2.3.04 leucosis bovina

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 503
C A P Í T U L O 2 . 3 . 4 .
LEUCOSIS BOVINA ENZOÓTICA
RESUMEN
La leucosis bovina enzoótica (LBE) es una enfermedad del ganado bovino adulto causada por el
retrovirus de la leucemia bovina (BLV). El ganado puede infectarse a cualquier edad, incluida la
fase embrionaria. La mayoría de las infecciones son subclínicas, pero un porcentaje del ganado
mayor de 3 años (≈ 30%) desarrolla linfocitosis persistente y una pequeña proporción de
linfosarcomas (tumores) en varios órganos internos. También se ha registrado infección natural en
búfalos, ovejas y capibaras. Los síntomas clínicos, cuando se presentan, dependen de los órganos
afectados. El ganado con linfosarcomas casi siempre muere súbitamente o en semanas o meses
después de la aparición de los síntomas clínicos.
Identificación del agente: Los virus se pueden aislar por cultivo de linfocitos periféricos y la
demostración del virus se puede lograr por microscopía electrónica o por pruebas de detección del
antígeno de BLV. Por la reacción en cadena de la polimerasa se puede detectar el ADN del
provirus en la sangre periférica o en los tumores.
Pruebas serológicas: Los métodos más utilizados son la inmunodifusión en medio sólido (IGDA)
de sueros o el enzimoinmunoensayo (ELISA) para sueros o muestras de leche. En muchos países
estas pruebas constituyen la base de políticas acertadas de erradicación. También pueden
utilizarse otras pruebas como el radioinmunoensayo. Se han comercializado. varios kits de pruebas
IGDA y ELISA.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existen vacunas contra el
BLV.
A. INTRODUCCIÓN
Pueden existir varias causas de los linfosarcomas del ganado bovino, pero la única causa conocida es el
retrovirus de la leucemia bovina (BLV), que origina la leucosis bovina enzoótica (LBE). El término leucosis
bovina esporádica (LBES) se reserva normalmente para los linfomas de tipo cutáneo y tímico de los terneros,
que se definen por la edad del animal afectado y por la distribución de los tumores. Se desconoce la causa o
causas de la LBES. También hay condiciones linfosarcomatosas que no corresponden a las categorías de la
LBES o la LBE, como el caso del linfoma multicéntrico de adultos, de aparición esporádica y de etiología
desconocida. Solamente deben denominarse leucosis o Leucosis enzoótica bovina a los linfomas causados por
infección con BLV.
Aunque los animales pueden infectarse con BLV a cualquier edad, los tumores (linfosarcomas) se observan
típicamente en animales de más de 3 años. Normalmente las infecciones son subclínicas; solamente el 30-70%
del ganado infectado desarrolla una linfocitosis persistente, y el 0,1-10% desarrolla tumores. Los síntomas
dependen del lugar en que aparecen los tumores y pueden incluir desarreglos digestivos, inapetencia, pérdida de
peso, debilidad general y, a veces, manifestaciones neurológicas. Los ganglios linfáticos superficiales pueden
verse inflamados y se pueden palpar bajo la piel o por examen rectal. Los órganos implicados con más
frecuencia son la cuarta cavidad del rumen, la aurícula derecha del corazón, el bazo, el intestino, el hígado, el
riñón, la tercera cavidad del rumen, los pulmones y el útero. La susceptibilidad del ganado a una linfocitosis
persistente está determinada genéticamente, y quizá también el desarrollo del propio tumor. Existen dudas sobre
el papel del virus como causa de la deficiencia inmunológica o del aumento de pérdidas selectivas. En un estudio
se demostró que las manadas infectadas con BLV presentaban menor producción láctea (2,5-3% a nivel de la
manada) y un aumento en la tasa de pérdidas selectivas, así como una mayor susceptibilidad a otras
enfermedades de etiología infecciosa, del tipo de la mastitis, diarrea y neumonía, pero el efecto sobre la fertilidad
fue escaso (9).

Capítulo 2.3.4. − Leucosis bovina enzoótica
504 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
El virus puede detectarse por cultivo in vitro de linfocitos de la sangre periférica. En los linfocitos sanguíneos y en
células tumorales el virus se presenta como un provirus integrado en el ADN de la célula. También se encuentra
en la fracción celular de varios líquidos del cuerpo (fluidos nasales y bronquiales, saliva, leche). La transmisión
natural depende de la transferencia de células infectadas, por ejemplo durante el parto. También se produce
transmisión artificial, especialmente por agujas contaminadas con sangre, equipo quirúrgico, guantes usados en
exámenes rectales, etc. La trasmisión horizontal en ausencia de estos factores suele ser baja. En regiones con
muchos insectos chupadores de sangre, especialmente tábanos, éstos pueden transmitir el virus de forma
mecánica.
Aunque se pueden infectar varias especies animales por inoculación con el virus, la infección natural solo tiene
lugar en el ganado bovino (Bos taurus y Bos indicus), en búfalos y en capibaras. Las ovejas son muy
susceptibles a la inoculación experimental y a menudo desarrollan tumores a una edad más temprana que el
ganado bovino. También pueden detectarse anticuerpos persistentes después de una inoculación experimental
en ciervos, conejos, ratas, cobayas, gatos, ovejas, monos rhesus, chimpancés, antílopes, cerdos, cabras y
búfalos.
Probablemente el BLV estaba presente en Europa durante el siglo XIX, desde donde se extendió al continente
americano en la primera mitad del siglo XX. Puede haber regresado a Europa y a otros países, con la
importación de ganado norteamericano (11). Varios países han sido reconocidos oficialmente como libres de
infección por BLV.
Se han realizado diversos estudios para determinar si el BVL causa enfermedades en humanos, sobre todo por
el consumo de leche de vacas infectadas. Sin embargo, no existe evidencia concluyente de transmisión, y en la
actualidad se considera que el BLV no representa un peligro para el hombre.
1. Identificación del agente
El BLV es un retrovirus exógeno relacionado desde el punto de vista estructural y funcional con los virus
humanos 1 y 2 que infectan los linfocitos T (HTLV-1 y HTLV-2). Las principales células diana del BLV son los
linfocitos B. Las partículas víricas constan en esencia de un ARN de cadena sencilla, la nucleoproteína p12, la
proteína p24 de la cápsida, la glicoproteína transmembrana gp30, la glicoproteína de la envuelta gp51, y varias
enzimas entre las que se incluye la transcriptasa inversa. El ADN del provirus, que se genera por trascripción
inversa de la mayor parte del genoma vírico, se integra al azar en el ADN nuclear de la célula hospedadora,
donde permanece sin dar lugar a virus libres in vivo. Cuando las células infectadas se cultivan in vitro,
generalmente mediante co-cultivo de linfocitos con una línea celular indicadora, se producen virus infecciosos, lo
que sucede más rápidamente si se estimulan las células con mitógenos (16).
a) Aislamiento del virus
Las células mononucleares se aíslan en un gradiente de densidad a base de ficoll/metrizoato sódico,
partiendo de 1,5 ml de sangre tratada con etilén diamino tetra-acético (EDTA). Después se cultivan con 2 x
106
células de pulmón bovino fetal (FBL) y se cultivan durante 3-4 días en 40 ml de medio mínimo esencial
(MEM) con 20% de suero bovino fetal. El virus forma sincitios en la monocapa celular. Se pueden preparar
cultivos de corta duración, cultivando durante 3 días las células mononucleares en una bandeja de plástico
con 24 pocillos en ausencia de las células FBL (13). Los antígenos p24 y gp51 pueden detectarse en el
sobrenadante de los cultivos mediante radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoensayo (ELISA),
inmunotransferencia o por inmunodifusión en gel de agar (IGDA), y la presencia de partículas de BLV y de
provirus se puede demostrar por microscopía y por PCR, respectivamente.
b) Reacción en cadena de la polimerasa
Varios autores han descrito la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el
provirus del BLV (3-5, 19). Con diversa eficacia, se han utilizado cebadores construidos para combinarse
con las regiones gag, pol y env del genoma. El método más sensible y rápido es la PCR doble (anidada)
seguida por electroforesis y tinción (4, 12). El método descrito se basa en secuencias cebadoras del gen
env, que codifica la gp51. Este gen está muy conservado, y tanto el gen como el antígeno están
generalmente presentes en todos los animales infectados a lo largo de las fases de la infección. La técnica
está limitada en su ejecución a aquellos laboratorios que dispongan de servicios de virología molecular, y
deben tenerse en cuenta las precauciones normales y los procedimientos de control necesarios para
asegurar la validez de los resultados de la prueba (ver Capítulos I.1.4. y I.1.8.). Se han publicado otros
protocolos de PCR para la detección de secuencias del provirus del BLV (3, 4, 19).

La PCR anidada se aplica a la detección de la infección por BLV en animales individuales en las siguientes
circunstancias:
• Terneros jóvenes con anticuerpos del calostro,
• Casos de tumor, para diferenciar entre linfoma esporádico e infeccioso,
• Tejido tumoral de casos sospechosos recogidos en mataderos,
• Nuevas infecciones, antes del desarrollo de anticuerpos contra el BLV,
• Casos de resultados débilmente positivos o inciertos en pruebas de tipo ELISA,
• Análisis sistemático de ganado en centros de prueba de reproducción (antes de la introducción en
centros de inseminación artificial)
• Ganado empleado en la producción de vacunas, para comprobar que están exentos de BLV.
La prueba de PCR no es adecuada para utilización a nivel de manada, pero puede emplearse como una
ayuda a la serología en pruebas confirmativas.
• Sensibilidad y fiabilidad del método
i) Sensibilidad analítica
Aunque la prueba de PCR anidada tiene una sensibilidad teórica de una molécula problema, en la
práctica la sensibilidad analítica es algo más baja, alrededor de 5-10 moléculas de ADN provírico por
muestra.
ii) Muestras positivas falsas
La elevada sensibilidad del método de la PCR anidada puede causar problemas de muestras falsas
positivas debido a la contaminación entre las muestras. Para reducir esto, se adoptan durante el
análisis varios procedimientos especiales, como la utilización de cabinas de flujo laminar, empleo de
locales separados para las distintas fases del proceso, guantes nuevos en cada caso, uso de tubos de
apertura especial para cada ensayo individual, controles negativos (blancos con agua), etc. Estas
precauciones contra la contaminación se han descrito extensamente (5).
iii) Muestras negativas falsas
Debe advertirse que solo una pequeña proporción de los linfocitos periféricos resulta infectada, lo que
limita la sensibilidad del ensayo. La presencia en algunas muestras de sustancias inhibidoras puede
originar resultados falsos negativos. Para detectar esto se utiliza en cada ensayo, por lo menos, un
control positivo. Además, a cada muestra se añaden controles internos (réplicas). La réplica es una
molécula problema modificada que se amplifica con los mismos cebadores que la molécula problema
real, pero que genera un producto más largo en PCR, y que puede visualizarse mediante
electroforesis en gel de agarosa. La réplica se añade a una concentración baja y esto, junto con el
mayor tamaño del producto de la PCR, favorece una amplificación del problema real (2). No obstante,
es posible que la réplica compita con la verdadera molécula. Por tanto, puede ser necesario analizar
cada muestra con y sin réplica.
• Preparación de la muestra
Los linfocitos de la sangre periférica (PBL) se separan de la sangre con EDTA utilizando el método Ficoll-
Paque de separación (Pharmacia & Upjohn, Uppsala, Sweden). Alternativamente, se puede utilizar la capa
leucocitaria o incluso sangre completa, por ejemplo cuando las muestras se han congelado.
Los tumores y otros tejidos deben homogenizarse para formar una suspensión al 10%.
• Extracción del ADN
La purificación del ADN total es un prerequisito para alcanzar una sensibilidad óptima. Se han
comercializado varios métodos de purificación, por ejemplo el NucleoSpin (Macherey-Nagel) o el
tratamiento con resina quelante (BioRad).

El siguiente método se basa en estudios de Singer-Sam et al. (17) y Walsh et al. (20). Se deben adoptar
precauciones especiales en todos los pasos para evitar el riesgo de contaminación (5).
i) En un tubo eppendorf de 1,5 ml para cada muestra, se añaden 100 µl de resina quelante (Sigma C-
7901 o Chelex de BioRad).
ii) A los tubos con la resina quelante se añaden 100 µl de las muestras y 10 µl de la réplica. Las
muestras se agitan en un vórtex.
iii) Se cierran los tubos eppendorf y se incuban a 56ºC-60ºC durante 20 minutos.
iv) Los tubos se agitan en un vórtex durante 10 segundos.
v) Se incuban los tubos a 96ºC durante 8-10 minutos.
vi) Los tubos se agitan en un vórtex durante 10 segundos y se colocan inmediatamente en hielo.
vii) Opcional: Todas las muestras se equilibran a una cantidad estándar de ADN (500 ng/reacción)
aplicando, por ejemplo, el método Beta Globin (19).
viii) Se centrifugan los tubos a 15.000 g durante 2 minutos.
ix) Se utilizan 5 µl en el ensayo de PCR.
• Procedimiento de PCR anidada
i) Diseño de cebadores y secuencias
Se han publicados varios protocolos de PCR para la detección de secuencias del provirus del BLV (3,
4, 19). Como ejemplo, se describe con detalle un ensayo de PCR basado en el desarrollado por
Ballagi-Pordany et al. (3). La región del BLV usada como diana es el gen de la gp51 (env). La
secuencia empleada para el diseño de los cebadores está disponible en el banco de datos GenBank,
con número de acceso K02120. Las secuencias de los cebadores son:
Oligo Secuencia Posición en
K02120
OBLV1A (5’-CTT-TGT-GTG-CCA-AGT-CTC-CCA-GAT-ACA-3’) 5029
OBLV6A (5’-CCA-ACA-TAT-AGC-ACA-GTC-TGG-GAA-GGC-3’) 5442
OBLV3 (5’-CTG-TAA-ATG-GCT-ATC-CTA-AGA-TCT-ACT-GGC-3’) 5065
OBLV5 (5’-GAC-AGA-GGG-AAC-CCA-GTC-ACT-GTT-CAA-CTG-3’) 5376
Tamaño del producto de PCRI: 440 bp; tamaño del producto de PCRII: 341 bp; tamaño del producto de
la réplica: 761 bp.
ii) Mezclas de reacción
Las mezclas de reacción se combinan (excepto la muestra y la réplica) antes de añadirlas a los tubos
de reacción. Cada cinco muestras debe añadirse un control negativo (con agua bidestilada) y un
control positivo. Los volúmenes totales de mezcla se calculan multiplicando los volúmenes indicados
por el número total de muestras, incluyendo los controles, más uno. Se utiliza polimerasa Taq a una
pre-dilución de 1/10.
Las muestras de ADN y las réplicas
1
(2) deben añadirse en recintos separados del laboratorio: el
recinto número 1 para preparaciones de ADN y para réplicas, y el recinto número 2 para productos de
la PCRII a fin de minimizar la contaminación.
1
Disponible del Dr. Belák, Department of Virology, National Veterinary Institut, Box 585, Biomedical Centre, S-751 23,
Uppsala, Suecia.

a) Reactivos añadidos en una habitación limpia del laboratorio
Esta mezcla se puede preparar por adelantado y mantener a 4ºC hasta 1 mes.
Reactivos por reacción (conc.) Reacción PCRI Reacción PCRII
H2O bidestilada (estandarizada) 21 µl 21 µl
10 × tampón para PCR (Perkin Elmer) 5 µl 5 µl
dNTP (10 mM) 4 × 1 µl 4 × 1 µl
Seroalbúmina bovina (1 mg/ml) 5 µl 5 µl
Cebadores (10 pmol/µl):
OBLV1A 1.5 µl –
OBLV6A 1.5 µl –
OBLV3 – 1.5 µl
OBLV5 – 1.5 µl
En total: 38 µl 38 µl
Lo siguiente debe añadirse inmediatamente antes de comenzar la PCR
MgCl2 (25 mM) 5 µl 5 µl
Polimerase Taq (1 unidad/reacción) 2 µl 2 µl
Aceite mineral 2 gotas 2 gotas
b) Reactivos añadidos en el recinto número 1 (ADN) ó 2 (PCRII)
Muestra de ADN (o de agua) 5 µl –
Producto de PCRI – 5 µl
iii) Perfiles térmicos de la PCR
Para la PCRI
5 × 94°C/45 segundos, 60°C/60 segundos, 72°C/90 segundos
1 × 72°C/420 segundos ≥20°C
Para la PCRII
1 × 72°C/420 segundos ≥20°C
iv) Procedimiento de laboratorio
Mezclar los reactivos para la PCR
I
como se describe en el paso ii. Cuando se añadan las muestras de
ADN, utilizar guantes o abridores de tubos distintos para cada tubo individual. Colocar las muestras en

hielo. Ajustar el termociclador a 80ºC. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de
la PCR
I
(paso iii).
Mezclar los reactivos para la PCR
II
como se describe en el paso ii. Usar guantes o abridores de tubos
distintos para cada tubo individual cuando se añada el producto de la PCRI
. Colocar las muestras en
hielo. Ajustar el termociclador a 80ºC. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de
la PCR
II
(paso iii).
• Electroforesis en gel de agarosa
Llevar los productos de la PCRII
al laboratorio de electroforesis. Depositar aproximadamente 10-15 µl
de las muestras y 23 µl de tampón de carga en un gel de agarosa al 2% que contenga bromuro de
etidio al 0,01%. La electroforesis se realiza a 90 mA durante 2 horas utilizando 0,5 x tampón
Tris/borato/EDTA (TBE). Para controlar el tamaño de los productos de amplificación se recomienda un
patrón de 100 bp. El análisis de los productos de la PCR se realiza por iluminación con luz UV.
• Interpretación de los resultados
i) Muestras positivas
Las muestras positivas deben dar productos de PCR del tamaño esperado (341 bp), similar al
producto del control positivo.
ii) Muestras negativas
Las muestras negativas no deben dar productos de PCR del tamaño esperado (341 bp), pero debe
estar presente el producto de la réplica (144 bp).
iii) Resultados dudosos
El ensayo debe repetirse cuando los controles positivos (réplica o control positivo externo) son
negativos o si los controles negativos con agua son positivos.
• Prueba confirmativa
Para una identificación confirmativa, los productos de la PCR se pueden secuenciar, hibridar a una sonda o
analizarse mediante análisis del polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP) (10).
2. Pruebas serológicas
La infección del ganado con el virus dura toda la vida y origina una respuesta persistente de anticuerpos, los
cuales se detectan por primera vez a las 3-16 semanas post-infección. Los anticuerpos derivados de la madre
pueden tardar de 6-7 meses en desaparecer. No hay modo de distinguir entre los anticuerpos adquiridos por
transferencia pasiva y los que resultan como consecuencia de una infección activa. Sin embargo, la infección
activa se puede confirmar por la detección del provirus del BLV mediante PCR. Los anticuerpos pasivos tienden
a proteger a los terneros contra la infección. Durante el período próximo al parto, las vacas pueden tener
anticuerpos séricos que son indetectables por IGDA debido al paso de los anticuerpos desde el sistema
circulatorio de la vaca al calostro. Por tanto, cuando se utiliza la prueba IGDA, un resultado negativo de la prueba
con suero tomado a ese tiempo (2-6 semanas antes del parto y 1-2 semanas después del parto) no es
concluyente y la prueba debe repetirse. No obstante, la prueba IGDA se puede realizar en esta fase con el
calostro.
Los anticuerpos que primero se detectan son los dirigidos contra gp51 y p24 del virus. La mayor parte de las
pruebas rutinarias IGDA y ELISA detectan anticuerpos contra la glicoproteína gp51, que son de aparición
temprana. Se han descrito métodos para realizar estas pruebas (6, 8).
Existen sueros liofilizados para utilizar en ELISA como sueros estándar de la OIE, que son débilmente positivos y
negativos, y están disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE en Inglaterra (ver Cuadro en la Parte 3 de
este Manual). Estos sueros pueden emplearse para establecer la sensibilidad de las pruebas ELISA. Debe
advertirse que aunque el suero débilmente positivo se ha equilibrado para ser equivalente al E4 diluido 1/10, no
es adecuado para utilización en la prueba IGDA. Como las disponibilidades son limitadas, se sugiere que los
estándares de trabajo para ELISA sean locales y calibrados frente a sueros estándar.
a) Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el mercado internacional)
Se puede utilizar un ELISA indirecto o un ELISA de bloqueo. Las pruebas basadas en estos principios están
comercializadas; se pueden necesitar kits diferentes para muestras de suero o de leche. Algunos ELISAs
son lo suficientemente sensibles como para utilizarse con muestras mezcladas, acumuladas en común. Las
pruebas ELISA se realizan en la fase sólida de microplacas. El antígeno del BLV se emplea para recubrir
las placas, bien directamente o por medio de un anticuerpo policlonal o monoclonal (MAb) de captura. El
antígeno se prepara de modo similar a como se hace para la prueba IGDA y se utiliza a una dilución
predeterminada (por ejemplo, 1/10) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). En forma de kit, las

placas se adquieren a veces antigenizadas. Se pueden añadir algunos conservantes a las muestras de
leche para evitar su agriamiento por fermentación. Normalmente, las muestras con conservante no se
deterioran de modo significativo si se conservan hasta 6 semanas a 4ºC.
• Enzimoinmunoensayo indirecto — ELISA para leche
El siguiente método es adecuado para la detección de anticuerpos en muestras de leche de mezcla.
• Controles
En cada ensayo deben incluirse controles de leche fuertemente positiva, débilmente positiva y negativa, y
controles de diluyente. Un control fuertemente positivo se prepara diluyendo a 1/25 el suero estándar
positivo de la OIE (E4 1/10) en leche negativa. Un control débilmente positivo se prepara diluyendo el suero
estándar positivo de la OIE (E4 1/10) 25 veces el número de muestras de leche individuales que componen
el conjunto de leche problema. La leche utilizada para diluir los controles de suero estándar no debe ser
pasteurizada, debe estar descremada y con conservante.
• Ejemplo de procedimiento de la prueba
i) Las muestras de leche deben mantenerse en reposo en un refrigerador hasta que se forme una capa
cremosa definida (24-48 horas), o alternativamente se centrifugan a 2.000 rpm durante 10 minutos. La
capa cremosa se elimina antes de la prueba.
ii) En columnas alternadas, se unen a la placa de titulación un antígeno de BLV y un control negativo de
antígeno. Se mezclan 100 µl de la muestran problema con 100 µl de tampón de lavado para hacer una
dilución 1/2 en la placa, añadiéndolo a dos pocillos de control de antígeno y a dos pocillos con
antígeno BLV.
iii) La placa se cierra y se mezcla el contenido de los pocillos en un agitador.
iv) Se incuba la placa durante 14-18 horas a 2-8ºC.
v) Se añaden 300 µl de diluyente de lavado por pocillo y se eliminan; a continuación se añaden otros
200 µl de diluyente de lavado, se agita durante 10 segundos, y se vuelve a eliminar. Finalmente se
añaden otros 300 µl y se deja en reposo durante 3 minutos antes de eliminar.
vi) Se añaden 200 µl por pocillo de IgG anti-bovina purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa de
rábano, y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente.
vii) La placa se lava añadiendo 300 µl de diluyente de lavado por pocillo; luego se elimina y se vuelven a
añadir otros 300 µl de diluyente de lavado, que se deja en reposo durante 3 minutos y se elimina. Los
pasos vi y vii se repiten.
viii) Se añaden 200 µl de substrato ABTS (ácido 2,2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico])
(precalentado a 25ºC) y se incuba la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad. La reacción se detiene añadiendo 50 µl de solución de parada.
• Lectura e interpretación de los resultados
Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 405 nm. Todos los pocillos de la microplaca deben
leerse en las 2 horas siguientes a la adición de la solución de parada. La lectura de absorbancia de los
pocillos que contienen antígeno negativo se resta de las lecturas de los pocillos que contienen el antígeno
positivo. Para cada muestra problema, los dos valores de absorbancia neta se promedian. Lo mismo se
lleva a cabo con los controles duplicados débilmente positivos. Las lecturas de los duplicados no deben
diferenciarse en más de 0,1 unidades de absorbancia.
Para que la prueba se considere válida, el promedio de la absorbancia neta de los controles débilmente
positivos (WP) debería estar entre 0,2-0,6 unidades de absorbancia. La absorbancia neta de los controles
fuertemente positivos debería ser >1,0 unidades de absorbancia. La absorbancia neta del control negativo y
del control de los diluyentes debería estar por debajo del límite del valor dudoso.
Teniendo en cuenta los criterios anteriores:
i) Las muestras problemas son positivas si los valores de absorbancia neta son mayores o iguales que
los del control WP.

ii) Las muestras problema son dudosas si su absorbancia neta es el 75% o menos que el valor de la
absorbancia neta del control WP.
Por ejemplo, si la absorbancia neta del control WP = 0,40
entonces el límite inferior del valor dudoso = 0,40 x 0,750 = 0, 30
Por tanto, en este ejemplo, el rango dudoso sería 0,30-0,39
y las muestras con valor > 0,40 se considerarían positivas.
iii) Las muestras problema son negativas si el valor de su absorbancia neta está por debajo del límite
inferior del rango dudoso (< 0,30 en el ejemplo).
• Enzimoinmunoensayo de bloqueo — ELISA para suero
El siguiente método es adecuado para la detección de anticuerpos en muestras aisladas o conjuntas de
suero.
• Procedimiento de la prueba
i) Recubrimiento de la placa
Todos los pocillos se recubren con anticuerpo contra el BLV prediluido en tampón de recubrimiento
(100 µl/pocillo); la placa se cierra y se incuba durante 18 horas a 4ºC. Se realiza un ciclo de lavado
(lavado estándar), que consiste en tres lavados llenando los pocillos hasta arriba y dejando cada vez
el tampón durante 3 minutos; después se seca la placa. Se añade el antígeno del BLV prediluido en
tampón de lavado (100 µl/pocillo); se cierra la placa y se incuba durante 2 horas a 37ºC. Se realiza
otro ciclo estándar de lavado.
ii) Preparación y adición de muestras y controles
Los controles de suero positivo y negativo se prediluyen en tampón de lavado (1/2) y se añade la
solución a cuatro pocillos por cada control (100 µl/pocillo). Para probar muestras de mezclas conjuntas
se pueden agrupar 80 sueros diluidos (1/2) con el tampón de lavado y la solución se añade a dos
pocillos (100 µl/pocillo) por cada muestra. Las muestras aisladas deben diluirse 1/100 con tampón de
lavado y añadir la solución a dos pocillos (100 µl/pocillo) por cada muestra. Después de colocar las
muestras, se cierra la placa y se incuba durante 18 horas a 4ºC. Se realiza un breve lavado llenando
los pocillos y vaciándolos inmediatamente.
iii) Preparación y adición de conjugados y substrato
A todos los pocillos se añade (100 µl/pocillo) anticuerpo biotinilado prediluido (utilizando tampón de
lavado + 10% de suero fetal bovino). Se cierra la placa y se incuba en un agitador durante 1 hora a
37ºC. Se realiza un lavado estándar como se describió anteriormente. Se prediluye avidina conjugada
con peroxidasa en el tampón de lavado y se añade a todos los pocillos (100 µl/pocillo). Se cierra la
placa y se incuba en un agitador durante 30 minutos a 37ºC. Se realiza un lavado estándar. Se añade
a todos los pocillos 100 µl del substrato ortofenilén diamina y se cierra la placa dejándola en la
oscuridad durante 9 minutos. La reacción se detiene añadiendo 0.5 M de ácido sulfúrico
(100 µl/pocillo).
• Lectura e interpretación de los resultados
Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 490 nm. Para lectores de doble longitud de onda se
utiliza un filtro de referencia entre 620 nm y 650 nm. Los resultados se leen dentro de los 60 minutos
siguientes a la adición de la solución de parada.
La absorbancia del control negativo debe estar próxima a 1,1 + 0,4. Si la absorbancia es menor de 0,7 el
tiempo para el desarrollo del color en el paso iii antes descrito debe aumentarse (ver, preparación y adición
de conjugados y substrato). A la inversa, si la absorbancia supera 1,5 el tiempo debe acortarse. La
absorbancia del control positivo debe ser menor que la absorbancia del control negativo x 0,25.
Una muestra es positiva cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o menor
que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,5.
Una muestra es negativa cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o mayor
que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,65.
Para muestras que dan valores comprendidos entre la absorbancia del control negativo x 0,50 y la
absorbancia del control negativo x 0,65 se recomienda volver a probar el animal tomando una muestra un
mes más tarde.

• Sensibilidad del enzimoinmunoensayo
Se puede determinar la sensibilidad de las pruebas ELISA para leches de mezcla utilizando los sueros
estándar de la OIE que son débilmente positivos y negativos. Las pruebas deben dar resultado positivo con
E4 cuando se diluye en leche negativa a una dilución de 250 veces el número de leches individuales de la
mezcla (Directiva 88/406 de la Unión Europea). Por ejemplo, para mezclas de 60 leches, E4 se debe diluir
1/250 x 60 =1/15000. Utilizando el suero estándar de la OIE débilmente positivo disponible en la actualidad
(E4 1/10), en la muestra anterior la dilución debería ser 1/25 x 60 =1/1500. Para muestras de leche
individual, el suero estándar de la OIE débilmente positivo diluido 1/25 (E4 1/250) en leche negativa, debe
ser positivo.
Cuando se prueban muestras de mezclas de sueros, el suero estándar de la OIE debe dar un resultado
positivo a una dilución igual al número de animales individuales de la mezcla. Por ejemplo, para un conjunto
de 50 muestras individuales, el suero estándar de la OIE débilmente positivo diluido 1/50 en suero negativo
debería dar un resultado positivo. En las pruebas en que las muestras de suero se ensayan
individualmente, el suero estándar de la OIE débilmente positivo sin diluir debe ser positivo.
b) Inmunodifusión en gel de agar (prueba prescrita para el comercio internacional)
La prueba IGDA es específica, pero no muy sensible, para detectar anticuerpos en muestras de suero
individuales. Sin embargo, no es adecuada para muestras de leche (excepto el primer calostro) debido a su
escasa especificidad y sensibilidad. La prueba IGDA es sencilla y fácil de realizar y ha sido muy útil y eficaz
como base en esquemas de erradicación.
En los kits comerciales para pruebas IGDA se incluyen sueros de referencia, pero no hay sueros estándar
de la OIE actualmente disponibles para esta prueba. Se puede obtener consejo de los laboratorios de
referencia de la OIE que se indican en la Parte 3 de este Manual.
i) Gel de agar: Se prepara una solución de agar o agarosa al 0,8-1,2% en tampón Tris 0,2 M, pH 7,2,
que contenga 8,5% de NaCl. Una manera de preparar el agar es disolver 24,23 g de Tris metilamina
en 1 litro de agua destilada y ajustar el pH a 7,2 con HCl 2,5 M. Se disuelve cloruro sódico (85 g) en
250 ml de Tris/HCl y se lleva a 1 litro. Se añade la agarosa (8 g) y la mezcla se calienta en una olla a
presión o en un autoclave a 4,55 kg/cm2
durante 10 minutos. La mezcla se reparte en alícuotas de
15 ml que pueden mantenerse a 4ºC durante aproximadamente 6 semanas.
ii) Antígeno: El antígeno debe contener la glicoproteína gp51 específica de BLV. El antígeno se prepara
en un sistema adecuado de cultivo celular, como en monocapas de células de riñón de cordero fetal
(FLK) persistentemente infectadas. Las células utilizadas para producir el antígeno del BLV deben
estar libres del virus no citopático de la diarrea vírica bovina y de retrovirus bovinos, así como de virus
similares al de la inmunodeficiencia bovina (lentivirus) y de virus bovinos sincitiales (espumavirus).
Después de 3-4 días de cultivo a 37ºC, el medio de crecimiento se reemplaza con medio de
mantenimiento. Se recogen las células 7 días después, empleando una solución estándar de
tripsina/verseno y la suspensión celular obtenida se centrifuga a 500 g durante 10 minutos.
A continuación, las células se resuspenden en medio de crecimiento; 30% de las células se
devuelven al recipiente de cultivo y el resto se desecha. Se recoge todo el sobrenadante y se
concentra 50–100 veces por métodos disponibles, bien sea por concentración del material en tubos
Visking inmersos en polietilén glicol o por precipitación con sulfato amónico seguida de ultrafiltración, o
mediante precipitación con polietilén glicol y posterior desalinización y separación por tamaño en una
columna de poliacrilamida. El antígeno contiene fundamentalmente gp51, pero también puede
contener p24.
El antígeno se puede estandarizar para la glicoproteína gp51 por titulación con E4 del siguiente modo.
Se preparan diluciones dobles de la preparación de antígeno. La dilución mayor que, probada contra
el suero estándar E4 sin diluir, origina una línea de precipitación equidistante entre el antígeno y el
suero, contiene una unidad. En la prueba se utilizan dos unidades de antígeno.
iii) Suero control positivo: El control de suero positivo deriva de un animal infectado natural o
experimentalmente (vacas u ovejas). La línea de precipitación formada entre los pocillos del antígeno
y del suero control debe ser nítida y equidistante. Se debe incluir en la prueba una dilución del control
de suero positivo que origine un resultado positivo débil como indicador de la sensibilidad de la
prueba.
iv) Suero control negativo: Se utiliza suero de animales no infectados (vacas u ovejas).
v) Sueros problema: Sueros de cualquier especie animal.
• Procedimiento de la prueba:
i) El agar se licua calentándolo en un baño de agua hirviendo y se vierte en placas de Petri (15 ml por
placa de Petri de 8,5 cm de diámetro). Las placas se dejan enfriar a 4ºC alrededor de 1 hora antes de

cortar en el agar los bloques de los pocillos. Se emplea un molde que origina una disposición
hexagonal de seis pocillos alrededor de un pocillo central. Se pueden utilizar pocillos de varias
dimensiones; un sistema adecuado emplea pocillos de 6,5 mm de diámetro con 3 mm de separación
entre los pocillos. Para obtener mejores resultados, las placas deben usarse el mismo día que se
preparan y cortan.
ii) El antígeno se coloca en el pocillo central de la disposición hexagonal y los sueros problema en los
pocillos exteriores, alternados con suero control positivo. Debería preparase también un sistema
control por placa con suero control positivo, suero control débilmente positivo y suero control negativo
en lugar de los sueros problema.
iii) Las placas se mantienen a temperatura ambiente (20-27ºC) en una cámara húmeda cerrada y se
observan a las 24, 48 y 72 horas.
iv) Interpretación de los resultados: Un suero problema es positivo si forma una línea de precipitación
específica con el antígeno y es una línea de identidad con la del suero control. Un suero problema es
negativo si no forma una línea específica con el antígeno y no refleja la línea del suero control. Pueden
aparecer líneas inespecíficas que no convergen con las líneas formadas por el control positivo. Un
suero problema es débilmente positivo si curva la línea del suero control hacia el pocillo del antígeno,
sin formar una línea visible de precipitación con el antígeno. La reacción es dudosa si no puede
interpretarse como positiva o negativa. La prueba no tiene validez si los controles no dan los
resultados esperados. Los sueros que originan resultados dudosos o débilmente positivos pueden
concentrarse y volverse a probar.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
En terneros jóvenes nacidos de madres infectadas con BLV, los anticuerpos maternos contra la gp51 del BLV
son importantes como protección contra la infección por BLV (12). Sin embargo, varios experimentos en los que
se ha utilizado BLV inactivado, células FLK fijadas e infectadas, o gp51 purificada indican que éstos antígenos
solo inducen protección a corto plazo. También se ha comprobado que la vacunación del ganado con células
vivas de una línea celular BL3, establecida a partir de un animal con leucosis bovina esporádica, solo provoca
protección de corta duración. La naturaleza del antígeno que proporciona protección en estos casos se
corresponde probablemente con un antígeno de transplante asociado al tumor (18). Las células ovinas que solo
sintetizan los productos gp51 y gp30 del gen env y la principal proteína estructural p24, indujeron una respuesta
serológica en el ganado bovino (1); el ganado resultó protegido después de vacunación repetida con estas
células.
La vacunación de ovejas con un virus vacunal recombinante que expresa la gp51 del BLV indujo protección (14).
No obstante, la protección se desarrolló sin producción de niveles detectables de anticuerpos neutralizantes.
Además, Portetelle et al. encontraron que los virus vacunales recombinantes protegían a las ovejas incluso en
ausencia de anticuerpos anti-gp51 (15). Por consiguiente, se interpreta que la inmunidad mediada por células
puede jugar un papel importante en la inmunidad protectora contra la infección por BLV. Se ha logrado la
expresión de gp51 por virus recombinantes y por levaduras que contienen la secuencia del gen env del BLV.
Estos sistemas provocan protección en ovejas (7). Pese a estos avances en el conocimiento, no existen todavía
vacunas comercializadas para el control de la LBE.
REFERENCIAS
1. ALTANER C., BARR J., ALTANEROVA V. & JANIK V. (1991). Protective vaccination against bovine leukaemia virus
infection by means of cell-derived vaccine. Vaccine, 9, 889–895.
2. BALLAGI-PORDANY A. & BELAK S. (1996). The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in
diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, 159–164.
3. BALLAGI-PORDANY A., KLINTEVALL K., MERZA M., KLINGEBORN B. & BELAK S. (1992). Direct detection of bovine
leukaemia virus infection: practical applicability of a double polymerase chain reaction. J. Vet. Med. [B], 39,
69–77.
4. BEIER D., BLANKENSTEIN P. & FECHNER H. (1998). Chances and limitations for the use of the polymerase chain
reaction in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) infection in cattle. Dtsch Tierartzl. Wochenschr.,
105, 408–412.
5. BELAK S. & BALLAGI-PORDANY A. (1993). Experiences on the application of the polymerase chain reaction in a
diagnostic laboratory. Mol. Cell. Probes, 7, 241–248.

6. COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1991). Council Directive of Amending Directive 64/432/EEC as
Regards the Diagnosis of Bovine Brucellosis and Enzootic Bovine Leukosis. Off. J. European Communities
Council, 14 May 1991.
7. DANIEL R.C.W., GATEI M.H., GOOD M.F., BOYLE D.B. & LAVIN M.F. (1993). Recombinant viral vaccines for
enzootic bovine leucosis. Immunol. Cell Biol., 71, 399–404.
8. DIMMOCK C.K., RODWELL B.J. & CHUNG Y.S. (1987). Enzootic bovine leucosis. Pathology, Virology and
Serology. Australian standard diagnostic techniques for animal disease. No. 49. Australian Agricultural
Council.
9. EMANUELSSON U., SCHERLING K. & PETTERSSON H. (1992). Relationships between herd bovine leukemia virus
infection status and reproduction, disease incidence, and productivity in Swedish dairy herds. Prev. Vet.
Med., 12, 121–131.
10. FECHNER H., BLANKENSTEIN P., LOOMAN A.C., ELWERT J., GEUE L., ALBRECHT C., KURG A., BEIER D., MARQUARDT
O. & EBNER D. (1997). Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological
status of naturally infected cattle. Virology, 237, 261–269.
11. JOHNSON R. & KANEENE J.B. (1992). Bovine leukaemia virus and enzootic bovine leukosis. Vet. Bull., 62,
287–312.
12. KLINTEVALL K. (1995). Bovine Leukaemia Virus: Course of Infection and Means of Detection. Thesis, SLU
Info/repro, Uppsala, Sweden, 1–38.
13. MILLER L.D., MILLER J.M., VAN DER MAATEN M.J. & SCHMERR M.J.F. (1985). Blood from bovine leukaemia
virus-infected cattle: antigen production correlated with infectivity. Am. J. Vet. Res., 46, 808–810.
14. OHISHI K., SUZUKI H., YAMAMOTO T., MARUYAMA T., MIKI K., IKAWA Y., NUMAKUNAI S., OKADA K., OHSHIMA K. &
SUGIMOTO M. (1991). Protective immunity against bovine leukaemia virus (BLV) induced in carrier sheep by
inoculating with a vaccinia virus – BLV env recombinant: Association with cell mediated immunity. J. Gen.
Virol., 72, 1887–1892.
15. PORTETELLE D., LIMBACH K., BURNY A., MAMMERICKX M., DESMETTRE P., RIVIERE M., ZAVADA J. & PAOLETTI E.
(1991). Recombinant vaccinia virus expression of the bovine leukaemia virus envelope gene and protection
of immunized sheep against infection. Vaccine, 9, 194.
16. RESSANG A.A., MASTENBROEK N., QUAK J., VAN GRIENSVEN L.J.L.D., CALAFT J., HILGERS J., HAGEMAN C., SOUISSI
T. & SWEN S. (1974). Studies on bovine leukaemia 1. Establishment of type C virus producing cell lines.
Zentralbl. Veterinarmed. [B]., 21, 602–617.
17. SINGER-SAM J., ET AL. (1989). Use of Chelex to improve the PCR signal from a small number of cells.
Amplifications: A forum for PCR users, 3, 11.
18. THEILEN G.H., MILLER J.M., HIGGINS J., RUPPANER R.N. & GARRETT W. (1982). Vaccination against bovine
leukaemia virus infection. Curr. Top. Vet. Med. Anim. Sci., 15, 547–559.
19. VENABLES C., MARTIN T.C. & HUGHES S. (1997). Detection of bovine leukosis virus proviral DNA in whole
blood and tissue by nested polymerase chain reaction. Fourth International Congress of Veterinary Virology,
Edinburgh, UK, Abstracts, 202.
20. WALSH P.S., METZGER D.A. & HIGUCHI R. (1991). Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for
PCR-based typing from forensic material. BioTechniques, 10, 506–513.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Leucosis bovina enzoótica (ver Cuadro en la Parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista más actualizada:
www.oie.int).

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