el cual, la punta plástica sale eyectada al sitio de su almacenamiento y posterior desecho, tal como se muestra en la gráfica No. 1.8. Gráfica No. 1. 8. Expulsión de la punta La norma ISO 8655 prescribe que la punta de la pipeta, antes del proceso de pipeteado propiamente dicho, debe enjuagarse con el líquido de la muestra. ¡No colocar nunca el aparato con la punta llena en posición horizontal! Esta acción introduciría el líquido en el interior del mismo contaminándolo e iniciando su deterioro. Referencias Brand, 2012. Transferpette S. Documento consultado el 9 de agosto de 2012, 3n: http://www.brand.de/fileadmin/user/pdf/GA/GA_Transferpette_S_DE-EN-FR-ES- IT.pdf
  6. 6. 6 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES QUÍMICA GENERAL Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Práctica de Laboratorio No. 2. Medición de Concentración de Disoluciones por Espectrofotometría Objetivos Calcular por espectrofotometría Uv-Vis, la concentración de algunas disoluciones problema a partir de disoluciones estándar. Materiales y Reactivos 2 Matraz aforado de 250 mL 3 matraces aforados de 10 mL 3 Mtraces aforados de 25 mL 1 pH-metro digital 1 gradilla para tubos de ensayo 5 tubos de ensayo de 15x150mmm 1 balanza analítica 1 vidrio de reloj 1 espátula metálica 1 pipeta volumétrica de 10 mL indicador de azul de bromotimol (solución alcohólica al 0.4% p/v) NaOH en perlas grado analítico HCl concentrado grado analítico Muestra problema ácida Muestra problema básica Espectrofotómetro Uv-Vis Procedimiento Soluciones Básicas 1. Preparar 250 mL de NaOH 0.1M, Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro. Espectrofotometrear en la zona visible del espectro electromagnético para determinar la zona de absorbancia óptima. Configurar la medición para que el equipo muestre e imprima la curva de calibración. 2. Repetir la lectura usando esta vez la longitud de onda apropiada. 3. A partir de la disolución del punto anterior, preparar 10 mL de NaOH 0.01M. Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro y espectrofotometrear a la longitud de onda óptima de absorbancia. 4. A partir de la disolución del punto 2 o del punto 1, preparar 10 mL de NaOH 0.001M. Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro y espectrofotometrear a la longitud de onda óptima de absorbancia. 5. A partir de la disolución del punto 2 o del punto 1, preparar 10 mL de NaOH 0.0001M. Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro y espectrofotometrear a la longitud de onda óptima de absorbancia.
  7. 7. 7 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA 6. Con los datos obtenidos, completar la siguiente tabla: Longitud de onda óptima______nm. Disolución NaOH pH práctico pH teórico A 0.1 M 0.01 M 0.001 M 0.0001 M 7. Con los datos obtenidos durante el desarrollo de la práctica elaborar una curva de calibración, extrapolando absorbancia contra concentración. 8. Medir la absorbancia de la muestra básica entregada a cada grupo. Utilizando los datos de la tabla anterior calcular la concentración de la disolución problema: Disoluciones Ácidas Procedimiento 1. Preparar 250 mL de HCl 0.1M, Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro. Espectrofotometrear en la zona visible del espectro electromagnético para determinar la zona de absorbancia óptima. Configurar la medición para que el equipo muestre e imprima la curva de calibración. 2. Repetir la lectura usando esta vez la longitud de onda apropiada. 3. A partir de la disolución del punto anterior, preparar 10 mL de HCl 0.01M. Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro y espectrofotometrear a la longitud de onda óptima de absorbancia. 4. A partir de la disolución del punto 2 o del punto 1, preparar 10 mL de HCl 0.001M. Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro y espectrofotometrear a la longitud de onda óptima de absorbancia. 5. A partir de la disolución del punto 2 o del punto 1, preparar 10 mL de HCl 0.0001M. Trasvasar 4 mL de esta disolución a un tubo de ensayo de 16x150mm previamente lavado y seco, medir el pH y luego agregar 2 gotas de azul de bromotimol, transferir el contenido del tubo de ensayo a una celda de vidrio del espectrofotómetro y espectrofotometrear a la longitud de onda óptima de absorbancia. 6. Con los datos obtenidos, completar la siguiente tabla: Disolución HCl pH práctico pH teórico A 0.1 M 0.01 M 0.001 M 0.0001 M 7. Con los datos obtenidos durante el desarrollo de la práctica elaborar una curva de calibración, extrapolando absorbancia contra concentración. 8. Medir la absorbancia de la muestra ácida entregada a cada grupo. Utilizando los datos de la tabla anterior calcular la concentración de la disolución problema:
  8. 8. 8 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Cuestiones 1. Elaborar una tabla con por lo menos 10 indicadores ácido base, donde se involucre los cambios de color de acuerdo con el pH. 2. Escribir las estructuras moleculares de por lo menos 5 indicadores colorimétricos empleados con frecuencia en titulaciones por neutralización. Referencias Brown, T. L., LeMay, H. E., Bursten, B. E. y Burdge, J. R. 2004. Química. La Ciencia Central. 9ª edición. México, Pearson Educación. McMurray, J. E. y Fay, R. C. 2009. Química General- 5a edición. México, Pearson Prentice Hall. Petrucci, R. H., Harwood, W. S. y Herring, 2008. Química General. 8a edición, ultima reimpresión.Madrid, Pearson, Prentice Hall Rubinson, J. F. y Rubinson, K. A. Química Analítica Contemporánea. 2007. México, Pearson Educación.
  9. 9. 9 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Práctica de laboratorio No. 2. Titulación Ácido-Base con Bureta Digital Objetivo Determinar la concentración de una disolucíon problema mediante titulación con NaOH 0.5M Materiales Y Reactivos 1 bureta digital de 50 mL 1 pH-metro digital 2 erlenmeyer de 250 mL 2 matraces aforados de 250 mL 1 balanza analítica 0.1 mg 1 agitador magnetico 1 espátula metálica fenolftaleina solución alcohólica NaOH Disolución acida problema Marco Teórico Para empezar se hace necesario describir los componentes y funciones de una bureta digital, este utensilio de nueva generacion, diseñado para medir volumenes precisos de disoluciones en forma de goteo asistido por un sistema electrónico. Con respecto a la bureta convencional de vidrio con llave del mismo material o de teflón, permite además de medir volúmenes precisos, efectuar recargas del titulante de manera fácil y rápida con el subsecuente ahorro de tiempo sin sacrificio de precisión. La precisión del equipo se clasifica dentro los límites de errror de clase A. Esta condición se obtiene gracias a las funciones incorporadas, las cuales se describern a continuación. Al mantener presionada la tecla CLEAR ubicada en la parte superor de la bureta, se accede a 4 funciones diferentes, a saber: 1. Ajustes con Easy Calibration Para acceder a esta técnica denominada Easy Calibration basta con encender la bureta y oprimir durante 5 segundos la tecla CLEAR. Estos ajustes se efectúan cuando el equipo se use durante periodos largos de tiempo, o cuando se cambien piezas. El usuario visualiza el ajuste en el visor de forma permanente, tal como se muestra en la gráfica No. 2.1. Gráfica No. 2.1. Ajuste de la calibración
  10. 10. 10 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA 2. Preselección de la fecha de calibración Para recordar la fecha de la próxima calibración de forma segura, simplemente se almacena en la posición "GLP". Se puede acceder a la fecha de calibración cada vez que se conecta el aparato. Para ello, mantener presionada la tecla Conectar/Desconectar (On/Off)durante un corto tiempo. Se visualizará, uno tras otro, la GLP, el año y el mes de la fecha indicada, tal como se ilustra en la gráfica No. 2.2. Gráfica No. 2.2. Calibración de la fecha de calibración. 2. Ahorro de energía con Auto-Power-Off Durante interrupciones prolongadas de utilización, el aparato se desconecta automáticamente. El valor de la indicación actual se almacena y, después de la reconexión manual, vuelve a visualizarse. En la posición “APO” (Auto-Power-Off) puede ajustar el tiempo hasta la desconexión automática desde 1 hasta 30 minutos, tal como se ilustra en la gráfica No. 2.3. Gráfica No. 2.3. Uso del sistema de ahorro de energía. Selección de cifras decimales, Para la utilización como microbureta, en la posición "dP"(decimal point) es posible conmutar la indicación del volumen valorado de 2 a 3 cifras decimales. A partir de 20,00 mL se visualizan 2 cifras decimales automáticamente. Con la bureta acoplable a frascos Titrette® se pueden realizar valoraciones gota a gota con gran sensibilidad y máxima precisión. Esta función es importante para todos los usuarios quienes requieren trabajar con buretas de vidrio dentro de los límites de error de la clase A según DIN EN ISO 385 (p.ej. en la industria farmacéutica). Si fuera necesario, con 3 cifras decimales hasta 20 mL. A continuación en la tabla 1.1, se muestran los límites de error de la bureta digital, comparados con aquellos de la bureta de vidrio tipo A.
  11. 11. 11 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Tabla No. 1.1 Límites de error de la bureta digital Limitaciones de empleo Para obtener mediciones con gran precisión se deben tener en cuenta los siguientes parámetros: Temperatura= +15 °C a +40 °C (59 °F a 104 °F), tanto del aparato como del reactivo Presión de vapor hasta 500 mbar Viscosidad hasta 500 mm2 /s Altitud: máxima de trabajo. 3000 m sobre el nivel del mar Humedad relativa del aire: entre el 20% y el 90% Limitaciones de uso No se pueden realizar valoraciones con Hidrocarburos fluorados y clorados o sustancias productoras de precipitados o sedimentos pueden dificultar o imposibilitar el desplazamiento del émbolo, generando condiciones de deterioro del equipo. De otra parte debe advertirse que el aparato no es autoclavable La bureta puede usarse con las siguientes sustancias en disolución con una concentración máxima 1 M, Brand, 2012: Sustancias químicas (1.0 M) de uso seguro con la bureta Ácido Acético Arsenita Sódica Sulfato Cérico Ácido Clorhídrico Cloruro De Bario Sulfato De Zinc Ácido Clorhídrico En Acetona Dicromato De Potasio Sulfato Ferroso Amoníaco Ácido Nítrico Edta Sulfato Ferroso Ácido Oxálico Hidróxido De Amónio Tetra-N- Butílico Tiocianato De Amonio Ácido Perclórico Hidróxido De Potasio Tiocianato Potásico
  12. 12. 12 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Ácido Perclórico, En Ácido Acético Hidróxido De Sodio Tiosulfato Sódico Ácido Sulfúrico Nitrato De Plata Trietanolamina En Acetona Bromato De Potásico Nitrito De Sódio Yodato Potásico Bromato-Bromuro De Potásico Permanganato De Potasio Yodo Bromuro-Bromato Potasio Hidróxido Alcohólico Yoduro-Yodato Carbonato De Sódio Sodio Cloruro http://www.brand.de/fileadmin/user/pdf/Leaflets/Titrette_ES.pdf La manipulación correcta del equipo le permite al líquido dosificado, entrar en contacto con los materiales químicamente resistentes de los cuales está construido: vidrio de borosilicato, Al2O3, ETFE, PFA, FEP, PTFE, Platino-iridio; PP (caperuza a rosca). La bureta digital presentada trabaja con límites de error aproximados de 0,002 en los primeros 20 mL de valoración, a partir de este volumen el límite de error se ubica aproximadamente en 0,01 mL, valores ubicados dentro de los límites permisibles de la norma DIN ISO 8655-3, Limitaciones de empleo  El aparato se emplea para valoraciones teniendo en cuenta los siguientes límites físicos:  +15 °C a +40 °C (59 °F a 104 °F) del aparato y del reactivo  Presión de vapor hasta 500 mbar  Viscosidad hasta 500 mm2/s n Altitud: máx. 3000 m sobre el nivel del mar  Humedad relativa del aire: de 20% a 90% Bureta acoplable a frascos Titrette®, con certificado de conformidad, certificado de calidad, además incluye: tubo de aspiración telescopico (longitud 170 - 330 mm), tubo para dosificación inversa, 2 microbaterías de 1,5 V (AAA/UM4/LR03), 3 adaptadores de PP para frascos (GL 45/32, GL 45/S 40, GL 32/NS 29/32), 2 visores de inspección topacios de protección contra la luz, instrucciones de manejo. Condiciones de almacenamiento Almacene el aparato y los accesorios en lugar seco. Temperatura de almacenamiento: -20 °C a +50 °C Humedad relativa del aire: 5% a 95% En la gráfica No. 2. 4, se describe una bureta digital de 50 mL-
  13. 13. 13 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Gráfica No. 2.4. Descripción de una bureta digital de 50 mL Tecla CLEAR / Selección Tecla Pausa Tornillo dosificador Émbolo Cilindro dosificador Válvula de valoración y de purga Caperuza o tapón a rosca Encender/Apagar Tubo telescópico de aspiración Rosca para frasco Pantalla digital Cánula de valoración ajustable en forma horizontal o vertical, con válvula de salida integrada
  14. 14. 14 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Procedimiento 1. Utilizando los datos de pureza consignados en la etiqueta del frasco de embalaje, prepara 100 mL de NaOH 0.5 M, los cuales se utilizarán como disolución titulante, mide el pH para comprobar la concentración. 2. Una vez insertada la cánula o tubo telescópico de aspiración en la válvula de aspiración inferior de la bureta, llena el frasco dispensador inferior con agua destilada hasta la mitad de su capacidad. Gira a la izquierda la valvula de valoración de color rojo para impedir la salida del agua por la cánula de valoración, tal como se muestra en la gráfica No. 2.5: Gráfica No. 2.5. Posición de la válvula de lavado. 3. Gira el tornillo de dosificación derecho en el sentido de las manecillas del reloj para permitir el ascenso del agua al cilindro dosificador; una vez lleno este cilindro, gira el tornillo dosificador en el sentido contrario para obligar la salida del agua hacia el frasco dispensador. Repite esta operación unas cinco veces, asegurándote en la ultima vez de evacuar toda el agua destilada del cilindro dosificador. 4. Desacopla el frasco dosificador y en su lugar acopla otro con la disolución titulante la cual EN NINGUN CASO PUEDE EXCEDER la concentración 1M (Un mol de soluto /litro de disolución). En lo posible usa concentraciones inferiores a 1M para evitar el deterioro prematuro de las partes de la bureta digital. Una vez trasvasado el titulante debes purgar la bureta, para ello abre la válvula de valoración girándola hacia la derecha, tal como se ilustra en la gráfica No. 2.6. Válvula de valoración hacia la izquierda para proceder al lavado
  15. 15. 15 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Gráfica No. 2.6 Posición de la valvula para purgar la bureta. Ahora se coloca un beaker de 100 mL debajo de la cánula de valoración, retira la caperuza o tapón y procede a girar el tornillo dosificador para desalojar unos mililitros del titulante, evacuando todas las burbujas de aire atrapadas en el ducto plástico y en el cilindro de dosificación. 5. Con una pipeta volumetrica, trasvasa una alícuota de solución ácida problema a un erlenmeyer de 100 mL lavado y seco; añade 2 o 3 gotas del indicador respectivo e introduce un iman y el electrodo del pH-metro para medir el pH inicial tal como se muestra en la gráfica No. 2.7. Gráfica No. 2.7. Montaje para titulación con bureta digital Válvula de valoración hacia la izquierda para proceder al lavado
  16. 16. 16 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA 6. Pulsa la tecla CLEAR para dejar la pantalla en 0.00, inicia la titulación girando el tornillo dosificador en el sentido inverso de las manecillas del reloj, ajusta la velocidad del goteo y permite la transferencia del 1 mL, en este instante pulsar la tecla PAUSA y medir el pH resultante. Repite esta operación mL a mL hasta alcanzar el punto de equilibrio, donde la solución ácida vira a un color fucsia muy pálido, luego agrega mL a mL unos 4 mL adicionales de titulante y por igual mide el pH. Con los datos obtenidos completa la siguiente tabla: NaOH 0.5 M añadidos pH [H+ ] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Referencias Brand, 2012. Catalogo, documento consultado el 12 de agosto de 20212, en : http://www.brand.de/fileadmin/user/pdf/GA/GA_Titrette_DE-EN-FR-ES-IT.pdf
  17. 17. 17 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVAEZ ZAMORA Practica de Laboratorio No. 3. Soluciones Buffers y Curvas de Titulación Objetivo Preparar un buffer de acetatos y demostrar su capacidad de amortiguamiento. Marco Teórico Una disolución buffer es la combinación de un par conjugado (un ácido débil con una base fuerte o una de sus sales o también una base débil y su sal), capaz de resistir cambios de pH cuando se añaden iones H+ u OH- Al valorar un ácido débil con una base fuerte se observa que el cambio de pH es mínimo generando una zona plana en la curva de titulación en cuyo centro se ubica el punto de equilibrio; esta es la zona de tamponamiento, fuera de ella los cambios de pH son significativos. En el punto de equilibrio la capacidad de tamponamiento es máxima, aquí la concentración del aceptor de protones se iguala a la concentración del dador de protones, haciendo el pH = pKa. La capacidad de tamponamiento disminuye a medida del aumento o disminución del pH porque cambia la proporción en la concentración del dador y el aceptor de protones, entendidos estos como átomos de hidrógeno desnudos o H+ Al mezclar una base fuerte con un ácido débil, midiendo el pH resultante, se puede dibujar un gráfico del pH en función de la cantidad de base añadida y esto se conoce como curva de titulación. En la siguiente grafica se muestran cuatro curvas, tres de ellas con la misma forma y la del HCl un tanto diferente, tal com se muestra en la gráfica No. 3.1 mL de NaOH 0.1M añadidos Gráfica No. 3.1 Curvas de titulación soluciones de algunos ácidos 0.1M Todas las curvas de titulación de bases o ácidos débiles son similares. La razón, se comportan como soluciones amortiguadoras cuyo pH tiende a no cambiar en la zona de tamponamiento de acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbalch. Es importante recalcar que cada especie química, en disolución acuosa tiene un pKa pH Punto de equivalencia12 8 4 HCl CH3COOH CH3COO - + H + pka = 4.76 H2PO - 4 HPO4 2- + H + pka = 7.2 HCN CN - + H + pka = 9.1
  18. 18. 18 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Valor Amortiguador Las soluciones buffer difieren en su capacidad para resistir los cambios en el pH, esto condujo a Van Slike a introducir el concepto de VALOR AMORTIGUADOR para comparar diferentes soluciones amortiguadoras. Cuando se agrega un álcali o un ácido a una solución amortiguadora se obtiene una curva de titulación, cuya pendiente está dada por B(pH), donde B es el incremento de la concentración de ácido o base fuerte agregados en mol/l y (pH) es el incremento del pH, ésta pendiente es el VALOR AMORTIGUADOR que siempre se positivo debido a que el B es negativo. El hecho de agregar ácido produce un cambio negativo en el pH y el valor amortiguador máximo se alcanza en el pka. Materiales y Reactivos 1 Matraz aforado de 250 mL pH-metro 1 pipeta de 1 mL NaOH en perlas 1 micropipeta 100-1000L CH3COOH glacial 1 bureta digital de 50 mL HCl concentrado 1 Erlenmeyer de 100 mL Erlenmeyer de 50 mL 1 beaker de 100 mL Agitador magnético 1 Beaker de 50 mL Fenolftaleina Procedimiento 1. Prepara 250 mL de KOH 0.1 M 2. Prepara 50 mL de CH3COOH 0,002 M 3. Trasvasa una alícuota de 20 o 25 mL de la disolución del punto 2 a un erlenmeyer de 100 mL, adiciona 2 o 3 gotas de fenolftaleína. 4. Lava la bureta digital unas 5 veces y comprobar su funcionamiento óptimo. Desalojar toda el agua usada para el lavado. Ahora transfiere toda a disolución del punto 1 al frasco de la bureta, purga la bureta y enrásala a 0.00 mL. 5. Titula mL a mL y completa la siguiente tabla: mL KOH añadidos pH [H+ ] pOH [OH- ] [HAc] Ka pKa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
  19. 19. 19 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Cuestiones 1. Completar el siguiente tabla: Color del Indicador INDICADOR ACIDO BASE Pka Límite útil de pH Azul de timol Azul de bromofenol Rojo de metilo Bromocresol púrpura Rojo de fenol Fenolftaleina Describir adicionalmente el proceso para preparar estos indicadores en el laboratorio. 2. Determinar el procedimiento para preparar una solución de los anteriores indicadores potencialmente útiles en la identificación de buffers. 3. Calcular el pH del buffer preparado en la práctica, si a 100 mL de él se le agregan por separado 2 mL de HNO3 0.01M y 3 mL de NH4OH 0.1 M. Referencias Bioquímica y biología molecular. 1999. Facultad de medicina UNAM, departamento de bioquímica. Bohinski, Robert. C. 2004. Bioquímica. Quinta edición. Editorial Addison Wesley Longman. Mexico. Conn, Eric. Stupmpf. P. 1991. Bioquímica Fundamental. 3ª ed. México: Limusa. Devlin, Thomas. 2004. Bioquímica aplicada con implicaciones clínicas. 4a ed. Barcelona: Reverté. Horton, Robert.H. Moran, Laurence. OCHS, Raymond. RAWN, J. David..Scrimgeour, K. Gray. 2007. Bioquímica. 4ª ed. México: Prentice Hall Hispanoamericana. S.A. Kerridge, David. Tipton, Keith. 1980. Razonamiento Bioquímico. Zaragoza: Acribia. Lehninger, Albert. L. 2002. Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Segunda edición. Barcelona: Omega S.A. Lozano, J.A., Galindo J.D. y otros. 2005. Bioquímica y Biología Molecular. Buenos Aires: McGraw Hill Miguez, O. Jose Bernardo. 1992Practicas de Bioquímica. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Tunja. Boyacá,. Murray, Robert. K. Granner, Daryl. K. Mayes, Peter. A. Rodwell, Víctor. W. 2010. Bioquímica de Harper., Vigésimo octava edición, México: El Manual Moderno.
  20. 20. 20 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Plummer, David. 1981. Bioquímica Práctica. Chelsea College, University of London. Trad: Barrera, Luis Alejandro. Revisión: Corredor Carlos. Universidad del Valle. Bogotá: Mac- Graw Hill Latinoamericana. S:A: Rendina, George. 1974. Técnicas de Bioquímica Aplicada. Trad, Folch Fabre, Roberto. México:Interamericana. Roskoski, Robert. Jr. 1998. Bioquímica. México: McGraw Hill Interamericana. Stryer, Lubert. Bioquímica. Tomos I y II. Sexta edición. Editorial Reverte. Barcelona, 2008. Sitios de interés en Internet: http://www.biochemicalabstracs.com http://www.chemicalabstracs.com
  21. 21. 21 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Guía de Laboratorio No. 4 Propiedades Químicas de los Aminoacidos Objetivo Demostrar algunas propiedades químicas de los aminoácidos, mediante reacciones cualitativas propias del grupo amino. Marco Teórico La presencia de los grupos amino y carboxilo le comunican a los aminoácidos comportamiento ácido-básico; aunque existe una gran variedad de ellos, solo 20 forman -aminoácidos, es decir, el grupo amino se encuentra enlazado al carbono alfa central de cada uno de ellos. El carbono alfa es un átomo asimétrico o quiral (a excepción del caso de la glicina), por tanto general isómeros dextrógiros y levógiros, estos últimos integran las proteínas. En disoluciones acuosas con pH neutro, las dos formas isoméricas de los aminoácidos existen como iones dipolares denominados zwitteriones (iónes híbridos), donde el grupo amino se encuentra protonado (-NH3)+ y el grupo carboxilo está desprotonado (-COO- ).y su grado de disociación cambia de acuerdo al pH circundante Por lo general un aminoácido a través de su grupo amino se enlaza al grupo carboxilo del segundo y así sucesivamente hasta formar largas cadenas polipeptídicas propias de cada proteína; este enlace es de tipo éster y se denomina enlace peptidico, es decir, los aminoácidos químicamente se comportan como sales orgánicas. Todos los aminoácidos se comportan como aminas primarias a excepción de la Pro, único iminoácido de la serie protéica. Por igual el radical R o cadena lateral de los aminoácidos varían en tamaño, forma, carga, capacidad de formar puentes de hidrógeno, carácter hidrofílico-hidrofóbico y reactividad química, Berg, Tymoczko y Stryer, 2008. Así los aminoácidos tienen radicales: Alifáticos: Gli, Ala, Val, Leu e Ile Hidroxílicos: Ser y Thr. Sulfurados: Cys, Cys-Cys y Met. Acídicos: Asp y Glu Básico: Lis y Arg Aromáticos: Phe y Tyr Heterocíclicos: Trp y His Iminoácidos: Pro e H-pro Propiedades Químicas de los Aminoácidos El grupo carboxilato de los aminoácidos los obliga a comportarse como ácidos carboxílicos produciendo todos sus derivados característicos: ésteres, amidas, anhídridos y haluros de ácido, reacciones no incorporadas en este apartado. A continuación se presentan las reacciones más significativas correspondientes al grupo amino, entre ellas las siguientes:
  22. 22. 22 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA 1. Reacción Xantoprotéica Los aminoácidos con radicales aromáticos reaccionan en caliente con el ácido nítrico concentrado para formar productos nitroderivados de color amarillo y sus sales se caracterizan por el color anaranjado. Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L), como mínimo, HNO3 concentrado, NaOH 10M, Fenol (1 g/L). Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo y gradilla Procedimiento Trasvasa 0.5 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, agrega 0.5 mL de ácido nítrico concentrado a cada uno, deja enfriar y observa el cambio de color. Seguidamente agrega suficiente NaOH 10 M hasta alcanzar alcalinidad elevada para cambiar el color amarillo inicial hasta anaranjado brillante, prueba de la formación de la sal correspondiente. Repite la prueba con solución de fenol. 2. Reacción de Millón Los derivados fenólicos reaccionan con el mercurio en medio ácido para formar compuestos de color rojo. Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L) . como mínimo. Reactivo de Millón (solución de HgSO4 150 g/L en H2SO4 15% v/v, también se puede preparar disolviendo 50 g de Hg(NO3)2. en 100 mL de HNO3 concentrado. En su defecto disolver 5 g de Hg en 10 mL de HNO3 concentrado y luego agregar 15 mL de agua, agitar y dejar en reposo durante 12 horas ), Fenol (1 g/L), NaNO2 (10 g/L) Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo y gradilla, beaker de 250 mL. Procedimiento Trasvasa 0.5 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, usa también 0.5 mL de fenol, agregar.5 gotas del reactivo de Millón, calienta en baño de agua hirviendo durante 10 minutos, deja enfriar y agrega 5 gotas de solución de NaNO2, la generación de un color rojo ladrillo es prueba de un resultado positivo. 3. Reacción del ácido glioxilico El grupo indol reacciona con el ácido glioxílico (ácido oxoacético, u ácido formilfórmico) C2H2O3 en medio ácido para dar un derivado de color púrpura. El ácido glioxílico se obtiene exponiendo al ácido acético durante varias horas a la luz solar. Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L) como mínimo. H2SO4concentrado, Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo y gradilla, beaker de 250 mL, malla de asbesto. Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, agrega 2 mL de ácido glioxilico o en su defecto de CH3COOH, ahora deja resbalar por las paredes del tubo, 2 mL de H2SO4 concentrado, la generación de un anillo de color violeta es prueba de un resultado positivo.
  23. 23. 23 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA 4. Reacción de Pauly Las aminas, fenoles e imidazoles reaccionan con el ácido sulfanílico diazotizado para formar complejos coloreados. Para esta reacción las soluciones deben enfriarse en baño de hielo porque los compuestos diazonio solo se forman en frío. Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L) como mínimo. Ácido sulfanílico (10 g/L en HCl 1 M), NaNO2 50 g/L Na2CO3 (10 g/L., Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo y gradilla, beaker de 250 mL, Beaker de 100 mL, hielo. Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, agrega.1 mL de solución de ácido sulfanílico y 1 mL de solución de NaNO2, enfria en baño de hielo durante 4 minutos; alcaliniza agregando 2 mL de Na2CO3. La generación de colores es considerada prueba positiva. 5. Reacción de Ehrlich El p-dimetilaminobenzaldehído reacciona con aminas aromáticas, índoles y compuestos uréicos para formar complejos coloreados característicos. Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L) como mínimo. Reactivo de Ehrlich (p- dimetilaminobenzaldehído 100 g/L en HCl concentrado), HCl concentrado, Solución de urea (1 g/L) Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo, gradilla. Procedimiento Trasvasa 0.5 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, usar también solución de urea. Agregar 2 mL del reactivo de Ehrlich, observa las coloraciones formadas. 6. Reacción del nitroprusiato El Na2Fe(CN)5NO en exceso de amoniaco reacciona con los grupos –SH para formar derivados de color rojo. Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Cys, Met, Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L) como mínimo. Nitroprusiato de Na 20 g/L (úsese recién preparado) Solución de NH4OH concentrado, KCN o NaCN 1g/L Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, agrega 0.5 mL de solución de nitroprusiato a cada uno y añade 0.5 mL de amoníaco concentrado, observa las coloraciones formadas. 7. Reacción de Sakaguchi Los grupos guanidínicos reaccionan con naftol en presencia de un agente oxidante como el agua de bromo generando un derivado de color rojo.
  24. 24. 24 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Arg, Cys, Met, Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L), como mínimo. usa por igual solución de urea (1 g/L) Solución denaftol (10 g/L en etanol absoluto), Agua de bromo, NaOH 10M Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, agrega 0.5 mL de solución de NaOH 10M a cada uno y añade 3 gotas de solución de naftol, observa las coloraciones formadas. 8. Reacción con el HNO2 Todos los aminoácidos a excepción de la Pro, reaccionan con el HNO2 para formar el correspondiente -hidroxiácido y nitrógeno gaseoso, medible por manometría. Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Pro, Arg, Cys, Met, Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L), como mínimo. Solución de HNO2 concentrado Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo, gradilla. Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solución de aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, agrega 0.5 mL de HNO2 concentrado a cada uno, observa el desprendimiento de burbujas de nitrógeno gaseoso. 9. Reacción de Sörensen El grupo amino reacciona con el formaldehido para formar N:N-dihidrometilderivados Reactivos: Colección de aminoácidos disponibles en el laboratorio incluyendo soluciones de Pro, Arg, Cys, Met, Gli, Tir Phe y Trp,(1 g/L), como mínimo Solución de formol 50% p/v Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo, gradilla, beaker 250 mL Trasvasa 1 mL de cada aminoácido disponible en sendos tubos de ensayo, agrega 0.5 mL de formaldehído a cada uno, calienta en baño de agua a 80º C durante 3 minutos. Observa los cambios ocurridos. Reacciones generales de las proteínas 1. Reacción de Biuret para enlaces peptídicos Aunque la prueba del Biuret no es exclusiva para los enlaces peptídicos, también funciona con compuestos con dos grupos carbonilo unidos a un átomo de nitrógeno o de carbono. La reacción del CuSO4 en medio alcalino con compuestos con 2 o más enlaces peptídico para dar un complejo de color violeta, cuya intensidad depende de la cantidad de enlaces peptídico presentes. Reactivos: Soluciones de algunas proteínas como albúmina, caseína, gelatina, peptona,(1 g/L), como mínimo. Solución de CuSO4.5H2O (10 g/L), Agua de bromo, NaOH 10M, glutatión (5 g/L). Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo
  25. 25. 25 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solución de solución de proteínas disponibles en sendos tubos de ensayo, añade 3 gotas de solución de CuSO4, y luego 1 mL de NaOH 10M, observa las coloraciones formadas. 2. Precipitación por metales pesados Las proteínas se encuentran cargadas a pH neutro y ligeramente por encima de él; al agregar cationes de metales, la carga se neutraliza y se produce una precipitación. Si el pH es muy alcalino se precipitan los hidróxidos de os metales involucrados. Reactivos: Soluciones de algunas proteínas como albúmina, caseína, gelatina, peptona,(1 g/L), como mínimo. Solución de metales pesados como: CuSO4.5H2O, Pb(NO3)2 y Hg(NO3)2 (0.1 M), Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solución de proteínas disponibles en sendos tubos de ensayo, añade 3 gotas de solución de CuSO4,Pb(NO3)2 y Hg(NO3)2 y luego 1 mL de NaOH 10M, observa las reacciones formadas. 3. Precipitación de proteínas por reactivos acídicos. A pH ácido, algunos compuestos acídicos poseen carga negativa enorme, capaz de neutralizar a las proteínas cargadas positivamente para formar una sal insoluble y fácilmente detectable. Reactivos: Soluciones de algunas proteínas como albúmina, caseína, gelatina, peptona,(1 g/L), como mínimo. Solución de ácido sulfosalicíco ( 20% p/V), ácido pícrico saturado ( 10 % p/v), ácido tánico y ácido tricloroacético (20% p/v), NaOH 1 M Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 2 mL de cada solución de proteínas disponibles en sendos tubos de ensayo, añade 5 gotas de solución los reactivos acídicos disponibles, agrega algunas gotas de NaOH 1 M, observar las reaccciones formadas. 4. Reacción de Folin-Lowry Al igual que en la reacción del Biuret, donde las proteínas reaccionan con el CuSO4 alcalino, también pueden reaccionar con fosfomolibdato de sodio para dar complejos coloreados cuya intensidad depende del número de aminoácidos aromáticos. Reactivos: Soluciones de algunas proteínas como albúmina, caseína, gelatina, peptona,(1 g/L), como mínimo. Solución alcalina de Na2CO3 (20 g/L en NaOH 0.1M, solución de cobre-tartrato sódico potásico (5 g/L CuSO4. 5H2O en tartrato sodio potásico 10 g/L, usa las dos soluciones recién preparadas), Solución alcalina preparada usando 50 mL de la solución alcalina de carbonato de sodio y 1 mL de la solución de cobre tartrato sódico potásico. reactivo de Folin Ciocalteau (Tungstato de sodio y molibdato de sodio en H3PO4 y HCl concentrados de ácido sulfosalicíco ( 20% p/V), ácido pícrico saturado ( 10 % p/v), ácido tánico y ácido tricloroacético (20% p/v), NaOH 1 M
  26. 26. 26 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Materiales: Pipetas de 10 mL, pipetas de 5 mL, tubos de ensayo Procedimiento Trasvasa 1 mL de cada solución de proteínas disponibles en sendos tubos de ensayo, añade 5 mL de la solución alcalina, agitar vigorosamente y deja reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, agrega 0.5 mL de reactivo de Folin-Cicateau en forma rápida y observa las reacciones formadas. Cuestiones 1. Plantea las ecuaciones de las reacciones ocurridas durante la realización de la práctica de laboratorio. 2. Plantea el fundamento teórico, los materiales y reactivos necesarios para realizar la prueba de Sanger. 3. Determina el valor funcional de algunos péptidos como hormonas, antibióticos y enzimas. 4. Describe brevemente algunos mecanismos para determinar la estructura de los péptidos. Referencias Baynes, J. W.; Dominczak, M. H.(2011). Bioquímica médica. 2ª edición. Revisión Sabría, M. J. Elsevier España, S.A. Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Concepts in Biochemistry 2ª edición (2002) R.F. Boyer. Ed. Wiley-Liss. Devlin, T. M. (2000) .Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas 3ª edición. Reverté. Feduchi, Blasco, Romero, y Yáñez, (2010). Bioquímica, Conceptos esenciales. Editorial Médica Panamericana Flores, L. J. (2008). Manual de prácticas de bioquímica. 2ª edición. México: McGraw-Hill. Gómez, C. r y Sanz, J. (coordinadores). (2003) Estructura de proteínas. Ariel Ciencia. Horton, H.R. Moran, L. A. Ochs, R. S. Rawn, D. K. Scrimgeour, G. (2002). Bioquímica. 3ª edición. Prentice Hall. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Barcelona: Omega. Luque, J. y Herráez, A. (2001).Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Harcourt. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté.
  27. 27. 27 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Mathews, C.K. van Holde, K.E., Ahern.K.G. (2002) Bioquímica. 3ª Edición. Pearson, Educación S.A. Nelson, D. L. y Cox, M. M. (2000) Principios de Bioquímica 3ª edición Editorial Omega- Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana. Rendina, G. (1974): Técnicas de bioquímica aplicada, México: Interamericana, , 1974. Stryer, L Berg, J. M.y. Tymoczko, J.L (2003) Bioquímica. 5ª Edición.Ed. Reverté- T. Mckee, T. y Mckee. J.R. (2003). Bioquímica. La base molecular de la vida. 3ª edición. McGraw-Hill. Voet, D. VoetJ.G. (1995)Biochemistry. 2ª edition. Wiley & Sons. Voet, D. Pratt, C. VoetJ.G. (2002). Fundamentals Biochemistry Update. Wiley & Sons. Voet, J. G. y Voet, D. (2006). Bioquímica. 3ª edición. Editorial Médica Panamericana S.A
  28. 28. 28 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Profesor: LUIS JAVIER NARVÁÉZ ZAMORA BIOQUÍMICA Práctica De Laboratorio No. 5. Cuantificación de Proteínas y Aminoácidos Marco Teórico Una de las tareas más frecuentes en la investigación bioquímica es además de la identificación, la cuantificación de biomoléculas; para el caso específico de las proteínas y los aminoácidos, la técnica más apropiada es la colorimetría y en especial una variante de ella, la espectrofotometría. La técnica se basa en la propiedad que tienen las moléculas de absorber energía cuando son sometidas al influjo de campos electromagnéticos, todas las moléculas, incluidas las biomoléculas al recibir una determinada cantidad de energía, absorben parte de ella (absorbancia o extinción) y dejan pasar el resto de la misma (tramitancia). Generalmente, las disoluciones de las proteínas y los aminoácidos carecen de color, razón por la cual se requiere hacerlas reaccionar con sustancias capaces de generar algún tipo de coloración, a través de la cual se pueda identificarlas y cuantificarlas sin tener que extraerlas de mezclas complejas donde usualmente se encuentran como por ejemplo en los tejidos. De todas formas, para estas reacciones coloreadas, la intensidad del color depende de la concentración de las biomoléculas en estudio y esta concentración a su vez define tanto la absorbancia como la tramitancia ocurridas. El fenómeno de la absorbancia y la tramitancia se fundamenta en la ley de Beer- Lambert, al cual se puede resumir de la siguiente manera: al hacer pasar un haz de luz monocromática con una determinada intensidad Io a través de una sustancia, ésta absorbe parte de la energía incidente y deja pasar el excedente: A = 2- log T donde a= absorbancia y T = tramitancia. La relación entre la absorbancia y la tramitancia depende de la longitud (l) del medio o celda donde se encuentre confinada la sustancia a medir y de su concentración: Materiales Y Reactivos Disoluciones patrón al 2% de proteínas y aminoácidos disponibles en el laboratorio ( caseína, albúmina, peptona, gelatina, Ala, Arg, Cys, Gli, Tir Phe y Trp). Reactivo de Biuret, espectrofotómetro Uv-Vis, muestra problema de aminoácido y de proteína. Procedimiento 1. Cada grupo recibe una muestra de disolución tanto de aminoácido como de una proteína, posteriormente a cada una le aplicará la prueba de Biuret u otra señalada por el profesor. 2. Inicialmente deben establecer la longitud de onda de máxima absorbancia para cada patrón, con esa longitud de onda se deben obtener sendos espectros para diluciones 1:1, 1:5, 1:10 y 1:15 estableciendo la curva de calibración respectiva. Para evitar márgenes de error elevados, la adición del reactivo seleccionado para esta práctica debe hacerse manejando el mismo tiempo para cada uno de los ensayos. 3. Una vez establecida la curva de calibración correspondiente a las disoluciones preparadas a partir del patrón inicial, mide la absorbancia o la tramitancia de las muestras
  29. 29. 29 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA entregadas al grupo y a través de la pendiente de la curva, establece la concentración de cada muestra. Cuestiones Aplicativas 1. Establecer una relación aritmética entre la absorbancia y la concentración de cada dilución de muestra (aminoácido y proteína). Presentar la curva de calibración. 2. Utilizando la curva de calibración, calcular la concentración de las dos muestras problema entregadas a cada grupo. 3. Determinar posibles causas de errores ocurridos durante el desarrollo de la práctica. 4. Explicar las leyes de Beer, de Lambert y unificar sus enunciados para explicar los hechos ocurridos durante el desarrollo de la práctica. Referencias Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana.
  30. 30. 30 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Profesor: LUIS JAVIER NARVÁÉZ ZAMORA BIOQUÍMICA Práctica de Laboratorio No. 6. Reconocimiento de Carbohidratos Estas biomoléculas provienen del proceso fotosintético vegetal y su importancia bioquímica radica en su poder energético del cual se deriva en gran parte el mantenimiento de la vida de todos los organismos terrestres. A nivel humano, luego de ser ingeridos en la dieta alimentaria, son transformados den glucosa, la cual es inicialmente se almacena como glicógeno y luego es oxidada hasta CO2 y H2O. Los carbohidratos a nivel molecular son aldehídos (aldosas) y cetonas (cetosas) de polihidroxialcohóles; las unidades básicas son los monosacáridos, descritos a continuación: Estas estructuras moleculares existen en la naturaleza gracias a los carbonos quirales o
  31. 31. 31 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA asimétricos, los cuales generan a su vez sus imágenes especulares o esteroisómeros. Por ejemplo el gliceraldehído tiene un carbono asimétrico y dos posibilidades de distribución de los cuatro grupos unidos a él. así, cada una de las estructuras moleculares de la gráfica anterior tiene su propio esteroisómero denominado derivado L Propiedades Químicas de los Carbohidratos La condición de aldosas y cetosas les permite exhibir algunas propiedades exclusivas para este tipo de sustancias, entre ellas las siguientes: Prueba de Molish La hidrólisis de los enlaces glicosídicos se puede lograr en medio ácido para producir monosacáridos susceptibles de deshidratación para producir furfural y sus derivados, los cuales a su vez reaccionan con -naftol produciendo un complejo de color morado característico. Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, -naftol (50 G/ L de etanol), H2SO4 concentrado. Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 2 mL de cada carbohidrato, a cada uno se añaden 2 o 3 gotas de solución de a-naftol, luego y de manera cuidadosa se deja resbalar por las paredes del tubo, 1 mL de H2SO4 concentrado hasta conseguir la formación de dos capas. La prueba es positiva con la generación de un anillo de color morado en la interfase. Prueba de la Antrona Al igual de la prueba de Molish, la prueba de antrona sirve para reconocer carbohidratos en general. El fundamento teórico de esta prueba es el mismo de la prueba anterior. Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, antrona recientemente preparada (2g/L en H2SO4 concentrado). Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 1 mL de solución de antrona, luego se agregan 5 gotas de solución de cada carbohidrato, mezclar y observar cambios de coloración; la prueba es positiva si se genera un color azul verdosa. Reacciones de Carbohidratos Reductores Los carbohidratos pueden reducir los reactivos de Fehling 0 Benedict (soluciones alcalinas de iones cúpricos, en forma de complejos, con iones tartratos 0 citratos, respectivamente) 0 de Tollen (solucion amoniacal de una sal de plata) se conocen como azucares reductores. Todos los monosacaridos (aldosas y cetosas), y la mayoría de los disacaridos, son reductores exceptuando la sacarosa. Para explicar las dos primeras pruebas, el Cu(OH)2 al ser calentado en solución alcalina forma el CuO de color negro, en presencia de sustancias reductores, el Cu(OH)2 produce Cu2O de color rojo ladrillo. En las pruebas siguientes se usa CuSO4 en solución alcalina y
  32. 32. 32 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA un compuesto orgánico con un grupo OH- para reemplazar al hidróxido cúprico. Los carbohidratos con un grupo carbonilo libre o potencialmente libre o un grupo cetónico son sustancias reductoras. Prueba de Fehling El reactivo requiere dos soluciones (Fehling A y Fehling B), las cuales se preparan por separado Fehling A: Disolver 30 g de CuSO4.5H2O en 1 Litro de agua Fehling B: Disolver 150 g de tartrato de Na y K (Sal de Rochelle) en 100 mL de agua caliente, adicionar 900 mL g de NaOH al 5% Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Fehling (mezclar volúmenes iguales de Soluciones de Fehling A y Fehling B) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 1 mL de Reactivo de Fehling, luego se agregan 1 mL de solución de cada carbohidrato, mezclar y observar cambios de coloración; la prueba es positiva si se genera un color rofo ladrillo Prueba de Benedict Esta prueba es similar a la anterior con la diferencia del uso de una sola solución. El reactivo de Benedict se prepara de la siguiente manera: Disolver 170 g de citrato de sodio y 100 g de Na2CO3 en 800 mL de agua caliente; filtrar y completar el filtrado hasta 850 mL. Por aparte disolver 17 g de CuSO4.5H2O en 150 mL de agua, añadir lentamente esta segunda solución a la inicialmente preparada. Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Benedict. Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 2 mL de cada una de laa disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, luego se adiciona 1 mL del reactivo de Benedict, a cada tubo y se hierve durante 3 minutos. Observar los cambios ocurridos y los colores generados. Prueba de Barfoed Este reactivo reduce solamente a los monosacáridos, sin embargo, cuando una disolución de disacáridos se deja hervir por tiempo considerable, estos se hidrolizan dando reacciones positivas falsas. esta prueba es similar a las de Benedict y Fehling, la diferencia es la cantidad de óxido cuproso producido, razón por la cual es necesario dejar reposar por más tiempo. Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10
  33. 33. 33 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Barfoed (Disolver 14 g de acetato de cobre en 200 mL de agua y agregar 1.5 mL de ácido acético glacial) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se depositan 2 mL de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, luego se adiciona 1 mL del reactivo de Barfoed, a cada tubo y se hierve durante 1 minuto. Observar los cambios ocurridos y los colores generados. Pruebas para carbohidratos específicos Prueba de Bial para Pentosas Las disoluciones de pentosas al ser calentadas en HCl concentrado forman furfurales, los cuales se condensan con orcinol en presencia de iones férricos generando coloraciones verde azulosas características, sin embargo con las hexosas la reacción genera complejos coloreados. Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Bial (Disolver 1.5 g de orcinol en 500 mL de HCl concentrado, luego añadir 0.5 mL de FeCl3 100g/L y agregar 1.5 mL de ácido acético glacial), Alcohol amílico Procedimiento En sendos tubos de ensayo se deposita1 mL de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, luego se adiciona 2 mL del reactivo de Bial, a cada tubo calentar hasta que se inicie la ebullición. Observar los cambios ocurridos y los colores generados.Una vez frios los tubos, agregar 0.5 mL de alcohól amílico. Prueba de Seliwanoff para Cetosas Las cetosas también se deshidratan como las aldosas para formar derivados del furfural, los cuales a su vez reaccionan con resorcinol para generar complejos coloreados rojos El tiempo de deshidratación de las cetosas es menor que el de las aldosas, por tanto el calentamiento debe ser mucho más corto al empleado en la prueba anterior. Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Seliwanoff (0.5 g de resorcinol en HCl 3 M) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se deposita1 mL de reactivo de Seliwanoff y añada 5 gotas de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, calentar en baño de agua hirviendo hasta la generación del color rojo característico de la prueba. Prueba de Lugol para Polisacáridos Los polisacáridos forman complejos coloreados de absorción con el yodo, así por ejemplo, el almidón genera un color azul muy oscuro, mientras el glucógeno o el almidón
  34. 34. 34 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA parcialmente hidrolizado generan coloraciones del tono pardo rojizo. Materiales y Reactivos Gradilla con 10 tubos de ensayo, 1 beaker de 500 mL, 1 malla de asbesto, 1 pipeta 10 mL. Soluciones 5 g/L de: Maltosa, Fructosa, glucosa(dextrosa), celulosa, arabinosa, ribosa, almidón, galactosa, manosa, gliceraldehido, almidón, celulosa, Reactivo de Lugol (5 mM en KI 30 g/L) Procedimiento En sendos tubos de ensayo se deposita1 mL de cada una de las disoluciones de carbohidratos disponible durante la práctica, adicionarles 1 mL de reactivo de Lugol calentar en baño de agua hirviendo hasta la generación del color característico de la prueba. Cuestiones 1. Plantear una ecuación para cada una de las pruebas realizadas durante la práctica. Indicar en cada caso la utilidad práctica. 2. Establecer la importancia de los carbohidratos en la biósfera y a nivel humano en particular. 3. Describir brevemente 3 enfermedades o desórdenes metabólicos derivados del metabolismo de carbohidratos. 4.Explicar la diferencia estructural de los carbohidratos D y L y los homopolisacáridos y los heteropolisacáridos. Referencias Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana.
  35. 35. 35 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Práctica de laboratorio No. 7. Pruebas Polarimétricas con Carbohidratos Objetivo Determinar la rotación específica de algunos carbohidratos Marco Teórico Los carbohidratos poseen en su estructura molecular uno o más átomos de carbono asimétrico, esta característica genera en ellos actividad óptica, es decir, pueden hacer girar el plano de luz polarizada, la cual se puede cuantificar en un polarímetro, aparato lustrado en la gráfica No. 7.1. Gráfica No.7.1. Polarímetro. Fuente: http://triplenlace.com/2012/11/25/polarimetria-iii-el- polarimetro/ Este equipo funciona básicamente de la siguiente manera: la fuente de sodio emite radiación electromagnética aproximada de 589.44 nm en todas las direcciones y en todos los planos de vibración, el primer prisma de Nicol usa un haz de luz con una sola dirección pero con todos los planos (luz polarizada). Luego atraviesa la muestra en disolución contenida en una celda, la cual hace girar el plano de luz polarizada bien sea en el sentido de las manecillas del reloj o en el sentido contrario. En el primer caso la sustancia es dextrógira y en el segundo es levógira. Para medir el grado de desviación de la luz polarizada, un segundo prisma girable permite determinar la rotación observada, valor con el cual se determina la rotación específica utilizando el siguiente algoritmo:  [ ]
  36. 36. 36 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Donde:  = rotación observada, [ ] = rotación específica l= longitud del tubo en cm y c = concentración en g/ L. De manera esquemática, en la gráfica No. 7.2. se muestra el funcionamiento del polarímetro: Gráfica No. 7.2. Mecanismo de funcionamiento de un polarímetro. Fuente: http://triplenlace.com/2012/11/25/polarimetria-iii-el-polarimetro/ Materiales y Reactivos Soluciones 10% m/v de D-glucosa, sacarosa, D-fructosa, D-ribosa, D-manosa D-galactosa y otros carbohidratos disponibles en el laboratorio, carbonato de sodio, agua destilado, polarímetro con sus tubos de 10 y 20 cm . 1 balón aforado de 25 mL, 1 vidrio de reloj, 2 espátulas metálicas, Procedimiento 1. Encender el polarímetro 10 minutos antes de iniciar la cuantificación. Liberar el tubo de sus dos tapas, lavarlo. Tapar como se ilustra en la gráfica No.7.4 y llenarlo con agua destilada de tal manera que no se observen burbujas en su interior, cerrar el tubo con su tapa rosca, como se muestra en la gráfica No. 7.3. Ajustar el equipo a cero, para ello se debe girar el tornillo micrométrico con el cual se hace girar el prisma de Nicol analizador, bien sea a la derecha o a la izquierda, según el caso. Desocupar el tubo y secarlo. Gráfica No.7.3. Tapa de polarímetro y sus componentes. Tapa rosca Empaque de caucho Ventana de vidrio Portaventana
  37. 37. 37 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Gráfica No.7.4. Tubos de polarímetro de 10 y 20 cm sellados La lectura correspondiente a la desviación del plano de luz polarizada se observa en el lente telescópico del polarímetro; antes de llegar al cero de calibración y después de haberlo obtenido se observan dos momentos bien definidos, los cuales se ilustran en las gráficas No. 7.5. Y No. Gráfica No.7.5. Antes y después de puesta a cero Una vez alcanzado el cero, el lente telescópico se muestra como en la gráfica No.7.6. De otra parte, cuando se alcanza la medida de la desviación del plano de la luz polarizada por parte de la sustancia objeto de estudio, el lente telescópico se muestra como en la gráfica No. 7.7. Gráfica No. 7.6. Puesta a cero Gráfica No.7.7. Medición de rotación específica Para reportar la actividad o rotación específica de una sustancia, basta con mirar a través de cualquiera de los dos lentes del visor, momento en el cual se hará visible el giro del prisma de Nicol analizador de acuerdo con el giro del plano de luz polarizada por parte de la muestra. La medición se precisa ubicando en primera instancia la cantidad de grados en números enteros, la cual se encuentra determinada por la escala móvil. Para el ejemplo presentado en la gráfica No. , el giro corresponde a 60 grados. Los decimales de grado se obtienen buscando en la escala fija la división de esta escala, que coincida formando una sola línea con alguna de las divisiones de la escala móvil. Para el caso ilustrado la huella intermedia entre el 6 y el 7 de la escala fija se alinea con la huella de 60°, por esta razón la rotación observada se corresponde con 60.65°, ver gráfica No. 7.8.
  38. 38. 38 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Gráfica No. 7.8. Medición de la rotación observada: 60.65° 2. Preparar 50 mL de solución de D-Glucosa al 10% m/v, recién preparada, transferir 16 mL de esta solución al tubo para polarímetro de 20 cm, de tal manera que se forme un menisco por encima del borde superior del tubo, deslizar la ventana de vidrio para evitar la presencia de burbujas y sellar con la tapa rosca. Realizar una primera lectura de la rotación específica. Realizar lecturas a intervalos de 2 minutos durante los primeros 10 minutos y después a intervalos más largos hasta cuando ya no hayan más cambios en la rotación y completar la tabla No. 7.1. Realizar una curva de la rotación en función del tiempo transcurrido durante la experiencia. 3. Mutarrotación en álcali. Repetir el procedimiento anterior haciendo la siguiente variación: mezclar 15 mL de solución de glucosa recién preparada y agregar 1,5 mL de Na2CO3 0.1M y seguidamente leer la rotación observada de igual forma al punto anterior. 4. Repetir el procedimiento del punto 2, esta vez con otro carbohidrato y así sucesivamente hasta medir la rotación específica de los carbohidratos disponibles para la práctica y completar la tabla No. Tabla No.7.1. Rotación específica de algunos carbohidratos Carbohidrato 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 20 min 30 min Glucosa Fructosa Galactosa Sacarosa 5. Con los datos correspondientes al minuto 30 de la tabla No. 7.1, calcular la rotación específica de cada una de las muestras usadas. Cuestiones 1. Determinar las razones moleculares de la actividad óptica. 2. Definir el concepto de mutarrotación y explicar su ocurrencia. 3. Enumerar y explicar brevemente algunas aplicaciones de la polarimetría. Grados en números enteros Grados en números decimales
  39. 39. 39 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Referencias Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana.
  40. 40. 40 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Profesor: LUIS JAVIER NARVÁÉZ ZAMORA BIOQUÍMICA Práctica de Laboratorio No. 8. Cuantificación de Carbohidratos Objetivo Determinar la concentración de algunos carbohidratos en disolución acuosa. Marco Teórico Una estrategia para cuantificar carbohidratos es la prueba con la antrona, la cual genera una reacción coloreada fácilmente identificable por espectrofotometría visible. Los carbohidratos en contacto con el H2SO4 para producir furfural y sus derivados, los cuales a su vez reaccionan con antrona para producir un complejo coloreado, mostrado a continuación: O Antrona + D-Glucosa O OH H H H OH OH H OH H OH H2SO4 O OOH hidroximetilfurfural O O O H2O OH2 Este complejo tiene gamas de colores desde el azul hasta el verde, los cuales se leen por lo general a una longitud de onda máxima de 620 nm; sin embargo no se recomienda usar la prueba si en la muestra hay proteínas con altos contenidos de triptófano, el cual genera una coloración roja con la antrona. Materiales y Reactivos Reactivo de antrona (2 g/L en H2SO4 concentrado) Diferentes soluciones patrón de carbohidratos (0.1 g/L) 10 tubos de ensayo gradilla para tubos Baño maría espectrofotómetro Uv-Vis Celdas de cuarzo para espectrofotómetro 2 pipetas de 10 mL 5 matraces aforados de 25 mL 1 micropipeta Procedimiento 1. Cada grupo de trabajo recibe una solución patrón (0.1 g/L) de carbohidrato en particular, con ella preparan 4 diluciones en cascada, diluyendo cada vez dos veces. 2. Transfiera 2 mL de cada carbohidrato en dilución en sendos tubos de ensayo, usar gradilla; agregar a cada tubo 2 mL de reactivo de antrona lo más rápido posible. Introducir el conjunto de 6 tubos (el sexto tubo se corresponde con la muestra problema del carbohidrato asignada al grupo) en baño maría a 80 °C durante 10 minutos. Enfriar y luego espectrofotometrear a 620 nm contra el reactivo de antrona como blanco. Elaborar la curva de calibración y calcular la concentración de la muestra problema usando la pendiente de la curva. Cuestiones 1. Escribir la ecuación correspondiente a la reacción efectuada por el grupo de trabajo.
  41. 41. 41 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA 2. ¿Cuál es la razón de utilizar la pendiente para efectuar el cálculo de la concentración correspondiente a la muestra problema? 3. Solicitar los resultados de los demás grupos de trabajo y presentar las curvas de calibración como las concentraciones de cada una de las muestras problema. Referencias Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana.
  42. 42. 42 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Practica No.9 Inversión de sacarosa Objetivo Hidrolizar la sacarosa e isomerizar la glucosa resultante hasta fructosa. Marco teórico La sacarosa es un disacárido constituido por una molécula de glucosa y otra de fructosa unidas a través de un enlace 1-4-glicosídico, tal como se muestra en la siguiente figura: O H H H OH OH H OH H OH O O OH H OH OH H H OH La inversión de esta sustancia consiste en la separación hidrolítica de la glucosa y la fructosa, generando cambios significativos en la mezcla resultante, como por ejemplo la variación en su actividad óptica, es decir una cambio en la dirección del plano de la luz polarizada, como también cambios en su comportamiento químico frente a reacciones clásicas como las de Fehling, Benedict, Barfoed, Bial, Selliwanoff, Tollens, etc. La sacarosa es exhibe dextrorrotación de +66°, al hidrolizarse en glucosa (+52°) y en fructosa (-92°), la mezcla exhibe levorrotación de -20°; este modificación de +66° a -20° a 10 recibe el nombre de inversión. Por carecer de carbonos anoméricos libres la sacarosa no es reductora pero en medio ácido y caliente, se hidroliza en la piranosa y la furanosa fuertemente reductoras. Al invertirla se obtiene un líquido espeso dorado con mayor poder edulcorante debido a la fructosa en especial. Materiales y reactivos 1 beaker o erlenmeyer de 1 litro 6 libras de sacarosa 1 trípode 1 mechero 1 g de ácido cítrico (10 g de NaHCO3) 1 litro de agua tibia 1 beaker de 100 ml solución de a-D-glucosa al 10% solución de -D-fructosa al 10% 1 polarímero 1 refractómetro para sacarosa 1 espctrofotómetro IR Reactivos de: Fehling, Benedict, Barfoed, Antrona, Bial, Selliwanoff y Tollens. Procedimiento 1. Medir la actividad óptica de las soluciones de glucosa y fructosa al 10% recientemente preparadas, al hacerlo se debe tener especial cuidado con la solución de glucosa, la cual exhibe el fenómeno de la mutarrotación. Asegurarse de llenar por completo los tubos portamuestras del polarímetro, el cual debe precalentarse hasta lograr estabilidad en la lámpara o fuente de luz de sodio.
  43. 43. 43 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA 2. Por separado, disolver 0.5 g de sacarosa, glucosa y fructosa en agua hasta completar 100 ml de disolución, medir la actividad óptica. Una vez terminada esta medición, usar cada disolución para realizar las siguientes pruebas a). actividad óptica, b) determinación de espectros IR c) pruebas típicas para carbohidratos empleadas en prácticas pasadas (Usar en cada caso 5 ml de la disolución y 2 ml de cada reactivo específico) y d) contenido sacarínico. 3. Inversión de la sacarosa. Disolver 6 libras de sacarosa en 1 litro de agua tibia, agregar 1 g de ácido cítrico (en su defecto se puede usar el jugo de unos 6 limones medianos)y 5 o 6 gotas de HCl 1M. Calentar hasta ebullición vigorosa, en este punto disminuir la intensidad de la llama y dejar hervir a fuego bajo durante 15 minutos. Sacar una alícuota de 50 ml y dejar enfriar. También se puede emplear otra técnica similar consistente en mezclar las 6 libras de sacarosa con agua tibia, poner a hervir durante 10 minutos, retirar del fuego y cuando la temperatura alcance los 50°C, añadir 10 g de NaHCO3 , mezclar bien para homogenizar el pH, la solución adquiere un color blanco pálido, el cual desaparece cuando se enfríe. Si queda algún residuo en la superficie, este debe retirarse para luego almacenar convenientemente. 4. Una vez finalizado el proceso transvasar unos 20 ml del producto obtenido y repetir con él, los pasos del punto 2. Disponer la sacarosa invertida en recipientes para su embalaje casero. Cuestiones. 1. Explicar el fenómeno de la mutarrotación exhibida por la glucosa. 2. Explicar brevemente el funcionamiento del polarímetro. 3. Contrastar los espectros obtenidos antes y después de la inversión. 3. Escribir las ecuaciones de las reacciones sucedidas durante el desarrollo de la práctica. 4. Determinar los principales usos del azúcar invertido obtenido. Referencias Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana.
  44. 44. 44 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Practica No.10 Cuantificación sacarínica en frutas Objetivo Determinar el contenido sacarínico de algunas frutas disponibles en la región Marco teórico Gracias al proceso fotosintético, los seres autótrofos biosintetizan un amplio número de especies de carbohidratos; mono, di y polisacáridos de uso corriente por parte de los seres heterótrofos, de estas especies químicas la más importante y abundante es la glucosa, la cual, junto a la fructosa y la sacarosa se acumulan especialmente en citoplasma; mientras los almidones son los carbohidratos de reserva acumulados en plastidios; la hemicelulosa y las pectinas integran el componente estructural celular. Las frutas deben su sabor dulce principalmente al contenido de carbohidratos, sin embargo el concepto de sabor tradicional lo deben al contenido de ácidos orgánicos y sus derivados, aunque en realidad y por cercanía morfológica y fisiológica de los órganos del gusto y el olfato, este “sabor” tradicional en realidad es olor La maduración de los frutos genera cambios radicales en la estructura molecular de sus carbohidratos, los cuales experimentan rutas metabólicas tales como la glicólisis, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y finalmente el sistema de transporte electrónico conducente a la formación de CO2, H2O y ATP la cual facilita la biosíntesis de otros componentes celulares Estos carbohidratos poseen en su estructura molecular grupos aldehídídicos o cetónico composición explicativa de su poder reductor, oxidándose en presencia de oxígeno o reduciendo en solución alcalina a iones oxidantes como Ag+ , Hg+ , Cu2+ y Fe(CN)6 3- propios de una gran variedad de reactivos como los de Tollens, Fehling, Benedict, Barfoed, etc. con los cuales reaccionan formando mezclas complejas de ácidos orgánicos. Para cuantificar el contenido sacarínico en frutas se puede usar la refractometría o la espectrofotometría, ambas basadas en la ley de Beer-Lambert Materiales y reactivos 1 refractómetro para sacarosa 0-80° Brix 1 espectrofotómetro Uv-Vis Frutas de diferentes especies Sacarosa 6 balones aforados de 50 ml 1 espátula metálica 1 balanza analítica 1 micropipeta 26 tubos de ensayo 1 gradilla para tubos de ensayo 1 baño maría Reactivo de Benedict Procedimiento Contenido sacarínico por Refractometría 1. Seleccione una primera fruta y extraiga de ella algunas gotas de su jugo, las cuales deben colocarse directamente en el portamuestras de la compuerta del refractómetro para medir el contenido sacarínico. Lavar y secar el portamuestras y su tapa; repetir este paso hasta completar la medición con todas las frutas disponibles. Completar la tabla No. 10.1
  45. 45. 45 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Tabla No.10.1 Contenido sacarínico en frutas por tefractometría Fruta °Brix Contenido sacarínico por espectrofotometría Uv-Vis 1. Preparar 100 mL de disolucion de sacarosa: 0.6 M, incubar a 25 °C; a partir de esta disolución y sin sacar del baño maría, preparar 50 ml de cada una de las siguientes diluciones en serie e incubar inmediatamente: 0.5M, 0.4M, 0.3M, 0.2M, y 0.1M. De cada una de ellas, transferir 5 ml a un tubo de ensayo y a cada uno agregar 2 mL de reactivo de Benedict, incubar a 25 °C durante 5 minutos. 2. Mientras se preparan las diluciones del punto anterior, transferir 4 ml de la disolución de sacarosa 0.6M a un tubo de ensayo, luego añadir 4 ml de Reactivo de Benedict, incubar a 25 °C durante 5 minutos, ahora dividir el contenido en dos partes iguales y transferirlas a dos celdas del espectrofotómetro. Determinar la longitud óptima de absorbancia con la cual se debe construir la curva de calibración utilizando las diluciones del punto 1. 3. Extraer 2 ml del jugo de cada fruta, depositar este volumen en un tubo de ensayo, agregar 2 ml de reactivo de Benedict, incubar a 25°C y espectrofotometrear a la longitud de onda óptima absorbancia definida en el punto anterior. Completar la tabla 10.2 Tabla No. 10.2 Contenido sacarínico en frutas por Uv-Vis Fruta M °Brix
  46. 46. 46 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Continuación Tabla No. 10.2 Fruta M °Brix Cuestiones. 1. Determinar las especies químicas responsables del sabor de cada fruta usada en la práctica. 2. Explicar brevemente el funcionamiento del refractómetro. 3. Escribir las ecuaciones de las reacciones sucedidas durante el desarrollo de la práctica. Referencias Alvear G. S. V. (2011). Problemas tridimensionales de química. Neiva, Editora Surcolombiana. Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana. http://www.horticom.com/revistasonline/extras/extra09/06_07.pdf
  47. 47. 47 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Práctica de laboratorio No. 11. Actividad catalítica de la amilasa. Objetivo Determinar la actividad catalítica de la amilasa salival a través de pruebas cualitativas. Materiales Y Reactivos 1 beaker de 50 ml solución de almidón al 1% 1 beaker de 500 ml solución alcohólica de I 0.01 M 1 pipeta de 5 ml baño María Papel celofán 2 placas de tinción Reloj con segundero 1 probeta de 250 ml 5 tubos de ensayo gradilla para incubación Almidón 1% I2 0.01 M NaCl 0.1 M H2O destilada Na2SO4 0.1 M Fehling A y Fehling B Papel filtro en tiras Horno desecador Marco Teórico La amilasa (1,4 glucano-4-glucano hidrolasa) ha sido aislada de la saliva del páncreas humano, como también de Pseudomonas y Aspergillus. De esta enzima existen dos variedades, las cuales se encuentran en la saliva: -amilasa y amilasa; la primera tiene un peso molecular de 45000 Da, presente además en el jugo pancreático, hidroliza indistintamente al azar los enlaces (1 4) glicosídicos a lo largo de la cadena de la amilosa generando moléculas libres de glucosa y maltosa, tiene la capacidad de suprimir la capacidad de la amilosa de producir un color azul cuando esta reacciona con el yodo La amilasa, presente también en la malta, libera moléculas de maltosa iniciando su hidrólisis por el extremo no reductor de la cadena de la amilosa. La amilopectina también es atacada por las  y  amilasas, liberando moléculas de maltosa. Sin embargo estas dos enzimas no pueden hidrolizar los enlaces (1 6) glicosídicos de los puntos de ramificación de la amilopectina, por tanto su acción libera tantas unidades de maltosa hasta que la hidrólisis llegue a los enlaces (1-6), para producir un núcleo muy grande y ramificado denominado dextrina límite, la cual se hidroliza con una (1 6)- glucan-6-glucano hidrolasa. Procedimiento 1. Enjuagarse la boca con agua y posteriormente recoger unos 20 ml de saliva en un beaker de 50 ml. Algunas personas secretan saliva con una actividad débil de sus amilasas. Con una pipeta se trasvasan unos 5 ml de la saliva colectada a una bolsa de papel celofán, amarrándola en la parte superior para impedir el derrame de la saliva introducida; esta pequeña bolsa se introduce en unos beaker con 400 ml de agua destilada, se espera una hora o más hasta que ocurra la diálisis. Durante este proceso se cambia el agua unas tres veces cada 20 minutos y se agita también la bolsa dializadora. Diluir 20 veces la saliva restante para usarse en el punto 2 2. Pruebas Preliminares. Mientras ocurre la diálisis se debe determinar la actividad de la amilasa, por tanto se requiere establecer la dilución óptima para hidrolizar el almidón
  48. 48. 48 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA hasta el “punto acromático”, el cual se alcanza cuando una solución de yodo ya no produce color azul oscuro o negro en un lapso de 5 minutos a 37 °C. Incubar en baño de María, 10 ml de almidón al 1 % durante dos minutos a 37 o C, ahora agregar 2 ml de saliva inicial diluida 20 veces, obtenida en el punto 1, continuar la incubación a la misma temperatura; cada 30 segundos y con la ayuda de una pipeta, trasvasar 3 gotas de esta mezcla incubada a la depresión de la placa de tinción, donde previamente se han agregado 2 gotas de solución de yodo 0.01 M. Así se identifica la muestra que ya no da positiva a la prueba del yodo sobre el almidón (punto acromático), si el tiempo necesario para lograr este resultado es inferior a 3 minutos, se debe diluir aún más la saliva inicial del punto 1. Tal dilución debe permitir el resultado negativo a la prueba del yodo entre 3 a 8 minutos. Las siguientes pruebas se realizarán en la jornada de laboratorio siguiente. 3. Activación De La Amilasa Salival. Una vez efectuada la diálisis, se transfiere el contenido de la bolsa dializadora a una probeta de 250 ml y se diluye con agua destilada hasta una concentración igual a la del punto acromático del punto 2. Por igual se transfieren a otra probeta de 250 ml unos 5 ml de la saliva inicial del punto 1 y se diluye hasta la concentración del punto acromático; estas dos soluciones se deben mezclar y transferir a 5 tubos de ensayo previamente rotulados en las cantidades definidas de la tabla siguiente: Tubos y ml añadidos Sustancias 1 2 3 4 5 Almidón 1% 10 10 10 10 10 NaCl 0.1 M 1 1 H2O destilada 1 1 Na2SO4 0.1 M 1 Saliva dializada diluida 2 2 2 Saliva inicial diluida 2 2 Incubar los 5 tubos a 37 °C durante 5 minutos, este es el tiempo cero en el cual se puede agregar la saliva dializada diluida y la saliva inicial diluida; a intervalos de 1 minuto se deben realizar sendas pruebas. Determinar Grupos Reductores en la Mezcla de Digestión. Dividir una tira de unos 16x2 cm de papel filtro en 16 partes iguales, ahora Incubar 10 ml de solución de almidón al 1 % durante 2 minutos a 37 o C. 1. En el tiempo cero se añaden 0.2 ml de saliva sin diluir a la solución de almidón y cada 30 segundos se hace la prueba del yodo hasta encontrar el punto acromático: al mismo tiempo otro estudiante deposita una gota de la mezcla en digestión en cada una de las divisiones del papel filtro hasta la última de ellas, esta tira de papel se seca al aire y finalmente se adicionan unas dos gotas de solución de Fehling Cuestiones 1. Determinar la composición de la saliva humana. 2. ¿Qué se trata de demostrar en el punto 3? 3. ¿De qué manera afecta la diálisis de la saliva a la capacidad de hidrolizar el almidón? Referencias Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función
  49. 49. 49 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA celular. Buenos Aires: Omega. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana
  50. 50. 50 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES BIOQUÍMICA Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA Práctica de laboratorio No. 12. Pruebas Cualitativas para Ácidos Grasos Una de las maneras más sencillas para identificar ácidos grasos es la saponificación, a través de la cual un lípidos libera por acción de agentes físicos y químicos, tanto glicerol como ácidos grasos. Para lograrlo basta con calentarlos en presencia de un álcali. Este proceso es la base usada en la fabricación de jabones duros y blandos. El exceso de Los ácidos grasos liberados reacciona con la base usada para formar la sal correspondiente. Los jabones como tal son hidrosolubles pero generan precipitación en presencia de NaCl, CaCl2, o MgCl2. Materiales y reactivos Fenolftaleina 10 g/ L de etanol Grasa animal (mantequilla) NaOH 0.1 M Aceite vegetal (aceite de oliva) NaCl 50 g/L Ácido graso (ácido esteárico) CaCl2 50 g/L HCl concentrado MgCl2 50 g/L Pb(CH3COO)2 50 g/L KOH alcohólico 100 g/L Pipeta de 10 mL Papel tornasol azul 1 espátula Gradilla con 10 tubos de ensayo Éter etílico KHSO4 Agua de bromo Yodo en cloroformo Procedimiento para saponificación 1. Colocar en un tubo de ensayo grasa hasta 0.5 de altura, adicionar 1 mL de KOH alcohólico hasta cubrir la grasa adicionada, hervir durante 1 minuto asegurándose de evitar salpicaduras las cuales son muy caústicas. Agregar 10 mL de agua, hervir durante 10 minutos adicionales y dejar enfriar, agregar cuidadosamente HCl hasta obtener una disolución de carácter ácido,(papel tornasol azul). Remover la capa superior de ácidos grasos ubicada en la parte superior. Ahora adicionar 10 mL de agua al sobrenadante retirado y agregar NaOH 0.1 M hasta obtener una disolución clara. Utilizar el producto en el siguiente punto. 2. Obtención de jabón. Transferir 0. 5 g de ácido esteárico a un tubo de ensayo, agregar NaOH 0.1M hasta formar una disolución jabonosa. Dividir esta disolución en 4 tubos de ensayo, HCl (revisar resultados) , saturar con solución de NaCl, CaCl2, MgCl2 y Pb(CH3COO)2 (observar resultados). Dividir la disolución del punto 1 en cuatro tubos de ensayo y repetir las pruebas del punto 2. Pruebas para ácidos grasos Disolver 0.2 g de ácido esteárico en 5 mL de éter etílico, por aparte medir 5 mL de fenolftaleína en un tubo de ensayo, añadir tantas gotas de NaOH 0.1 M hasta que
  51. 51. 51 MANUAL DE GUÍAS DE LABORATORIO DE Bioquímica. 2013-B Profesor: LUIS JAVIER NARVÁEZ ZAMORA prevalezca un color ligeramente rosado. La presencia de ácidos grasos libres produce la desaparición del color rosado. Repetir la experiencia con mantequilla y aceite de oliva. Prueba para glicerol Al calentar glicerina con KHSO4 se genera una deshidratación con la subsecuente formación de un aldehído denominado acroleína, perceptible por su olor característico. La reacción ocurre tanto para el glicerol como para sus sales. Procedimiento En un tubo de ensayo colocar KHSO4 hasta una altura de 0.2 cm, añadir una cantidad aproximada de 0.5 mL de glicerol; añadir más bisulfato. Calentar por dos minutos hasta percibir el olor característico de la acroleína. Prueba de insaturación Por lo general, los ácidos grasos constituyentes de las grasa animales son saturados, en cambio aquellos derivados de los vegetales poseen una o más doble ligaduras carbono carbono. Al hidrogenar estos doble enlaces se obtienen grasas vegetales, tal como ocurre con las margarinas. Por igual los halógenos reaccionan fácilmente con los doble enlaces para formar derivados halogenados (halogenuros de alquilo) Procedimiento Transvasar pequeñas cantidades de mantequilla, aceite de oliva y ácido esteárico en sendos tubos de ensayo. Con mucho cuidado y evitando el contacto con la piel, agregar gota a gota agua de bromo, agitar el tubo cada vez hasta lograr decoloración total del bromo. Repetir el ensayo usando esta vez yodo en cloroformo. Cuestiones 1. Plantear en cada caso, las ecuaciones correspondientes a cada reacción, usar formato digital para este proceso. No se reciben manuscritos escaneados. 2. Establecer la importancia y los cuidados en la ingesta de ácidos grasos en la dieta alimentaria diaria. 3. Plantear una discusión sobre el impacto de la acroleína en la salud humana. Referencias Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2008). Bioquímica. 6ª Ed. Barcelona: Reverté. Lehninger, A. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Macarulla, J. M. y Goñi, F. M. (2002). Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural. 3ª Ed. Barcelona: Reverté. Plummer, D. T. (1981). Bioquímica Práctica. Chelsea College of London. Trad: Luis Alejandro Barrera, revision: Carlos Corredor. Bogotá: Mc Graw Hill Latinoamericana Rendina, G. (1974). Técnicas de Bioquímica Aplicada. México : Interamericana.

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