2014
Universidad de Chile,
Facultad de Medicina,
LACyM
Por Kenneth Walker B.
[MINI-GUÍA DE TÉCNICAS
HISTOLÓGICAS E
INMUNOH...
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ÍNDICE
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A mis compañeros y amigos,
Con gran agrado les dejo esta mini-guía que confeccioné para que la utilicen como una
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ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA
La próstata es un órgano compuesto por glándulas y estroma, ambos íntimamente unid...
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interna o arteria hipogástrica. Los linfáticos drenan hacia los ganglios ilíacos externos,
hipogástricos medios e inferi...
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HISTOLOGÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA
La próstata es la glándula sexual accesoria más grande en los hombres. Contiene ...
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Fig. 5. Los alvéolos secretores o glándulas
tubuloalveolares (tubuloaveolar glands) de la próstata,
tienen una forma muy...
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Fig. 7. Un rasgo característico de la próstata es la aparición
de los cuerpos amiláceos (corpora amylacea) en los
alvéol...
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Fig. 8. LA HPB corresponde a
un aumento de tamaño de la
zona de transición y de la
región periuretral proximal,
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ANATOMÍA PATOLÓGICA DE LA PRÓSTATA HUMANA
Adenocarcinoma de próstata (CaP)
Formas o categorías del carcinoma de próstata...
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el III (45%) y el IV (57%). El paciente con tumor en el estadio inicial (IA1) tiene igual sobrevida que
la población ge...
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ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA MURINA
La próstata murina, a diferencia de la del
hombre, contiene lóbulos separados: Lo...
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Fig. 11. La próstata dorsal tiene epitelio
cúbico simple que raramente presenta
pliegues proyectados al lumen. Las célu...
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OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Toma de muestra
Todos los pasos de la técnica histológica son muy importantes para la obtención...
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Si la fijación es por inmersión, la muestra debe ser colocada inmediatamente después de ser
tomada en el recipiente con...
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Métodos de fijación
Inmersión
Es el método más utilizado y simple desde el punto de vista técnico. Utiliza recipientes ...
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Fijadores Físicos
Frío: Es muy utilizado cuando se requiere mantener en buenas condiciones y en su lugar, las
diversas ...
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PREPARACIÓN DEL FORMOL TAMPONADO AL 10%
Utiliza Formol puro, el cual va a ser disuelto al 10% en Buffer Fosfato. Esto l...
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FIJACIÓN POR PERFUSIÓN: RATÓN
Materiales a utilizar
• Dos recipientes de suero, uno con fijador, y el otro con solución...
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• En el momento en que el fijador penetra en el torrente circulatorio, se observa que el
animal comienza a presentar fi...
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MÉTODOS DE DESHIDRATACIÓN
La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la remoción o eliminación completa de...
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• Empleo de agentes accesorios: Como el Sulfato de cobre anhidro, óxido de calcio, resinas
humectantes, etc., porque el...
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PROTOCOLO DE DESHIDRATACIÓN PARA BIOPSIAS PEQUEÑAS
Tiempo total de procesamiento: 3 – 4 horas
• Enjuague la muestra de ...
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IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA
Es el procedimiento más utilizado que se realiza para poder cortar los tejidos tra...
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• Se lleva la muestra al recipiente que contiene parafina líquida (se debe mantener la
temperatura constante entre 50º ...
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CORTE DE LOS TEJIDOS
Existen 2 tipos de hojas desechables en el mercado hoy en día: Hojas de bajo y alto perfil. Para l...
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Importante: Aun cuando su estudio se base en la obtención de cortes seriados, no coloque la cinta
en un solo portaobjet...
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TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA
Hematoxilina
La hematoxilina es un colorante natural y de naturaleza química básica que se ...
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Preparación de Hematoxilina
Reactivos
• Alumbre de Amonio o de Potasio (mordiente) 50 g
• Cristales de hematoxilina 1 g...
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Eosina
La eosina es un colorante xanténico artificial y de naturaleza química ácida, es un derivado
hidroxianténico hal...
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Método de la Hematoxilina-Eosina
Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de hematoxilin...
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INTRODUCCIÓN A LA INMUNOHISTOQUÍMICA
Antes de aventurarse en la inmunohistoquímica (IHQ), reconozca el mejor procedimie...
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utilícelo como primer cromógeno en el paso de revelado. Recuerde bloquear los elementos endógenos
(biotina, peroxidasa,...
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La gran parte de las IHQs, sea
cromogénica o fluorescente, se realizan
como indirectas. Esto significa, que
utilizan un...
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PROTOCOLO: RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA
Por K. Walker
La recuperación antigénica es una etapa necesaria para la realización ...
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PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN
Por K. Walker
Detección con enzima peroxidasa (HRP)
• Una vez concl...
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PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA CON AMPLIFICACIÓN
Por K. Walker
Amplificación con método ABC (VECTASTAIN® Elite® ABC ...
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PROTOCOLO: IHQ DOBLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN
Por K. Walker
Detección con enzima peroxidasa (HRP) y fosfatasa alca...
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• Posteriormente, proceda a aplicar el segundo anticuerpo secundario conjugado con la enzima AP.
Incube con este anticu...
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PROTOCOLO: IHQ DOBLE FLUORESCENTE SIN AMPLIFICACIÓN
Por K. Walker
Detección simultánea con cocteles de anticuerpos.
• U...
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SOLUCIONES ÚTILES
Buffer citrate de sodio (10 mM Sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)
Tri-sodium citrate (dihydrate)...
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Solución bloqueadora de peroxidasa en base a Metanol (0.3% H2O2 in
Methanol)
• 1 ml de 30% H2O2
• 99 ml de Methanol
Alm...
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La solución debe estar a pH 7.4. El pH solo se puede ajustar agregando sal monobásica. Caliente la
solución al 8% de PF...
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BREVE INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESTADÍSTICOS
Una de las aplicaciones de la estadística es hacer inferencias a poblacio...
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que es muy poco probable que el azar fuese responsable de dicha asociación. Del mismo modo si
la p>0.05 decimos que el ...
45
Esta información no alcanza a abarcar completamente la gran cantidad de tests estadísticos que
existen y sus usos respe...
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REFERENCIAS
1. Walker K. Evaluación histopatológica de la distribución de las células troncales tumorales en cáncer
pro...
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Miniguia de Técnica Histologica e Inmunohistoquimica por K. Walker Bravo

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Guía de Inmunohistoquímica y técnica histológica para el trabajo de muestras prostáticas en el estudio de carcinomas. Puede utilizarse para estudios en general.

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Miniguia de Técnica Histologica e Inmunohistoquimica por K. Walker Bravo

  1. 1. 2014 Universidad de Chile, Facultad de Medicina, LACyM Por Kenneth Walker B. [MINI-GUÍA DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS E INMUNOHISTOQUÍMICA]
  2. 2. 1 ÍNDICE ÍNDICE.................................................................................................................................................. 1 ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA.............................................................................. 3 HISTOLOGÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA ............................................................................ 5 ANATOMÍA PATOLÓGICA DE LA PRÓSTATA HUMANA ....................................................................... 9 ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA MURINA ............................................................................. 11 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA............................................................................................................ 13 FIJACIÓN............................................................................................................................................ 14 PREPARACIÓN DEL FORMOL TAMPONADO AL 10% ......................................................................... 17 FIJACIÓN POR PERFUSIÓN: RATÓN................................................................................................... 18 MÉTODOS DE DESHIDRATACIÓN ...................................................................................................... 20 PROTOCOLO DE DESHIDRATACIÓN PARA BIOPSIAS PEQUEÑAS....................................................... 22 IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA.................................................................................... 23 CORTE DE LOS TEJIDOS...................................................................................................................... 25 TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA..................................................................................................... 27 INTRODUCCIÓN A LA INMUNOHISTOQUÍMICA................................................................................ 31 PROTOCOLO: RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA ..................................................................................... 34 PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN...................................................... 35 PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA CON AMPLIFICACIÓN.................................................... 36 PROTOCOLO: IHQ DOBLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN....................................................... 37 PROTOCOLO: IHQ DOBLE FLUORESCENTE SIN AMPLIFICACIÓN....................................................... 39 SOLUCIONES ÚTILES.......................................................................................................................... 40 BREVE INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESTADÍSTICOS.................................................................. 43 REFERENCIAS..................................................................................................................................... 46
  3. 3. 2 A mis compañeros y amigos, Con gran agrado les dejo esta mini-guía que confeccioné para que la utilicen como una herramienta de consulta la cual describe de manera general, los procesos críticos respecto a la toma y procesamiento de muestras para los estudios histopatológicos. Esperando que este documento les sea de gran utilidad y apoyo en su investigación del CaP, les saluda afectuosamente y agradecido de su cordialidad, Kenneth Walker Bravo.
  4. 4. 3 ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA La próstata es un órgano compuesto por glándulas y estroma, ambos íntimamente unidos y delimitados por la cápsula prostática común. Tiene forma de castaña o triángulo achatado en su base o cara superior. Pesa 20 a 25 g y mide 3 x 4 x 2,5 cm en el hombre adulto. Está alojada en el compartimiento o nicho prostático inmediatamente por debajo de la vejiga, en relación con la cual se halla su base o cara superior. Su extremo opuesto, más aguzado, el ápex o vértice prostático, termina junto al segmento distal de la uretra prostática en la aponeurosis perineal media. Fig. 1. Esquema de un corte o plano A) sagital y B) coronal de la próstata con zona central (C), de Transición (T) y periférica (P). En la próstata se distinguen tres zonas principales: a) zona de transición, correspondiente al 10% de la glándula, ubicada en la base y en relación con la uretra y vejiga; b) zona central, correspondiente al 20% de la glándula, ocupa la base en relación con las vesículas seminales; c) zona periférica, correspondiente al resto de la glándula (70%). La zona central probablemente es de origen wolffiano, mientras que las zonas de transición y periférica derivan de evaginaciones de la uretra proximal, de origen cloacal. Estas últimas dos zonas se consideran el sitio de origen del adenocarcinoma de la próstata (CaP). Las arterias que irrigan la próstata nacen de la arteria ilíaca
  5. 5. 4 interna o arteria hipogástrica. Los linfáticos drenan hacia los ganglios ilíacos externos, hipogástricos medios e inferiores, sacros laterales y prevesicales. Fig. 2. Vista lateral de un esquema de la anatomía prostática de acuerdo con Mcneal (1978), muestra la zona anterior (za), la zona periférica (zp) y la zona central (zc). U = uretra, de = ducto eyaculador. Fig. 3. Mismo esquema anterior después de haber sido retirada parte de la zona periférica y de la zona anterior lo que permite visualizar la zona de transición (zt), localizada profundamente en la región pre- prostática en íntima relacion con la uretra. U = uretra, de = ducto eyaculador.
  6. 6. 5 HISTOLOGÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA La próstata es la glándula sexual accesoria más grande en los hombres. Contiene entre 30 a 50 glándulas tubuloalveolares que desembocan en 15 a 25 conductos excretores independientes. Estos conductos se abren hacia la uretra. Las glándulas se disponen entre un estroma fibromuscular, el cual consiste principalmente en músculo liso separados por hebras de tejido conectivo rico en fibras colágenas y elásticas. El músculo forma una masa densa alrededor de la uretra y por debajo de la delgada cápsula prostática. Fig. 4. En la histología al igual que en la anatomía, se distinguen las tres zonas principales mencionadas con anterioridad (zona de transición, zona central y zona periférica).
  7. 7. 6 Fig. 5. Los alvéolos secretores o glándulas tubuloalveolares (tubuloaveolar glands) de la próstata, tienen una forma muy irregular debido a las proyecciones papilares de la mucosa hacia sus lúmenes. Los conductos de secreción de la próstata están revestidos por un epitelio columnar simple que cambia a un epitelio de transición cerca de las aberturas de los conductos en la uretra. Fig. 6. El epitelio de revestimiento de las glándulas tubuloalveolares es predominantemente columnar. En aquellos segmentos donde las células basales están presentes, se observa un efecto de pseudo-estratificación del epitelio. Las células secretoras son ligeramente acidófilas y sus gránulos secretores pueden ser visibles en el citoplasma. Pequeñas extensiones del citoplasma apical en el lumen de los alvéolos pueden representar productos de secreción (secreción apocrina/merocine). La secreción de la próstata contiene ácido cítrico, la fibrinolisina (licua el semen), la fosfatasa ácida entre otras enzimas. La secreción de la próstata es la primera fracción del eyaculado.
  8. 8. 7 Fig. 7. Un rasgo característico de la próstata es la aparición de los cuerpos amiláceos (corpora amylacea) en los alvéolos secretores. Son redondeados cuerpos eosinófilos. Su diámetro medio es de aproximadamente 0,25 mm (hasta 2 mm). Aparecen al séptimo mes del desarrollo fetal. Su número aumenta con la edad y en particular, el pasado los 50 años. Son sujetos a calcificación. Pueden llegar a aparecer en el semen. Desde los 30 años en adelante, se producen en la próstata diversas alteraciones histológicas, como atrofia focal, fibrosis periglandular e inflamación crónica focal, alteraciones que afectan preferentemente la zona periférica. HPB La HPB se instala por el crecimiento tisular de esos elementos histológicos que causan profundas modificaciones en la estructura organizacional de la próstata. Esas modificaciones resultan en el surgimiento de nódulos hiperplásicos que en el 70% de los casos ocurren en la zona de transición y acaban estirando las demás regiones peri-uretrales. La proliferación localizada del estroma fibromuscular es aceptada como el primer paso en el desarrollo de la HPB que incluye alteraciones importantes en los fibroblastos de los capilares, del estroma fibromuscular y de la composición de los glicosaminoglicanos (GAGs).
  9. 9. 8 Fig. 8. LA HPB corresponde a un aumento de tamaño de la zona de transición y de la región periuretral proximal, debido a un proceso hiperplásico expansivo del tejido glandular y del estroma. Macroscópicamente muestra un aspecto multinodular, dado por nódulos blanquecino amarillentos de 1 a 10 mm de diámetro, y, entre ellos, por bandas de tejido fibroso o fibrohialino. La zona periuretral hiperplásica macroscópicamente es blanquecina y lisa por estar compuesta preponderantemente de tejido fibromuscular. Los nódulos pueden ser fibrosos, fibromusculares, musculares, fibroglandulares o fibromioglandulares. Estos últimos son los más frecuentes. Si tienen muchas glándulas muestran un aspecto poroso o esponjoso y ellas pueden contener cuerpos amiláceos o concreciones. La consistencia de la glándula hiperplásica es menor de la que suele tener el cáncer de la próstata.
  10. 10. 9 ANATOMÍA PATOLÓGICA DE LA PRÓSTATA HUMANA Adenocarcinoma de próstata (CaP) Formas o categorías del carcinoma de próstata • Carcinoma clínicamente manifiesto: el diagnóstico se establece clínicamente, por examen físico, signos de estenosis u obstrucciones uretral, hematuria, etc. • Carcinoma oculto: descubierto por sus metástasis antes que el tumor primario, • Carcinoma incidental (subclínico): clínicamente silente, descubierto casualmente en el examen microscópico de tejido prostático resecado bajo el diagnóstico de enfermedad no maligna. • Carcinoma latente: descubierto en autopsias. El carcinoma incidental y el latente parecen tener una frecuencia mucho mayor que el carcinoma manifiesto y el oculto. Por lo tanto, aparentemente existe sólo un pequeño porcentaje de cánceres que progresan y se diseminan. El porqué de esta agresividad selectiva se desconoce por completo. Estadios del cáncer de la próstata Es de gran importancia pronóstica determinar en la forma más precisa posible el estadio en que se encuentra el carcinoma de la próstata, para lo cual el mejor método es el examen morfológico. Los estadios básicos son cuatro: • Estadio I Carcinoma incidental (sin manifestaciones clínicas) • Estadio II Carcinoma dentro de la cápsula prostática • Estadio III Carcinoma con extensión extracapsular, sin metástasis • Estadio IV Carcinoma con metástasis Cada uno de estos estadios se subdivide en dos atendiendo al grado de diferenciación histológica, número de focos y extensión del carcinoma, eventual infiltración de órganos vecinos (vesículas seminales, uretra, vejiga, pelvis) y sitio de las metástasis. En la evaluación de las metástasis ganglionares linfáticas son importantes el número de ganglios comprometidos y el tamaño de aquellas. Los estadios que se encuentran más frecuentemente en las resecciones quirúrgicas son
  11. 11. 10 el III (45%) y el IV (57%). El paciente con tumor en el estadio inicial (IA1) tiene igual sobrevida que la población general. Clasificación histológica Fig. 9. De todas las clasificaciones actualmente en uso para determinar el grado de malignidad histológica del carcinoma prostático, una de las más apropiadas es la de Gleason. Según ésta se distinguen 5 tipos histológicos, que van desde un adenocarcinoma tubular bien diferenciado, de crecimiento expansivo (tipo 1) hasta uno muy poco diferenciado e infiltrante (tipo 5). Los tipos más frecuentes son el 3 y el 4, que en conjunto tienen una frecuencia relativa de cerca de 60% y corresponden a un adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado y poco diferenciado, respectivamente. Estos tipos histológicos también son conocidos como grados de Gleason. El score de Gleason está dado por suma de los dos tipos (grados) predominantes en cada caso. Los score 8, 9 y 10 tienen metástasis ganglionares regionales en más del 90% de los casos y son los de peor pronóstico. Los score 2, 3 y 4 no tienen metástasis y son de muy buen pronóstico.
  12. 12. 11 ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA MURINA La próstata murina, a diferencia de la del hombre, contiene lóbulos separados: Los dorsales, laterales, ventrales y anteriores. Todos los lóbulos están formados por túbulos ramificados y ciegos que están rodeados por una delgada capa fibromuscular y separados entre sí por tejido conectivo laxo. Las glándulas de la próstata murina, al igual que la del hombre, contiene células epiteliales cilíndricas, células basales y células neuroendocrinas (<0,3%). Las secreciones de las glándulas de la próstata son transportadas por los conductos al colículo seminal y pueden ser vistas como concreciones prostáticas en los cortes histológicos. Los lóbulos de la próstata murina difieren unos de otros en la apariencia tanto del epitelio de revestimiento de las glándulas y en la secreción al lumen de la glándula (concreción prostática).
  13. 13. 12 Fig. 11. La próstata dorsal tiene epitelio cúbico simple que raramente presenta pliegues proyectados al lumen. Las células epiteliales tienen sus núcleos dispuestos de manera basal. La secreción prostática en los lúmenes dorsales es homogénea y eosinófila. PrGl = Glándula tubuloalveolar; LoCo = Tejido conectivo laxo; PrSe = Concreción prostática. Fig. 12. La próstata ventral presenta células epiteliales columnares con plegamientos focales y núcleos basales. La secreción prostática en los lúmenes ventrales es homogénea y levemente basófila. LoCo = Tejido conectivo laxo; CoEp = Epitelio cilíndrico (columnar); Lu = lumen. Fig. 13. La próstata anterior presenta células epiteliales columnares bajas con muchos plegamientos hacia el lumen de la glándula y núcleos de disposición central. El lumen de la próstata anterior presenta abundante secreción eosinófila. Lu = Lumen; CoEp = Epitelio cilíndrico (columnar); MI = Músculo; AdTi = Tejido adiposo.
  14. 14. 13 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Toma de muestra Todos los pasos de la técnica histológica son muy importantes para la obtención de resultados finales satisfactorios, pero de este primer paso, depende que se puedan apreciar los detalles de las estructuras a estudiar. El punto más importante, tiene que ver con el corte y el tamaño de la muestra a utilizar, ya que de ello depende el éxito del resto de los pasos del proceso. El tamaño de la muestra para microscopía de luz, debe ser no mayor de un centímetro cúbico (1 cm3 ), para que la fijación sea adecuada y facilite los pasos siguientes de la técnica. Recomendaciones para tomar las muestras • La muestra debe ser tratada en forma cuidadosa con el instrumental, para evitar inducir lesiones en el tejido • Las muestras deben ser pequeñas para facilitar el proceso de fijación • El corte de la muestra debe ser realizado con hojillas de bisturí, o en su defecto, navajas de micrótomo en perfectas condiciones, para que los bordes de la muestra sean los adecuados, evitando así áreas con cortes irregulares • Luego de tomada la muestra, esta debe ser introducida de inmediato en el recipiente con fijador (fijación por inmersión) • Recoja aquellas muestras en un orden tal que sea ágil, que de preferencia a los órganos que primero se degradan (páncreas e intestino) en una sala a baja temperatura. Importante: Muchos estudios requieren la localización de una pequeña estructura en un órgano para luego ser trabajada a través de inmunohistoquímica, como un foco metastásico, por ejemplo. Siempre identifique y separe las piezas anatómicas que trabaje cada una en bloques aparte y tiña la estructura que le interese para no perderla de vista posteriormente.
  15. 15. 14 Si la fijación es por inmersión, la muestra debe ser colocada inmediatamente después de ser tomada en el recipiente con fijador, que siempre debe estar listo para tal fin. FIJACIÓN Es el procedimiento de la técnica histológica, que tiene como finalidad, conservar de manera permanente, una estructura lo más semejante al estado que tenía in vivo. Objetivos de la fijación • Preservación de la estructura lo más semejante al estado viviente • Penetración y acción rápida sobre los tejidos • Evitar los cambios post-mortem • Preparar los tejidos para los tratamientos subsiguientes • Impedir la formación de artefactos • Impedir la desaparición de sustancias solubles, durante y después de la fijación • Evitar la retracción de los tejidos “No existe el fijador ideal; todos tienen sus fortalezas y debilidades” Consideraciones para elegir un fijador • Preservación de los detalles celulares • Tasa de penetración • Cantidad del daño ocasionado • Técnica de coloración o marcaje “El objeto del estudio es quien determina el tipo de fijador a ser utilizado”
  16. 16. 15 Métodos de fijación Inmersión Es el método más utilizado y simple desde el punto de vista técnico. Utiliza recipientes con tapa de cierre hermético que evita la evaporación del fijador que contiene. Como norma se dice que la cantidad de fijador a utilizar, está en una proporción de 10:1. Esto quiere decir, que la cantidad de fijador debe ser 10 veces mayor al tamaño de la muestra a fijar. Este tipo de fijación tiene como limitación, que extrae con frecuencia sustancias intracelulares, por lo que su uso depende del objetivo final de la técnica. Perfusión Es el método de mayor utilización en animales de experimentación, ya que el líquido fijador es inoculado en el sistema circulatorio del espécimen, por lo tanto, fija en principio de adentro, hacia fuera de los órganos a estudiar, lo que da excelentes resultados cuando la técnica es realizada con éxito. Hay dos tipos de fijación por perfusión: De gran circuito y de pequeño circuito. El primero, se realiza inoculando el fijador a partir del corazón (ventrículo izquierdo) por lo que la fijación ocurre en todos los órganos del espécimen; en la de pequeño circuito, el fijador se inyecta solo en una porción del animal, fijando solo la parte de interés para el investigador. Ej. Se inocula la arteria renal si lo que se requiere es solo el riñón. Tipos de fijadores • De acuerdo a su acción sobre las proteínas (Coagulantes y No coagulantes) • De acuerdo a su origen general (Físicos y Químicos) Ambas clasificaciones utilizan las mismas sustancias, la diferencia está en que la primera explica el mecanismo de acción del fijador (que será ampliada durante la sesión teórica del tema). La segunda clasificación es la más utilizada desde el punto de vista práctico, por lo que es la que será tratada en esta recopilación.
  17. 17. 16 Fijadores Físicos Frío: Es muy utilizado cuando se requiere mantener en buenas condiciones y en su lugar, las diversas sustancias intracelulares, especialmente para técnicas de histoquímica o inmunohistoquímica. Las diversas formas de fijación por frío serán tratadas en la sesión teórica del tema Fijadores Químicos Simples: Son sustancias químicas de estructura no compleja, que se mezclan con agua destilada para lograr la proporción adecuada. Ej.: • Ac. Acético • Alcohol etílico (C2H5OH) • Formaldehido (H-CHO) y paraformaldehido • Ac. Pícrico • Ac. Crómico • Dicromato de potasio K2Cr2O7 • Bicloruro de Mercurio HgCl2 • Tetraóxido de osmio OsO4 • Glutaraldehido • Permanganato de potasio (KMnO4) Compuestos o Mezclas fijadoras: Se originan por la combinación de varios de los fijadores químicos simples, y tienen usos particulares para los cuales fueron creados. Ej.: • Formol tamponado • Formol calcio • Líquido de Zenker • Líquido de Bouin • Líquido de Helly • Fijador de Carnoy • Líquido de Flemming • Zenker-formalina
  18. 18. 17 PREPARACIÓN DEL FORMOL TAMPONADO AL 10% Utiliza Formol puro, el cual va a ser disuelto al 10% en Buffer Fosfato. Esto le da mejores resultados a la fijación, ya que acerca el pH del fijador al de los tejidos del ser humano y similares. Si va a destinar las piezas a inmunohistoquímica, prefiera el paraformaldehido. Para 1 litro de formol diluido, mezclar en siguiente orden: • 100 cc de formol concentrado (al 37-40%) • 900 cc de agua destilada • 20 cc de acetato sódico 3-hidrato en polvo A continuación debe agitarse para conseguir una buena mezcla. El recipiente que lo contenga debe estar debidamente rotulado y bien cerrado; la preparación debe hacerse en una habitación bien ventilada. Para Inmunohistoquímica Solución fijadora modificada (en base a paraformaldehido) • 85 mM Na2HPO4 • 75 mM KH2PO4 • 4% Paraformaldehido • 14% (v/v) de ácido pícrico saturado, pH 6.9.
  19. 19. 18 FIJACIÓN POR PERFUSIÓN: RATÓN Materiales a utilizar • Dos recipientes de suero, uno con fijador, y el otro con solución fisiológica • Dos equipos de infusión con su soporte • Equipo de disección • Cánula para perfusión • Soporte de madera e hilo pabilo para la inmovilización • Papel absorbente, inyectadoras, anestésicos, guantes Procedimiento: • Anestesia del espécimen con pentotal sódico (40mg./Kg.) o Ketamina (100mg./Kg.) por vía intraperitoneal. También puede ser utilizado éter o cloroformo por inhalación en campana de vidrio • Fijar el espécimen a un soporte que sostenga todas sus extremidades • Hacer incisión medial de la piel para exponer la caja toráxica • Realizar dos incisiones a la parrilla costal en las líneas axilares anteriores y levantar la parrilla costal • Exponer el corazón y localizar el ventrículo izquierdo • Hacer una pequeña incisión con el bisturí en dicho ventrículo e introducir la cánula hasta llegar a la arteria aorta ascendente. Ligar la cánula a la aorta en forma cuidadosa • Comenzar a pasar la solución fisiológica (isotérmica al espécimen) a través de la cánula para extraer por completo la sangre del animal, esto con la finalidad de evitar vasoconstricción. Simultaneo a este paso, se debe hacer una pequeña incisión en el ventrículo derecho del animal, para que drene el liquido que está siendo introducido • Cuando se observe que la solución fisiológica ya está drenando por el ventrículo derecho, es el momento de iniciar la perfusión con el líquido fijador, en este caso, formol tamponado al 10% durante 30-40 minutos aproximadamente
  20. 20. 19 • En el momento en que el fijador penetra en el torrente circulatorio, se observa que el animal comienza a presentar fibrilaciones musculares, lo que indica que el fijador está pasando en forma adecuada. • Luego de agotado el tiempo, se desmonta el espécimen y se aprecia que tiene la apariencia de piel tipo suela, lo que indica una fijación satisfactoria en principio • Se hace la disección de los órganos a utilizar, se hacen los cortes en piezas del tamaño respectivo, y se colocan de inmediato en líquido fijador (por inmersión) para seguir luego con los siguientes pasos de la técnica. Anatomía torácica del ratón Es importante tomar en cuenta que el ventrículo izquierdo (resaltado en negro) es posterior, por lo que la incisión y la canulación deben ser cuidadosamente realizadas, para el éxito de la técnica.
  21. 21. 20 MÉTODOS DE DESHIDRATACIÓN La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la remoción o eliminación completa del agua de los tejidos o muestra tisular para que se pueda embeber adecuadamente en un medio de inclusión no hidrosoluble, para que se solidifique y así permitir el corte de los tejidos. La deshidratación podrá realizarse utilizando cualquier reactivo capaz de absorber el agua de los tejidos, mediante el empleo de agentes químicos deshidratantes, entre los cuales se encuentran los alcoholes, o por procedimientos físico-químicos como la criodesecación y la criosustitución. Un buen agente deshidratante debe cumplir con las siguientes condiciones: • No debe alterar las estructuras titulares. • Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante. • Debe ser rápido. • Reducir a un mínimo necesario el endurecimiento que provoca en los tejidos • Baja toxicidad o peligrosidad (por contacto, ingestión, inhalación y evaporación de gases tóxicos. • Mínimos riesgos de incendio/explosión. Para el proceso de deshidratación se prefiere utilizar los alcoholes isopropílico o etílico, debiéndose cumplir con los siguientes parámetros: • Graduación de los alcoholes: Empleando una serie de alcoholes de gradación ascendente (70%,80%,95% y 100%), se evitaría la marcada retracción del tejido por la acción brusca que produciría someterlo a una elevada gradación de este agente deshidratante. • Volumen y número de baños de deshidratación: El volumen de baño debe por lo menos 10 veces superior al volumen de la muestra que se vea a deshidratar. Se recomienda realizar el mayor número de baños para ayudar a un estado de equilibrio entre el estado de hidratación del tejido y el alcohol. • Duración de la deshidratación: Se halla en función del volumen de los fragmentos titulares y de su contenido de agua. Debe ser completa y evitar exposiciones prolongadas para no provocar endurecimiento de los tejidos.
  22. 22. 21 • Empleo de agentes accesorios: Como el Sulfato de cobre anhidro, óxido de calcio, resinas humectantes, etc., porque eliminan el exceso de agua en el propio agente deshidratante consiguiendo un efecto deshidratante más uniforme. Principales agentes deshidratantes • Alcohol etílico • Alcohol metílico • Acetona • Alcohol butílico • Dióxido de etileno • Alcohol isopropílico • Tetrahidrofurano
  23. 23. 22 PROTOCOLO DE DESHIDRATACIÓN PARA BIOPSIAS PEQUEÑAS Tiempo total de procesamiento: 3 – 4 horas • Enjuague la muestra de tejido en agua corriente durante 15 minutos para desenmascarar antígenos para un futuro uso en inmunohistoquímica. • Colocar la muestra de tejido en alcohol al 80%. • Someter la muestra de tejido a alcohol al 95% realizándose 3 cambios de 15 minutos cada uno. • Someter la muestra de tejido a alcohol absoluto, se realizarán 3 cambios de 15 minutos cada uno. • Colocación de la muestra a partes iguales de alcohol absoluto y xilol 15 minutos. • Colocación de la muestra en Xilol realizando 2 cambios de 15 minutos cada uno. • Colocación en parafina realizándose 3 cambios de 15 minutos cada uno. • Incluir la muestra de tejido en parafina. Para muestras grandes (realizar sólo si las muestras no se pueden empequeñecer más) • Enjuague la muestra de tejido en agua corriente durante 30 minutos para desenmascarar antígenos para un futuro uso en inmunohistoquímica. • Se realizarán 5 cambios de alcohol de 45 minutos cada uno. Si el espécimen o muestra de tejido es grande 60 minutos cada uno. 80%, 90%, 95% y 99%. • 1 cambio de xilol-alcohol de 45 minutos. Si la muestra es grande 60 minutos. • 2 cambios de xilol de 45 minutos cada uno. Si es grande el espécimen 60 minutos cada uno. • 3 cambios de parafina de 45 minutos cada uno. Si es grande la muestra 60 minutos cada uno.
  24. 24. 23 IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA Es el procedimiento más utilizado que se realiza para poder cortar los tejidos tratados, en secciones suficientemente delgadas que permitan el paso de la luz, de modo que los detalles finos puedan ser observados con distintos microscopios en sus diversas capas. Aunque los tejidos adquieren cierta consistencia al ser sometidos a la fijación, por lo general continúan siendo demasiado blandos para poder cortarlos en láminas delgadas, por lo tanto, es necesario que la porción de tejido a estudiar infiltre y englobe dentro de sí una sustancia líquida o semilíquida, de modo que una vez solidificada adquiera la suficiente dureza para formar bloques que puedan cortarse. Los materiales empleados con esta finalidad, por lo general son sustancias como la parafina. También pueden utilizarse como medios de inclusión, procedimientos físicos como la congelación con CO2 comprimido o freon a – 150º C; éste tipo de procedimiento se utiliza con tejidos frescos (recién tomada la muestra). Se requiere del uso de microtomos de congelación, criostato y de personal experto, pues es necesaria la destreza y mayor rapidez en la ejecución, ya que el tejido al congelarse si no es cortado rápidamente, se le forman cristales de agua que ocasionan deterioro de la nuestra. Se utiliza este tipo de inclusión para el estudio de biopsias y de histoquímica celular (ejem: lípidos, enzimas). Inclusión en parafina La parafina es un hidrocarburo saturado de cadena lineal. Es un residuo del petróleo obtenido por destilación del crudo; de color blanquecino, insoluble en agua, soluble en cloroformo, xilol, toluol, benzol. Es muy estable químicamente. A temperatura ambiente se solidifica y funde a temperaturas comprendidas entre 33 y 60ºC. Para la inclusión en parafina deben cumplirse los siguientes pasos de impregnación • La parafina sólida, se hace líquida, fundiéndola sobre una platina (plancha metálica, eléctrica con temperatura regulable), introducida en recipientes de porcelana, resistentes al calor.
  25. 25. 24 • Se lleva la muestra al recipiente que contiene parafina líquida (se debe mantener la temperatura constante entre 50º a 56ºC, por un tiempo de 24 horas en la estufa), para iniciar así la fase de impregnación. • La muestra se debe pasar por 3 baños de parafina líquida, en recipientes separados (cada 2 horas, en uno), en las condiciones previamente descritas, para que ésta penetre profundamente. • Se retira la biopsia de la última parafina líquida (la más pura) y se lleva al recipiente formador del bloque o un molde para realizar la inclusión. • No olvide: Reflexionar detenidamente la orientación que le dará a la muestra en el bloque. Debe asegurar que aquello que desee cortar más tarde enfrente el fondo del molde pues esa será la cara de corte. • La muestra se introduce al molde que debe ser rellenado previamente con parafina líquida. Antes de introducir la muestra, retire las burbujas del fondo del molde pasando una pinza caliente. Se tendrán algunos segundos para orientarla antes de que la parafina comience a solidificar. Se recomienda meter la muestra a la parafina líquida de tal manera que caiga al fondo del molde con una relativa orientación evitando su reacomodación. Luego, se deja solidificar por varias horas. • No incluya más de un órgano por bloque. Sea ordenado para no perder el seguimiento de sus muestras más tarde. Además, los bloques con muchos tipos de tejidos distintos crean densidades distintas que terminan dañando la navaja y haciéndola durar menos y crear artefactos en los cortes. Existen técnicas específicas para la confección de tissue-arrays, si este es su ideal, consulte una guía adecuada. • Se desmolda el material solidificado y se lleva al micrótomo para ajustarlo al portabloques y proceder a cortar.
  26. 26. 25 CORTE DE LOS TEJIDOS Existen 2 tipos de hojas desechables en el mercado hoy en día: Hojas de bajo y alto perfil. Para la mayoría de los tejidos, las hojas de alto perfil funcionan muy bien y son las más utilizadas. La diferencia entre ambas es muy subjetiva. Pasos para cortar • Antes de cortar un bloque hay que examinarlo y saber cómo va a ser orientado en el portabloque. • Remover el exceso de parafina de los lados creando una pirámide truncada. • Colocar el bloque en el portabloque. • Ajuste bien los tornillos del portabloque. • Oriente y ajuste con los tornillos de direccionamiento (eje x e y) hasta que el bloque quede completamente paralelo al porta cuchilla. • Coloque la cuchilla. Si va a realizar procedimientos inmunohistoquímicos, se recomienda realizar un lavado de las cuchillas en xilol antes de utilizarlas pues muchos fabricantes les colocan aceite que puede más tardíamente, desprender los cortes. Además, disponga de portaobjetos silanizados para adherir sus cortes. • Proceda a desgastar. El desgaste se basa en cortes gruesos de 10 micrones hasta llegar al tejido. Para comprobar que se ha llegado al mismo, observe como la luz da al bloque. Si la superficie donde se ubica el corte se ve opaca al reflejo luminoso, entonces ha llegado al tejido. • Una vez logrado, reajuste a 5 micrones y tome cortes. Se sugiere enfriar el bloque con un hielo de vez en cuando para facilitar el proceso. Recuerde que debe cortar hasta obtener un corte representativo de la muestra. Para asegurarse de ello, observe en el microscopio a baja luminosidad, algunos cortes que realice y asegúrese de que la macroestructura que busca se encuentre presente. • Estire su corte en un baño de agua destilada a 45 grados.
  27. 27. 26 Importante: Aun cuando su estudio se base en la obtención de cortes seriados, no coloque la cinta en un solo portaobjetos. Separe los cortes uno a uno en el baño son sondas dentales o un objeto punzante y rotule los portaobjetos con números que hagan referencia al orden de los cortes. De esta manera, en pasos posteriores, si decide realizar inmunohistoquímica y desea dedicar cortes para sus controles, estos no se contaminarán con los químicos que aplique a los tejidos adyacentes. Sellado de bloques Una vez que la secciones deseadas se hallan cortado, remueva el bloque del portabloque y selle la superficie expuesta con parafina derretida. Esto hace que los tejidos no se sequen y que no se expongan duros y quebradizos, facilitando así la obtención de nuevas secciones semanas, meses, y aun años más tarde. Sin embargo, para muestras escasas, no realice este procedimiento puesto que durante un nuevo desgaste, puede llegar a removerse mucho tejido. Es preferible para estos casos, almacenar los bloques a 4°C.
  28. 28. 27 TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA Hematoxilina La hematoxilina es un colorante natural y de naturaleza química básica que se extrae de la corteza del árbol Hematoxylon campechianum, oriundo de Centroamérica. En el comercio se encuentra en forma de cristales rosados o amarillentos solubles en agua o en alcohol. Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilina en su forma natural no es un colorante, para ser empleada como tal, ha de ser oxidada previamente a hemateína. Tras el proceso de oxidación, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial agregándole determinados grupos auxocromos que, además, le confieren un carácter fuertemente básico y son los responsables de su especificidad por los núcleos celulares. Como auxocromos se emplean sales metálicas bivalentes o trivalentes, por lo general en forma de alumbres de tal forma que se forman diversas lacas de hematoxilina de carácter catiónico y tonalidad azulada o negruzca, dependiendo de la sal metálica utilizada. La laca de hematoxilina más utilizada es la producida a partir del alumbre alumínico-potásico, conocida también en forma genérica como hemalumbre.
  29. 29. 28 Preparación de Hematoxilina Reactivos • Alumbre de Amonio o de Potasio (mordiente) 50 g • Cristales de hematoxilina 1 g • Yodato de Sodio 0,2 g • Ácido cítrico 1 g • Hidrato de cloral (bactericida) 50 g • Agua destilada 1000 mL Procedimiento • Calentar la mitad del volumen de agua destilada a una temperatura por debajo del punto de ebullición. • Pesar el alumbre de amonio o de potasio y agregarlo al agua que se está calentando hasta que se disuelva. • Pesar los cristales de hematoxilina y agregarlos hasta que se disuelvan (aproximadamente en 20 minutos). • Agregar el resto del agua destilada. • Pesar y agregar el ácido cítrico, dejar reposar por 10 minutos. • Pesar y agregar el yodato de sodio, dejar reposar por 10 minutos. • Pesar y agregar el hidrato de cloral, dejar reposar por 10 minutos. • Envasar en frasco ámbar y almacenar en la oscuridad. Mientras más tiempo permanezca en depósito, el proceso de maduración del colorante será mejor y se obtendrán mejores resultados.
  30. 30. 29 Eosina La eosina es un colorante xanténico artificial y de naturaleza química ácida, es un derivado hidroxianténico halogenado con tres grupos arilo. Las diferencias de coloración que existen entre ellos están motivadas por el tipo y número de átomos de halógeno que contienen (eosina Y: cuatro átomos de bromo y la eosina B: dos átomos de bromo). En general, los colorantes xanténicos tienen autofluorescencia espontánea y colorean los tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosado. Por lo común, se difunden fácilmente en las estructuras hísticas, sobre todo en las más compactas, a las cuales tiñen debido a que, por su carácter ácido, son atraídos fuertemente hacia los radicales básicos de la histidina, lisina y arginina presentes en las proteínas citoplasmáticas y tisulares. Preparación de Eosina Solución “A” • Reactivos Cantidad • Eosina amarillenta (Y) 3 g • Alcohol etílico o isopropílico 300 mL • Agua destilada 200 mL Solución “B” • Reactivo Cantidad • Biebrich escarlata 1 g • Agua destilada 100 mL Procedimiento • Preparar las 2 soluciones por separado. Las dos soluciones constituyen la solución madre. • Tomar 1 parte de la solución madre y 3 partes de alcohol al 70 %. • Agregar 3 –6 gotas de ácido acético.
  31. 31. 30 Método de la Hematoxilina-Eosina Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de hematoxilina (generalmente se emplea la de Harris, aunque también se emplean la de Mayer y la de Ehrlich). Por lo común, este método siempre consta de una etapa inicial, en la que se colorean los núcleos celulares con la hematoxilina, y una fase ulterior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares con la eosina. Procedimiento Técnico Soluciones • Xilol • Alcohol isopropílico al 95 % • Agua corriente • Hematoxilina • Eosina • Xilol/Alcohol Protocolo para cortes de bloques en parafina • Desparafine y rehidrate la muestra. • Bañe en agua corriente durante 2-3 minutos, agitar suavemente. • Sumerja en hematoxilina por 5 minutos • Bañe en agua corriente por 5 minutos. • Sumerja en eosina (sumergir porta-objetos y sacarlo inmediatamente) • 3 baños rápidos en alcohol isopropílico al 95 %. • Deshidrate, aclare y monte en medio permanente. Para cortes por congelación, omita la desparafinación y la rehidratación pues el corte ya está hidratado.
  32. 32. 31 INTRODUCCIÓN A LA INMUNOHISTOQUÍMICA Antes de aventurarse en la inmunohistoquímica (IHQ), reconozca el mejor procedimiento a realizar para su objetivo de estudio. Si necesita realizar un estudio que involucre la evaluación de marcadores antigénicos y observación simultánea de estos respecto a la histología del tejido, prefiera una IHQ del tipo cromogénica. Si desea semicuantificar el marcador antigénico evaluado, sin importar su relación histológica, utilice IHQ del tipo fluorescente. Si desea evaluar más de un marcador, debe considerar que se pueden realizar IHQs cromogénicas e IHQs fluorescentes para dos o más marcadores. La IHQ cromogénica debe utilizar cromógenos de colores muy contrastantes para no ser confundidos tras su observación (Ej.: Rojo y azul, ambos intensos) ni confundidos con la hematoxilina (utilizada comúnmente como counterstain en IHQ). Además, debe considerarse que nunca se debe evaluar a través de este método, antígenos localizados en el mismo compartimiento subcelular. Tampoco realice evaluaciones de antígenos escasos a menos de que pretenda utilizar un método de amplificación. Se pueden utilizar cocteles de anticuerpos en esta técnica. Sin embargo, asegúrese de que todos los anticuerpos hayan sido generados en animales distintos, incluso sus anticuerpos secundarios y que tengan conjugadas enzimas distintas que metabolicen sustratos distintos. Si no utiliza cocteles de anticuerpos, deberá realizar una IHQ simultánea que es, básicamente, IHQs simples consecutivas. Para estos casos, si pretende usar DAB o alguna de sus formas comerciales modificadas,
  33. 33. 32 utilícelo como primer cromógeno en el paso de revelado. Recuerde bloquear los elementos endógenos (biotina, peroxidasa, etc.) y considere bloquear la peroxidasa endógena en caso de usarla, después de aplicar su anticuerpo primario (o su coctel) puesto que de ser aplicada antes, puede bloquear sitios antigénicos (con peróxido) constituyendo un gran problema para los anticuerpos monoclonales. No se recomienda evaluar más de 3 antígenos a la vez. Las muestras pueden almacenarse y observarse cuantas veces se desee. La IHQ fluorescente Permite la utilización de cocteles sin mayores problemas. No es un método enzimático por lo que se omite todo tipo de pasos de bloqueos (a excepción del bloqueo de uniones proteicas inespecíficas). Debe tenerse en cuenta siempre la autofluorescencia de los tejidos y la elección de fluoróforos con un rango de emisión luminosa lejano endógeno. Existen técnicas para disminuir la autofluorescencia de los tejidos. Este es el método por excelencia para la observación de varios antígenos a la vez con distintos colores. Se toman imágenes de cada señal luminosa y luego se fusionan con software (merge). Sin embargo, La duración de la fluorescencia de las muestras es limitada y está sujeta también a su observación por lo que el trabajo debe ser más rápido. Además, si deseamos observar el background histológico necesitaremos un microscopio de polarización o uno de interferencia (DIC). La IHQ fluorescente es semicuantitativa por excelencia. Cabe destacar que la IHQ fluorescente posee escasos métodos de amplificación de señal. Recomendación: El PBS al tener fosfato es un inhibidor de la enzima fosfatasa alcalina. Lo mismo ocurre con la azida de sodio y la peroxidasa. No utilice el PBS para diluir anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina. Evite el uso general del PBS pues puede fosfatar antígenos y modificar su estructura, reduciendo la afinidad del anticuerpo primaro o al contrario, puede generar background inespecífico al fosfatar proteínas que terminen pareciéndose al antígeno buscado (problema para los anticuerpos policlonales, principalmente). Recuerde que los anticuerpos monoclonales son muy específicos y poco sensibles, al reveés de los policlonales.
  34. 34. 33 La gran parte de las IHQs, sea cromogénica o fluorescente, se realizan como indirectas. Esto significa, que utilizan un anticuerpo secundario como medio de amplificación de la señal. Varios anticuerpos secundarios pueden unirse a un anticuerpo primario. Por esta razón, la IHQ es semicuantitativa pues no refleja con plena exactitud la cantidad real de antígeno identificado. Si se dispone de material fresco, es recomendable hacer otros ensayos si nuestro estudio tiene fines principalmente cuantitativos. La IHQ entrega una aproximación cuantitativa sobre la base de tejido preservado en parafina y además permite establecer el vínculo histológico. Para el caso de la IHQ fluorescente, establece más bien un vínculo celular por sobre el tejido completo. Fig. 15. Métodos de amplificación para la señal cromogénica. Importante: Todo trabajo científico debe ser validado con controles claros y con la menor cantidad de background posible para el caso de las IHQs. Si tiene background persistente en sus IHQs, realice ensayos de dilución de sus anticuerpos primarios (1:100, 1:200, 1:500). Si el problema persiste, aumente en 1 la cantidad de lavados para el anticuerpo primario y para el anticuerpo secundario. Si el problema persiste, aumente los tiempos de bloqueo en 10 minutos. Esto para peroxidasa endógena y biotina endógena (u otros). Si el problema persiste y si su anticuerpo es policlonal, puede que no sea lo suficientemente específico. Purifique su anticuerpo. Realice sus controles en frascos aparte de sus muestras. Reemplace las incubaciones a 37°C por incubaciones overnight a 4°C. Vaya comprobando una a una estas variables.
  35. 35. 34 PROTOCOLO: RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA Por K. Walker La recuperación antigénica es una etapa necesaria para la realización de inmunoensayos sobre muestras que hayan sido fijadas e incluidas en parafina. Requiere que las muestras hayan sido rehidratadas previamente. De las técnicas de recuperación antigénica, se prefiere la técnica de HIER (heat induced epitope retrieval) la cual se basa en el desenmascaramiento de los epítopes antigénicos a través de la exposición de los cortes histológicos a temperaturas entre 95-100°C. • Se llenan contenedores de vidrio temperado de aproximadamente 250 ml de capacidad con buffer citrato de sodio (10[mM] Citrato de sodio, 0.05% Tween 20, pH 6.0) y se les colocó su tapa respectiva. • Luego, los contenedores se colocan en el horno microondas doméstico y se hierve el buffer. • Una vez hervido el buffer, con un termómetro se comprueba constantemente que la temperatura una vez retirada la tapa del contenedor no descendiera de los 95°C. • Se retiraran las burbujas acumuladas al fondo del contenedor para evitar que suban durante el proceso y desprendan los cortes de los portaobjetos. • Luego, se procede a retirar rápidamente el canastillo con los cortes rehidratados desde el agua destilada para depositarlos dentro del buffer recién hervido. • Luego se coloca la tapa al contenedor y se lleva a una vaporera precalentada durante 10 minutos para iniciar la recuperación antigénica por 30 minutos. • Una vez concluidos los 30 minutos, se procede a enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos el contenedor destapado. • Luego, por otros 10 minutos se hace pasar agua corriente por sus paredes.
  36. 36. 35 PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN Por K. Walker Detección con enzima peroxidasa (HRP) • Una vez concluido el procedimiento de recuperación antigénica, se retiran los cortes histológicos del buffer y se lavan 2 veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X-100. • Todos los lavados se realizan en contenedores de aproximadamente 250 ml de capacidad, con los cortes dispuestos en canastillos. • Las incubaciones y bloqueos se realizan fuera de los canastillos, de manera individual. • Bloquee uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de caballo al 2,5% (u otra) por 30 minutos. • Remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a secar sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte. • Luego, aplique el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo e incube con éste durante 1 hora y 30 minutos a 37°C. • Luego, proceda a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación leve. • Posteriormente, incube con una solución bloqueadora de peroxidasa endógena por 30 minutos. • Luego, proceda a aplicar el anticuerpo secundario conjugado la enzima HRP. Incube durante 1 hora a temperatura ambiente. • Lave 4 veces durante 5 minutos en TBS. • Proceda a revelar la localización de los anticuerpos a través de la utilización del sustrato cromogénico 3,3′-Diaminobenzidina (DAB) para HRP (u otro) siguiendo las instrucciones del fabricante (por lo general, 2 minutos de DAB es suficiente). • Pasado los 2 minutos, detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3 minutos. • Use hematoxilina para contrateñir seguido de un lavado de 5 minutos en agua corriente con leve agitación, un enjuague suave en agua destilada y una deshidratación en una batería de etanoles ascendentes. Aclare y monte con medios compatibles con su cromógeno. Para cubrir un tejido es suficiente con 50 µl. 1 Gota (drop) equivale a 0.065ml.
  37. 37. 36 PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA CON AMPLIFICACIÓN Por K. Walker Amplificación con método ABC (VECTASTAIN® Elite® ABC system, Vector Laboratories®) • Una vez concluido el procedimiento de recuperación antigénica, se retiran los cortes histológicos del buffer y se lavan 2 veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X-100. • Todos los lavados se realizan en contenedores de aproximadamente 250 ml de capacidad, con los cortes dispuestos en canastillos. • Las incubaciones y bloqueos se realizan fuera de los canastillos, de manera individual. • Bloquee uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de caballo al 2,5% (u otra) por 30 minutos. • Remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a secar sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte. • Luego, aplique el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo e incube con éste durante 1 hora y 30 minutos a 37°C. • Luego, proceda a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación leve. • Posteriormente, incube con una solución bloqueadora de peroxidasa endógena por 30 minutos. • Proceda a aplicar el anticuerpo secundario conjugado con biotina (prediluted universal biotinylated anti-mouse/rabbit IgG secondary antibody). Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. • Luego, se proceda a lavar 3 veces durante 5 minutos en TBS. • Proceda a aplicar el medio de amplificación basado en estreptavidina conjugada con HRP (ready-to- use stabilized ABC reagent). Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. • Luego, proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS. • Revele la localización de los anticuerpos a través de la utilización del sustrato cromogénico DAB para HRP (u otro) siguiendo las instrucciones del fabricante (por lo general, 2 minutos de DAB es suficiente). • Pasado los 2 minutos, se detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3 minutos. • Use hematoxilina para contrateñir seguido de un lavado de 5 minutos en agua corriente con leve agitación, enjuague suave en agua destilada y deshidratación en una batería de etanoles ascendentes. Aclare y monte con medios compatibles con su cromógeno. Para cubrir un tejido es suficiente con 50 µl. 1 Gota (drop) equivale a 0.065ml.
  38. 38. 37 PROTOCOLO: IHQ DOBLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN Por K. Walker Detección con enzima peroxidasa (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Método consecutivo sin cocteles. • Una vez concluido el procedimiento de recuperación antigénica, se retiran los cortes histológicos del buffer y se lavaron dos veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X- 100. • Todos los lavados se realizan en contenedores de aproximadamente 250 ml de capacidad, con los cortes dispuestos en canastillos. • Las incubaciones y bloqueos se realizan fuera de los canastillos, de manera individual. • Proceda a bloquear uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de caballo al 2,5% (u otro) por 30 minutos. • Luego, remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a secar sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte. • Aplique el primer anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo e incuba con éste durante 1 hora y 30 minutos a 37°C. • Proceda a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación leve. • Incube en una solución bloqueadora de peroxidasa endógena por 30 minutos. • Proceda a aplicar el primer anticuerpo secundario conjugado con la enzima HRP. Se incuba con este anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. • Proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS. • Terminado el lavado, proceda a revelar la localización de los anticuerpos a través de la utilización del sustrato cromogénico DAB (u otro) para HRP siguiendo las instrucciones del fabricante del kit utilizado. • Pasado el tiempo de incubación con DAB, detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3 minutos. Luego, se procede a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS. • Posteriormente, proceda a bloquear uniones inespecíficas con la solución de bloqueo por 30 minutos. • Sin lavar, aplique el segundo anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo y e incube durante 2 horas a 37°C. • Luego, proceda a lavar dos veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación leve.
  39. 39. 38 • Posteriormente, proceda a aplicar el segundo anticuerpo secundario conjugado con la enzima AP. Incube con este anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. • Terminada la incubación, se proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS. • Terminado el lavado, proceda a revelar la localización de los anticuerpos a través de la utilización del kit de sustrato cromogénico para fosfatasa alcalina (Ej.: StayRed/AP Plus, ABCAM®) siguiendo las instrucciones del fabricante y estandarizando el tiempo de incubación. Se sugiere para este kit, 12 minutos. • Pasado los 12 minutos, detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3 minutos. • Se usa hematoxilina para contrateñir seguido de un lavado de 5 minutos en agua corriente con leve agitación, un enjuague suave en agua destilada y una deshidratación en una batería de etanoles ascendentes terminada en un aclaramiento con xilol y montaje con el medio permanente. Aclare y monte con medios compatibles para ambos cromógenos. Para cubrir un tejido es suficiente con 50 µl. 1 Gota (drop) equivale a 0.065ml.
  40. 40. 39 PROTOCOLO: IHQ DOBLE FLUORESCENTE SIN AMPLIFICACIÓN Por K. Walker Detección simultánea con cocteles de anticuerpos. • Una vez concluido el procedimiento de recuperación antigénica, se retiran los cortes histológicos del buffer y se lavaron dos veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X- 100. • Todos los lavados se realizan en contenedores de aproximadamente 250 ml de capacidad, con los cortes dispuestos en canastillos. • Las incubaciones y bloqueos se realizan fuera de los canastillos, de manera individual. • Proceda a bloquear uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de caballo al 2,5% (u otro) por 30 minutos. • Luego, remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a secar sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte. • Aplique el coctel de anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo e incube overnight a 4°C. • Proceda a lavar 3 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación leve. • Proceda a aplicar el coctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos distintos. Incube con este anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. Desde este momento, procure no exponer directamente a la luz sus muestras. • Proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS. • Terminado el lavado, proceda a revelar contrastar los núcleos con DAPI de ser necesario. Recuerde que DAPI es un agente intercalante del DNA y puede obscurecer antígenos nucleares que esté buscando. • Luego, proceda a lavar 1 vez durante 5 minutos en TBS. • Monte con un medio de base acuosa con anti-fade. • Observe dentro de las próximas 12 horas. • Realice todas sus mediciones basándose en los resultados de su control negativo. Trate de tomar las fotografías apenas termine su IHQ o siempre al cabo de la misma cantidad de horas de terminado el experimento. Para cubrir un tejido es suficiente con 50 µl. 1 Gota (drop) equivale a 0.065ml.
  41. 41. 40 SOLUCIONES ÚTILES Buffer citrate de sodio (10 mM Sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g • Agua destilada 1000 ml • Mezclar hasta disolver. Ajustar pH a 6.0 con 1N HCl. Agregue 0.5 ml de Tween 20 y mezcle. Almacene a temperatura ambiente por 3 meses o a 4°C para un almacenamiento más largo. Buffer de bloqueo universal (Universal Blocking Buffer) • 1% BSA (Bloqueador y estabilizador) • 0.1% cold fish skin gelatin (bloqueador) • 0.5% Triton X-100 (Mejorador de la penetración) • 0.05% sodium azide (preservante) • 0.01M PBS, pH 7.2-7.4 Mezcle y almacene a 4 ºC. No lo utilice para diluir anticuerpos conjugados a HRP. Solución bloqueadora de peroxidasa (Peroxidase Blocking Solution) Peroxidase Blocking Solution (3% H2O2 in TBS) • 10 ml de 30% H2O2 • 90 ml de 1X TBS Almacene a 4°C por un máximo de 3 meses. Usar después de la incubación con el anticuerpo primario. Se recomienda usar solo en cortes de bloques de parafina.
  42. 42. 41 Solución bloqueadora de peroxidasa en base a Metanol (0.3% H2O2 in Methanol) • 1 ml de 30% H2O2 • 99 ml de Methanol Almacene a 4°C por un máximo de 3 meses. Bloquee los cortes por 20-30 minutos antes del bloqueo con suero o solución de bloqueo universal y antes la incubación con el anticuerpo primario. Esta solución se recomienda usar solo en cortes por congelación. Solución bloqueadora de fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase Blocking Solution) • 2M Levamisole o levamizol Disolver 0.5g de levamizol en 1mL de agua destilada. Levamisole hydrochloride tiene una solubilidad de 50mg/mL y cuando se disuelve forma una solución transparente.Las soluciones son estables hasta un mes luego de su preparación manteniéndolas a 4°C. Se usa es casos especiales pues HIER inactiva la AP. Paraformaldehido (al 4%, tamponado) A) 8% Paraformaldehyde • 40 g de Paraformaldehido • 500 ml de agua destilada B) Buffer fosfato 0.2M, pH 7.4 • 10.9 g de Na2HPO4 • 3.2 g de NaH2PO4 • 500 ml de agua destilada
  43. 43. 42 La solución debe estar a pH 7.4. El pH solo se puede ajustar agregando sal monobásica. Caliente la solución al 8% de PFA hasta los 60ºC mientras revuelve (No permita que la temperatura exceda los 60ºC). Una vez que la solución ha llegado a los 60°C y se ha disuelto todo el soluto, agregue 500 ml de Buffer fosfato 0.2M, para hacer de la solución una al 4% PFA. Cuidadosamente agregue NaOH 1N hasta que la solución transparente (1-2 gotas por cada 500 ml). Enfríe la solución y luego filtre. Prepare al momento de usar.
  44. 44. 43 BREVE INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESTADÍSTICOS Una de las aplicaciones de la estadística es hacer inferencias a poblaciones, a partir de muestras. En la realización de este proceso inferencial, siempre existe el riesgo de error o imprecisión ya sea por el azar o la variabilidad biológica del fenómeno a estudiar. La carencia de error aleatorio debido al azar se conoce como precisión. Cuanto más grande es el tamaño muestral, mayor es la precisión y la variabilidad explicada por el azar disminuye. Esta posibilidad de error o falta de precisión, siempre que no existan sesgos o variables de confusión, se corrige aumentando el tamaño de la muestra. De cualquier manera el papel del azar debe ser siempre contemplado, evaluado y medido, realizando test de hipótesis o construyendo intervalos de confianza para conocer la precisión de nuestra estimación dentro de una seguridad previamente definida. A pesar de las limitaciones de la estadística, el término "estadísticamente significativo" invade la literatura médica y se percibe como una etiqueta que indicase "garantía de calidad". El considerar el término significativo implica utilizar términos comparativos de dos hipótesis. Los test de hipótesis son test de significación estadística que cuantifican hasta qué punto la variabilidad de la muestra puede ser responsable de los resultados de un estudio en particular. Ejemplo de lo anterior: Disponemos de 2 tratamientos (A y B). El tratamiento A lo reciben 25 pacientes y el tratamiento B otros 25 pacientes. 15 pacientes responden favorablemente al tratamiento A y 20 al tratamiento B. ¿Existe diferencia significativa entre ambos tratamientos? Ho (hipótesis nula) = No hay diferencia entre ambos tratamientos. Ha (hipótesis alternativa) = Sí existe diferencia. El proceso de aceptación o rechazo de la hipótesis lleva implícito un riesgo que se cuantifica con el valor de la "p", que es la probabilidad de aceptar la hipótesis alternativa como cierta, cuando la cierta podría ser la hipótesis nula. El valor de "p" que indica que la asociación es estadísticamente significativa ha sido arbitrariamente seleccionado y por consenso se considera en 0.05. Una seguridad del 95% lleva implícito una p < de 0.05 y una seguridad del 99% lleva implícita una p < 0.01. Cuando rechazamos la Ho (hipótesis nula) y aceptamos la Ha (hipótesis alternativa) estamos diciendo en otras palabras
  45. 45. 44 que es muy poco probable que el azar fuese responsable de dicha asociación. Del mismo modo si la p>0.05 decimos que el azar no puede ser excluido como explicación de dicho hallazgo y no rechazamos la Ho (hipótesis nula). Los tests de hipótesis Al iniciar el análisis estadístico de una serie de datos, y después de la etapa de detección y corrección de errores, un primer paso consiste en describir la distribución de las variables estudiadas y, en particular, de los datos numéricos. Una de las distribuciones teóricas mejor estudiadas en los textos de bioestadística y más utilizada en la práctica es la distribución normal, también llamada distribución gaussiana. Su importancia se debe fundamentalmente a la frecuencia con la que distintas variables asociadas a fenómenos naturales y cotidianos siguen, aproximadamente, esta distribución. Caracteres morfológicos (como la talla o el peso), o psicológicos (como el cociente intelectual) son ejemplos de variables de las que frecuentemente se asume que siguen una distribución normal. No obstante, y aunque algunos autores6,7 han señalado que el comportamiento de muchos parámetros en el campo de la salud puede ser descrito mediante una distribución normal, puede resultar incluso poco frecuente encontrar variables que se ajusten a este tipo de comportamiento. Uno de los análisis estadísticos más comunes en la práctica es probablemente el utilizado para comparar dos grupos independientes de observaciones con respecto a una variable numérica. Este test corresponde a t de Student para dos muestras independientes. La aplicación de un contraste paramétrico como este test requiere la normalidad de las observaciones para cada uno de los grupos. La comprobación de esta hipótesis puede realizarse tanto por métodos gráficos (por medio de histogramas, diagramas de cajas o gráficos de normalidad) como mediante tests estadísticos (test de Kolmogorov-Smirnov, test de Shapiro-Wilks). El caso en el que se dispone de dos grupos de observaciones independientes con diferentes varianzas, la distribución de los datos en cada grupo no puede compararse únicamente en términos de su valor medio. El contraste estadístico planteado en el apartado anterior requiere de alguna modificación que tenga en cuenta la variabilidad de los datos en cada población. Obviamente, el primer problema a resolver es el de encontrar un método estadístico que nos permita decidir si la varianza en ambos grupos es o no la misma. El F test o test de la razón de varianzas viene a resolver este problema.
  46. 46. 45 Esta información no alcanza a abarcar completamente la gran cantidad de tests estadísticos que existen y sus usos respectivos. Pero entrega luces de algunos elementos fundamentales en la comprensión de la utilidad de la estadística como herramienta científica. Si se desea continuar la lectura de este capítulo de la mini-guía, sugiero encarecidamente visitar el sitio web: http://www.fisterra.com/formacion/metodologia-investigacion/ Y realizar los trabajos estadísticos sobre el software Minitab® 17.1.0 que dejaré a libre disposición.
  47. 47. 46 REFERENCIAS 1. Walker K. Evaluación histopatológica de la distribución de las células troncales tumorales en cáncer prostático y sus metástasis en un modelo ortotópico murino. Santiago, Chile. 2014. 2. Bravo M. Manual de procedimientos y técnicas histopatológicas. Morelia, Michoacan. 2011. 3. Conti C, Gimenez-Conti I, Benavides F, Frijhoff A, Conti M. Department of Carcinogenesis, Science Park - Research Division, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Smithville, Texas. American College of Laboratory Animal Medicine. 2004. 4. Kumar GL, Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods Fifth Edition. Carpinteria CA: Dako North America. 2009. 5. Nakata T, Suzuki N. Chromogen-based immunohistochemical method for elucidation of the coexpression of two antigens using antibodies from the same species. J Histochem Cytochem. 2012;60(8):611–9. 6. Cotran RS, Kumar V, Robbins SL. Robbins Pathologic Basis of Diseases, 5a edición, W.B. Saunders Co., Philadelphia. Las imágenes presentadas aquí son de exclusiva autoridad de sus respectivos autores.

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