MORPHOMETRIC ANALYSIS OF LEYDIG CELLS IN THE NORMAL RAT
TESTIS
HIROSHI MORI and A. KENT CHRISTENSEN
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INTRODUCCIÓN
 Las células de Leydig son la principal fuente de andrógenos en el
hombre.

 La característica ultraestruct...
 El total de células de Leydig en 1g de testículo de rata produce
6,7ng de testosterona/min in vivo.
 Si pudiéramos dete...
 Si se pudiese medir el área de la superficie de las membranas
intracelulares donde ocurre la esteroidogénesis, podría co...
PROBLEMA
 Varios trabajos se habían publicado hasta ese entonces, los que
trataban la morfometría testicular en variados ...
OBJETIVO
 Obtener información cuantitativa respecto a las
células de Leydig y sus organelos que pueda ser
correlacionada ...
MATERIALES Y MÉTODOS
4 ratas adultas Sprague-Dowley de
pesos 255g, 265g, 345g y 365g

Inyección intraperitoneal de Trypan
Blue 3% dos días ante...
Se seccionan los testículos
perpendicularmente al eje mayor

10 trozos de un testículo. 5 trozos
para cada tipo de estudio...
Corte de testículo de rata. ST: túbulo seminínero; BV: vasos sanguíneos. Barra: 100 μm. 84x
Tejido intersticial testicular: Células de Leydig; macrófagos (M); BV: capilares. Barra: 10 μm.
Micrografía electrónica a bajo aumento de células de Leydig de testículo fijado por perfusión. Barra: 1 μm.
Citoplasma de dos células de Leydig, mostrando retículo endoplasmático liso (SER), retículo endoplasmático
rugoso (RER), m...
PROCEDIMIENTO
MORFOMÉTRICO
MORFOMETRÍA

 El uso de métodos cuantitativos a microscopía de luz y
electrónica (llamados morfométricos o estereológicos...
Cálculo de densidad volumétrica


MICROSCOPÍA DE LUZ
 Para la estimación de la densidad volumétrica de los túbulos seminíferos y
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 Anteriormente habíamos calculado la densidad volumétrica de la célula
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Cálculo de la densidad numérica

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 Microfotografías en cortes de 0,5 μm de grosor indicaron que las
mitocondrias de las células de Leydig son en su mayoría...
Errores sistemáticos de medición
FACTORES DETERMINANTES
 Fijación

 Deshidratación e inclusión
 Corte
 Distorsión óptica
 Papel de impresión

 Efecto...
FIJACIÓN

Causa del aumento de volumen: presión de perfusión
DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN
 Volumen incrementado en un
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por perfusión.
 Área incrementada en...
CORTE
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Variación de ancho

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Variación de longitud

↑4,8%

↓10,7%

Variación total del área
de corte

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DISTORSIÓN ÓPTICA Y PAPEL

 Distorsión óptica despreciable.
 Papel produce un aumento del área en un 2,2%
ESPESOR DEL CORTE
 Las ecuaciones de morfometría utilizadas en este estudio son estrictamente precisas
sólo para cortes i...
RESULTADOS
Célula de Leydig
Volumen

Área superficial

1209 μm3

1517 μm2

Núcleo (elipsoidal) de célula de Leydig
Razón axial

Diáme...
REL es el organelo más abundante de la célula de Leydig

REL tiene 6,9 veces más área superficial que la membrana plasmáti...
En una célula de Leydig promedio, hubo aproximadamente
622 mitocondrias

Representa el 0,3% del volumen testicular, lo cua...
En una célula de Leydig promedio hay aproximadamente 312
peroxisomas ocupando un volumen celular de 1,2%

El citoplasma co...
CONCLUSION
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Morfometría en MET

  1. 1. MORPHOMETRIC ANALYSIS OF LEYDIG CELLS IN THE NORMAL RAT TESTIS HIROSHI MORI and A. KENT CHRISTENSEN From the Department of Anatomy, Temple University School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania 19140. Dr. Mori's present address is the Department of Pathology, Ehime University School of Medicine, Matsuyama, Ehime 790, Japan, and Dr. Christensen's present address is the Department of Anatomy, The University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan 48109. J . CELL BIOLOGY © The Rockefeller University Press. February 1980; Volume 84; 340-354 Tutor Dr. Enrique Castellón Universidad de Chile Facultad de Medicina Escuela de Tecnología Médica Curso de Microscopía Electrónica Presentador Kenneth Walker
  2. 2. INTRODUCCIÓN  Las células de Leydig son la principal fuente de andrógenos en el hombre.  La característica ultraestructural más prominente exhibida por estas células corresponde a su abundante retículo endoplasmático liso (REL) y sus numerosas mitocondrias.  La biosíntesis de la testosterona es catalizada por enzimas localizadas predominantemente en el REL y en el citoplasma adyacente a éste.  Sin embargo, algunos pasos de la biosíntesis ocurren en la membrana mitocondrial interna, de ahí su abundancia.
  3. 3.  El total de células de Leydig en 1g de testículo de rata produce 6,7ng de testosterona/min in vivo.  Si pudiéramos determinar el número de células de Leydig en 1 gramo de testículo de rata, podríamos calcular el promedio de producción de testosterona por célula. “X” cantidad de células  1gr de testículo  6,7ng de testosterona/min “X” células de Leydig  6,7ng de testosterona/min 1 célula de Leydig  “Y” ng de testosterona/min
  4. 4.  Si se pudiese medir el área de la superficie de las membranas intracelulares donde ocurre la esteroidogénesis, podría conocerse la razón promedio de la síntesis de testosterona por unidad de área. Área total de las superficies esteroidogénicas  1gr de testículo  6,7ng de testosterona/min Área total de las superficies esteroidogénicas  6,7ng de testosterona/min 1µm2  “X”ng de testosterona/min Estos valores podrían dar a conocer la eficiencia bioquímica a nivel de membranas
  5. 5. PROBLEMA  Varios trabajos se habían publicado hasta ese entonces, los que trataban la morfometría testicular en variados aspectos.  Sin embargo, hacía falta un estudio morfométrico más amplio respecto a las células de Leydig en el testículo normal.  Anteriormente, ya se habían realizado estudios en testículos extraídos de ratas con tratamiento hormonal haciendo estimaciones por morfometría.  Sin embargo, las estimaciones se realizaron con un método de preservación de tejidos de inferior calidad al que se propone a través de este trabajo.
  6. 6. OBJETIVO  Obtener información cuantitativa respecto a las células de Leydig y sus organelos que pueda ser correlacionada con la información bioquímica y fisiológica disponible.  Mejorar los protocolos de preservación de los tejidos para obtener un análisis morfométrico más preciso.
  7. 7. MATERIALES Y MÉTODOS
  8. 8. 4 ratas adultas Sprague-Dowley de pesos 255g, 265g, 345g y 365g Inyección intraperitoneal de Trypan Blue 3% dos días antes de sacrificarlos Sacrifican ratas Fijación por perfusión de los testículos de la rata  Glutaraldehido al 3% tamponado con 0,1M Scolidina.
  9. 9. Se seccionan los testículos perpendicularmente al eje mayor 10 trozos de un testículo. 5 trozos para cada tipo de estudio. Microscopía de Luz      Deshidratación con etanoles ascendentes Inclusión Glicol-Metacrilato Cortes de 2µm Tinción Fucsina básica-Azul de toluidina Contratinción con H. Weigert Microscopía electrónica       Post-fijación con OsO4 2% sin tamponar Inmersión solución de Ferrocianuro 1,5% Deshidratación con etanoles ascendentes Impregnación e inclusión en Epon 812 Cortes 500-900A Contraste con acetato de Uranilo 2% y Citrato de plomo
  10. 10. Corte de testículo de rata. ST: túbulo seminínero; BV: vasos sanguíneos. Barra: 100 μm. 84x
  11. 11. Tejido intersticial testicular: Células de Leydig; macrófagos (M); BV: capilares. Barra: 10 μm.
  12. 12. Micrografía electrónica a bajo aumento de células de Leydig de testículo fijado por perfusión. Barra: 1 μm.
  13. 13. Citoplasma de dos células de Leydig, mostrando retículo endoplasmático liso (SER), retículo endoplasmático rugoso (RER), mitocondria (Mit), peroxisomas (Per), y lisosomas (Lys). Barra: 1 μm. 19400 x
  14. 14. PROCEDIMIENTO MORFOMÉTRICO
  15. 15. MORFOMETRÍA  El uso de métodos cuantitativos a microscopía de luz y electrónica (llamados morfométricos o estereológicos) permiten la evaluación de estructuras en tres dimensiones a partir de imágenes bidimensionales
  16. 16. Cálculo de densidad volumétrica 
  17. 17. MICROSCOPÍA DE LUZ  Para la estimación de la densidad volumétrica de los túbulos seminíferos y del tejido intersticial, se estudiaron cinco cortes por animal con una cuadrícula de 441 puntos. La densidad volumétrica de una estructura X se estima como (La suma de los puntos que están sobre la estructura X) (Totalidad de los puntos sobre una entidad a elección que contenga a la estructura X)
  18. 18.  El Volumen de la cápsula testicular se calculó como (Ancho medio de la cápsula del testículo) x (Área de superficie del testículo)
  19. 19.  El conteo para determinar la densidad volumétrica de las células de Leydig, fue hecho con una lente objetiva de 40x y una cuadrícula de 441 puntos.
  20. 20.
  21. 21.
  22. 22.
  23. 23.  El calculo de la densidad numérica por la ecuación de Floderus es preciso solo si los núcleos son esféricos.  En este estudio se observaron núcleos elipsoidales. Sin embargo, el error que puede causar esta característica no es lo suficientemente significativo y puede obviarse.
  24. 24.
  25. 25. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA  Debido a que las células de Leydig se encuentran dispersas en el tejido y solo representan el 2,7% del área del corte, no fue práctico realizar evaluaciones al azar.  Debido a lo anterior, se hizo cortes consecutivos y se montaron en una misma grilla.  Los autores se aseguraron de que la misma célula de Leydig no estuviese en más de una sola microfotografía.
  26. 26. 4 ratas adultos Sprague-Dowley 10 bloques x3 3 ratas 1 rata 20 bloques x1 Microfotografías 10.800X 72.000X Densidad volumétrica de organelos Densidad superficial de organelos Densidad superficial de membrana plasmática de células de Leydig Proveer información adicional de densidad volumétrica de organelos para su comparación
  27. 27. DENSIDAD VOLUMÉTRICA EN ORGANELOS
  28. 28. Determinación de densidad volumétrica de mitocondrias
  29. 29.
  30. 30. Cálculo de la densidad de superficie (Sv)   Número de intersecciones para el organelo PT  Número de puntos al final de las líneas que caen en la célula de Leydig l
  31. 31.  Anteriormente habíamos calculado la densidad volumétrica de la célula de Leydig en el tejido testicular.  Ahora podemos relacionarla con la Sv multiplicándolas para obtener la densidad de superficie de la mitocondria por volumen de tejido testicular.
  32. 32. Cálculo de la densidad numérica 
  33. 33.  Microfotografías en cortes de 0,5 μm de grosor indicaron que las mitocondrias de las células de Leydig son en su mayoría cilíndricas y con sus dos extremos hemisféricos.  Para encontrar el número promedio de mitocondrias por célula, el volumen total de mitocondrias por célula es dividido por el volumen promedio de una sola mitocondria  La multiplicación del promedio de mitocondrias por célula y la densidad numérica de células de Leydig es igual a la densidad numérica de mitocondrias.
  34. 34. Errores sistemáticos de medición
  35. 35. FACTORES DETERMINANTES  Fijación  Deshidratación e inclusión  Corte  Distorsión óptica  Papel de impresión  Efectos del espesor de corte  Tamaño y localización de la muestra
  36. 36. FIJACIÓN Causa del aumento de volumen: presión de perfusión
  37. 37. DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN  Volumen incrementado en un 20,1% después de la fijación por perfusión.  Área incrementada en un 9,6% después del corte  § Factores de corrección fueron aplicados solo a la densidad superficial y diámetro de estructuras MO Reducción MET 22,2% 11,4%
  38. 38. CORTE GMA EPON Variación de ancho ↑9,4% - Variación de longitud ↑4,8% ↓10,7% Variación total del área de corte ↑14,7% ↓10,7% MO Espesor MET 1.76 μm ± 0.03 SEM 51 nm ± 0.52 SEM
  39. 39. DISTORSIÓN ÓPTICA Y PAPEL  Distorsión óptica despreciable.  Papel produce un aumento del área en un 2,2%
  40. 40. ESPESOR DEL CORTE  Las ecuaciones de morfometría utilizadas en este estudio son estrictamente precisas sólo para cortes infinitamente finos  Debido a que los cortes para MET tienen un espesor finito, los volúmenes y áreas superficiales tienden a ser sobreestimados  Weibel y Paumgartner proporcionaron métodos para obtener factores de corrección apropiados dependiendo del tamaño y la forma de las estructuras y el espesor de corte  Estos métodos fueron aplicados para obtener factores de corrección para las densidades volumétricas y superficiales de organelos de las preparaciones de MET y para la densidad volumétrica de los núcleos vistos a MO
  41. 41. RESULTADOS
  42. 42. Célula de Leydig Volumen Área superficial 1209 μm3 1517 μm2 Núcleo (elipsoidal) de célula de Leydig Razón axial Diámetro promedio Área superficial 1,37 6,34 μ 149 μm2
  43. 43. REL es el organelo más abundante de la célula de Leydig REL tiene 6,9 veces más área superficial que la membrana plasmática y constituye aproximadamente el 60% del área de superficie total de la célula de Leydig El complejo de Golgi fue incluido en el conteo del REL por no ser un organelo abundante y ser a veces, muy difícil diferenciarlo del REL REL es muy poco abundante y casi indistinguible
  44. 44. En una célula de Leydig promedio, hubo aproximadamente 622 mitocondrias Representa el 0,3% del volumen testicular, lo cual significa que en 1 g de testículo podría haber 3 mg de mitocondrias de células de Leydig La membrana interna (sitios donde residen las principales enzimas de la biosíntesis de esteroides) tiene una superficie 1,8 veces más grande que la membrana externa, pero esta superficie es menor que la del SER en un factor de 3,6.
  45. 45. En una célula de Leydig promedio hay aproximadamente 312 peroxisomas ocupando un volumen celular de 1,2% El citoplasma constituye del 61,9-70,6% del volumen citoplasmático. Contiene ribosomas libres y polisomas, microfilamentos, microtúbulos, y otros componentes citoplasmáticos
  46. 46. CONCLUSION

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