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  1. 1. Silvia Giménez Rodríguez - 58 - organización de la que se trate (Centro para el control de las enfermedades infeccionsas, Consorcio para la Estandarización de la serología de Retrovirus de EE.UU, Laboratorios Pont y Cruz Roja Americana). Coinciden en lo siguiente: definir como WB negativo aquel que no presenta banda específica alguna; exigir la existencia de reactividad frente al menos una glicoproteína de la cubierta; definir como WB indeterminado, aquel que presentando alguna reactividad no satisface los requerimientos mínimos de positividad. c) Inmunoensayos en línea (LIA) Se trata de otra prueba de confirmación para intentar reducir el número de indeterminaciones. Permiten ajustar más la cantidad de antígeno, combinar antígenos de VIH-1 y VIH-2, su lectura es más definida y es más fácil leer e interpretar sus resultados (Pérez Álvarez et. al., 200:82) d) Inmunofluorescencia (IFI) Es una prueba de confirmación a la que se puede recurrir cuando el WB es indeterminado. Su base es similar a ELISA. La positividad de la reacción implica fluorescencia en la perimenbrana de las células infectadas y su ausencia en las no infectadas. La fluorescencia en las células no infectadas invalida la prueba. La especificidad de IFI es similar a WB, aunque se han recogido reacciones inespecíficas con los sueros de niños recién nacidos de madres infectadas con VIH. Otro inconveniente es la subjetividad de la lectura que es de menor sensibilidad que el WB para muestras con bajo nivel de anticuerpos. Así pues, muestras positivas por ELISA y negativas por IFI han de ser confirmadas por WB. e) Radio inmuno-precipitación (RIPA) Es una de las técnicas más sensible para detectar reactividad frente a las glicoproteínas de la cubierta gp160 y gp120, presentando menos resultados falsos. Es de utilidad complementaria al WB en resultados indeterminados. Es una técnica de gran complejidad que requiere uso de material radioactivo, limitándose su utilización a laboratorios de investigación. No obstante, los más utilizados son ELISA y Western Blot.
  2. 2. Silvia Giménez Rodríguez - 59 - 2.2.2. Métodos de diagnóstico directos Además de técnicas utilizadas como la de detección del antígeno p24, del aislamiento primario en linfocitos de sangre periférica en cultivo, el aislamiento a partir de otros cultivos corporales y la detección de VIH por microscopía electrónica, la técnica que actualmente más se utiliza tanto en diagnóstico clínico como en monitorización de laboratorio de la infección por VIH, es la de detección del ADN provírico en sangre periférica con la tecnología de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Fernández-Cruz, 1998:106-108;Pérez Álvarez et. al., 2001:83) a) Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) Esta técnica permite in vitro la amplificación exponencial, más de 100.000 veces, de una región de ADN seleccionada y así detectar secuencias de DNA proviral o RNA viral. 26. La alta sensibilidad de este método permite detectar una secuencia del VIH-1 en 100.000 células del huésped. La alta sensibilidad requiere el paso de muchos controles de calidad en el laboratorio. Esta técnica se utiliza para: diagnóstico precoz de infecciones en niños; diagnóstico en individuo seronegativos de alto riesgo; para la confirmación de Test ELISA positivos, con patrón indeterminado de WB; para la cuantificación de la carga viral; para 26 La PCR básica consta de un primer paso de calentamiento hasta 94-95ºC durante 5-10 minutos, en el cuál se activa la ADN polimerasa, en caso de necesitarlo. Posteriormente tiene tres pasos que se repiten muchas veces dependiendo de lo que se vaya a realizar: 1. Desnaturalización: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la denaturación depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización; 2. Unión del cebador: A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 ºC, aunque se puede variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC). Estos cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada; 3. Extensión de la cadena: Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72ºC (para la Taq Polimerasa), temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad, aumentando geométricamente la cantidad de fragmentos de ADN en la muestra. Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservación. Este ciclo (desnaturalización-hibridación- extensión) se repetirá un número de veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee. Generalmente son 30 ciclos, ya que un número mucho mayor de ciclos no implica un mayor rendimiento.
  3. 3. Silvia Giménez Rodríguez - 60 - amplificación de zonas definidas del DNA para análisis de secuenciación. Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993 por su descubrimiento.27 2.2.3. Diagnóstico de caso SIDA Desde la primera definición de caso SIDA en 1982 por los CDC, a medida que se fue ganando en conocimiento se fueron añadiendo nuevas enfermedades y situaciones. De esta manera en 1985 se describe por primera vez la detección de anticuerpos frente a VIH y su presencia en sangre se considera imprescindible para la definición de un nuevo caso de SIDA. Finalmente, el avance del conocimiento clínico y epidemiológico permite en 1986 el establecimiento de una primera clasificación de la infección por VIH con un alto valor pronóstico. Dicha clasificación sería posteriormente revisada en 1993 para introducir la importancia del nivel de linfocitos CD4. A continuación se muestra la evolución de las pautas de diagnóstico del llamado “caso SIDA” según la Organización Mundial de la Salud, con sus variantes geográficas. Cabe destacar que dependiendo de las características de los países, se usan definiciones de caso diferentes según aspectos demográficas (niños, adultos, aparición relativa de infecciones oportunistas) e infraestructura de laboratorio y capacitación disponible. Las definiciones de caso que más se usan actualmente (OPS. OMS, 2001) abarcan países caracterizados por tener: a) Medios de laboratorio más complejos: 1. CDC 1987 2. CDC 1993 b) Medios de laboratorio limitados. 1. Abidján/OMS 2. Bangui/OMS (clínico) 3. Caracas/OPS y revisada Caracas/OPS 27 Cabe destacar que el Dr. Kary Mullis, descubridor de la PCR y Premio Nobel por ello, lleva desde principio de los 90 explicando que su tecnología no puede cuantificar, por lo que no cuantifica la carga viral del VIH, tirando por tierra los protocolos actuales que consideran la PCR como la técnica más avanzada y exacta para la medicada de esta carga viral. Kary Mullis a su vez considera que no existe evidencia científica de que el VIH haya sido aislado y por lo tanto de que sea la causa del SIDA. Forma parte del grupo cinético del replanteamiento del SIDA, que se expondrá en el capítulo siguiente y que abanderan una hipótesis no vírica del SIDA.
  4. 4. Silvia Giménez Rodríguez - 61 - a) Medios de laboratorio más complejos. Según el CDC estas eran las 12 enfermedades que originalmente caracterizaban el SIDA, establecidas en 1983 (ninguna de las que se exponen a continuación requerían positividad a prueba de laboratorio de VIH para considerarse SIDA): 1. Neumonía por Pneumocystis carinii (1983). 2. Sarcoma de Kaposi (1983). 3. Toxoplasmosis, provocando neumonía, del SNC o del cerebro (1983). 4. Estrongiloidosis, neumonía o del sistema nervioso central (1983). 5. Aspergilosis (1983). 6. Criptococosis, pulmonar, del SNC, y diseminada (1983). 7. Candidiasis, esofágica (1983). 8. Criptoesporidiosis, intestinal crónica (1983). 9. Citomegalovirus, pulmonar, del IG, y del SNC (1983). 11. Herpes simple, infección mucocutánea crónica, pulmonar, del IG, diseminado (1983). 11. Leucoencefalopatía multifocal progresiva, causada presumiblemente por virus Papova (1983). 12. Linfoma, primario, del cerebro (1983). Posteriormente se establecen 7 enfermedades adicionales características de SIDA en 1985 (cada una de las expuestas a continuación requiere positividad a prueba de laboratorio de VIH para considerarse SIDA): 13. Micobacteria avium o M. kansasii diseminada o extrapolmunar (1985). 14. Histoplasmosis (1985). 15. Isosporidiasis, intestinal crónica (1985). 16. Linfoma, de Burkitt (1985). 17. Linfoma, inmunoblástico (1985). 18. Candidiasis de los bronquios, tráquea, pulmones (1985). Anterior Inicio Siguiente

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