Molecular biology, School of Medicine
February 23- 2015
María Alejandra Aristizábal Giraldo and Mary Luz Bohórquez
STEATOSIS
An accumulation of fat in the liver
Alcohol-related fatty liver disease Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD...
ALCOHOL-RELATED FATTY LIVER DISEASE
LIVER ALCOHOL
DEHYDROGENASE
INDICATES
ATP
FALSE CALORIES Storage and biosynthesis
of c...
NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE (NAFLD).
The non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is defined as a steatosis
entity ...
Hepatic component of the metabolic syndrome
Prevalence among 20-30% of the population in Western countries
and 15% in Asia...
Hepatomegaly is
very common.
Splenomegaly with
or without portal
hypertension may
occur with cirrhosis.
• Age> 45 years
• ...
LIPID-PEROXIDATION
Is considered as the main molecular
mechanisms involved in
the oxidative damage to cell structures and ...
OXIDATIVE STRESS
Oxidative stress is essentially an imbalance between the production of free
radicals and the ability of t...
HEPATOCYTE
Hepatocytes are the
chief functional cells
of the liver and
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astonishing number of
metabolic, endocri...
• Protein synthesis
• Protein storage
• Transformation of CHO
• Synthesis of cholesterol,
bile salts and
phospholipids.
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One of the
most common chronic
liver diseases
(affecting
hepatocytes)
NON-alcoholic fatty
liver disease
(steatosis)
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Evaluate the association
between alterations in
nuclear morphology and
oxidative stress by
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“Método donde los biólogos
moleculares y celulares
conducen estudios
experimentales sobre células
aisladas de un organismo...
VENTAJAS
Facilidad para
cultivar células de un
único tipo específico
con propiedades
homogéneas.
Las condiciones
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¿Para qué se realizó esto en la investigación?
 Se cultivaron células de la línea Hep62, en
condiciones fisiológicas.
 S...
Es una determinación de las células vivas o
muertas, en base a una muestra total de
células. Por lo general se involucra t...
La acumulación del Rojo Neutro ocurre por entrampamiento del
colorante dentro del ambiente ácido del lisosoma
Se usó el en...
Método empleado para distinguir
entre diferentes tipos de células o
para revelar la presencia de
determinados constituyent...
¿Para qué se realizó esto en la investigación?
Para evaluar la acumulación de grasa intracelular
SE USÓ TINCIÓN CON FLUORE...
Cuando un investigador desea detectar la presencia de proteínas específicas, se
recurre al método de anticuerpos unidos en...
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Ensayo que se basa en la reducción
metabólica del Bromuro de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
(MTT) real...
Se analizó mediante métodos de fluorescencia (DCFDA) la presencia de
especias reactivas de oxígeno en todas las células (l...
 Envejecimiento
 Cáncer
 Enfermedades coronarias
Patológicamente
Cantidades
aumentadas
Detectar estado
fisiológico, o p...
ES UNO DE LOS MÉTODOS MÁS PODEROSOS PARA DETECTAR UNA
PROTEÍNA EN PARTICULAR EN UNA MEZCLA COMPLEJA DE PROTEÍNAS.
Se utili...
En este método se usan 2 anticuerpos diferentes,
uno específico para la proteína buscada y el otro
unido a una enzima info...
Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo
a su movilidad electroforética, es decir en fu...
 Phospho-specific (Ser139)
 Total histoneH2AX(CellsignalingTechnology)
 β-actin (BDBios- ciences)
¿Para qué se realizó
...
Poderosa técnica para la medición de la masa de las moléculas como las
proteínas y los péptidos.
¿Para qué se realizó
esto...
.
Es una base de datos donde están las interacciones conocidas y
predichas de las proteínas humanas.
Las interacciones inc...
• Lípidos intracelulares tinción Rojo Nilo y fluorescencia
• Incremento de AG en la células HepG2
• El CoCl2 no presento n...
• Alteración en la forma del núcleo en células
tratadas con AG y Ag/CoCL2
• Los oxoLPP mostraron gran intensidad tanto
en ...
• Se identificaron 3 bandas especificas por su intensidad en las muestras de
Ag y AG/CoCL2
• Al analizar las bandas con MS...
Regulan
metabolismo
lipídico
Reparación de
ADN
Splicing
Remodelación de
cromatina
Proteínas del
citoesqueleto
• Células tratadas con AG mostraron tener grandes cantidades de oxoLPP y
LPP modificadas (en los grupos de AG y AG/CoCL2)
...
RESEARCHERS HYPOTHESIS PROOF
B.J. Stewart, J.R. Roede,
J.A. Doorn, D.R. Petersen
Demostration of excessive
acumulation of ...
• An accumulation of free fatty acids, induces an increase in the
concentration of reactive oxygen species, which in turn ...
• Lodish, Harvery; Berk, Arnold; Matsudaira, Paul; Kaiser; Krieger, Chris A;
Scott, Matthew; Zipursky, S. Lawrence; Darnel...
 http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/38477.pdf
 http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/liver/histo_hcytes...
María Alejandra
Aristizábal Giraldo
Seminario esteatosis
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  • Hs-CRP: proteína C reactiva

    SQUARE METER
  • La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. con frecuencia son cationes que se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente (los ácidos nucleicos)
  • Celulas bacterias= rojo de nilo (la rojita)…..> tecnica de coloracion usada

    *En los microscopios, solo la luz fluorescente emitida por la muestra, se usa para formar la imagen; la luz de longitud de onda de excitación induce fluorescencia, pero no se le permite pasar a través de los filtros colocados entre el objetivo de la lente y el ojo o la cámara

  • *Cuando un investigador desea detectar la presencia de proteínas específicas, se recurre al método de anticuerpos unidos en forma covalente a los fluorocromos, con el objetivo de generar una unión entre el complejo y el antígeno para emitir una luz (microscopía de inmunofluorescencia)

  • PAG 92….
  • *LEER 87 
  • * Pag 94….
  • CoCL2: cloruro de cobalto
  • CHH: prueba química especifica con carbonilo
    Debido a la gran acumulación de ROS en las células con AG citoplasmáticos, los oxoLPP fueron evaluados con CHH y microscopio de fluorescencia
    Todo fue en el citoplasma o perinuclear

  • hnRNPs: ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas
  • Seminario esteatosis

    1. 1. Molecular biology, School of Medicine February 23- 2015 María Alejandra Aristizábal Giraldo and Mary Luz Bohórquez
    2. 2. STEATOSIS An accumulation of fat in the liver Alcohol-related fatty liver disease Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). A threshold of <20 g alcohol per day in women and <30 g in men is usually used to allow a diagnosis of NAFLD.
    3. 3. ALCOHOL-RELATED FATTY LIVER DISEASE LIVER ALCOHOL DEHYDROGENASE INDICATES ATP FALSE CALORIES Storage and biosynthesis of cholesterol and triglycerides
    4. 4. NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE (NAFLD). The non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is defined as a steatosis entity encompassing a broad spectrum of liver damage, occurring in the absence of chronic alcohol consumption simple steatosis steatosis necroinflammatory changes associated with varying degrees of fibrosis called steatohepatitis cirrhosis. include
    5. 5. Hepatic component of the metabolic syndrome Prevalence among 20-30% of the population in Western countries and 15% in Asian countries It is characterized by the increased flow and hepatic uptake of circulating free fatty acids (FFA) from excessive peripheral lipolysis, all as a result of insulin resistance (RI) in adipose tissue FEATURES
    6. 6. Hepatomegaly is very common. Splenomegaly with or without portal hypertension may occur with cirrhosis. • Age> 45 years • BMI> 30 kg / m2 • Hypertriglyceridemia • Presence of comorbidities:  Diabetes mellitus Type 2  Metabolic syndrome  Sleep apnea syndrome RISK FACTORS
    7. 7. LIPID-PEROXIDATION Is considered as the main molecular mechanisms involved in the oxidative damage to cell structures and in the toxicity process that produce cell death. It involves the formation and propagation of lipid radicals, the uptake of oxygen, a rearrangement of the double bonds in unsaturated lipids and the eventual destruction of membrane lipids, with the production of a variety of breakdown products, including alcohols, ketones, alkanes, aldehydes and ethers Cause or consequence of oxidative stress
    8. 8. OXIDATIVE STRESS Oxidative stress is essentially an imbalance between the production of free radicals and the ability of the body to counteract or detoxify their harmful effects through neutralization by antioxidants (enzymes: glutathione reductase; exogenous: Vitamin C, Beta-carotene and Vitamin E) Oxidative stress leads to many pathophysiological conditions in the body
    9. 9. HEPATOCYTE Hepatocytes are the chief functional cells of the liver and perform an astonishing number of metabolic, endocrine and secretory functions. Roughly 80% of the mass of the liver is contributed by hepatocytes.
    10. 10. • Protein synthesis • Protein storage • Transformation of CHO • Synthesis of cholesterol, bile salts and phospholipids. • Detoxification, modification, and excretion of exogenous and endogenous substances • Initiation of formation and secretion of bile WHAT ARE THEIR FUNCTIONS?
    11. 11. One of the most common chronic liver diseases (affecting hepatocytes) NON-alcoholic fatty liver disease (steatosis) oxidative stress ROS Balance between pro- and antioxidants is impaired Lipid peroxidation Oxidative stress can lead to the modifications of biological molecules, including DNA, lipids and proteins and has been implicated in many pathological conditions
    12. 12. Evaluate the association between alterations in nuclear morphology and oxidative stress by identifying protein products of lipid peroxidation (oxoLPP).
    13. 13. “Método donde los biólogos moleculares y celulares conducen estudios experimentales sobre células aisladas de un organismo mantenidas en condiciones que permiten su supervivencia y crecimiento”
    14. 14. VENTAJAS Facilidad para cultivar células de un único tipo específico con propiedades homogéneas. Las condiciones experimentales pueden controlarse más fácilmente. Se lleva a cabo el proceso de clonación celular, donde una única célula puede formar una colonia de células idénticas DESVENTAJAS No se encuentran en el ambiente normal, y por ende sus actividades no están reguladas por otras células y tejidos como ocurre en células in vivo
    15. 15. ¿Para qué se realizó esto en la investigación?  Se cultivaron células de la línea Hep62, en condiciones fisiológicas.  Se les adiciono el “fatty acid complex” (FA) para inducir in-vitro la esteatosis y observar diferentes comportamientos.  A otras se les adicionó adicionalmente CoCl2, un compuesto que regula el estrés celular exógeno.  Se dejaron muestras control.
    16. 16. Es una determinación de las células vivas o muertas, en base a una muestra total de células. Por lo general se involucra tinción o aplicación de productos químicos para identificar dicha variable.
    17. 17. La acumulación del Rojo Neutro ocurre por entrampamiento del colorante dentro del ambiente ácido del lisosoma Se usó el ensayo de ABSORCIÓN LISOSOMAL NEUTRO ROJO. ¿Para qué se realizó esto en la investigación? Para determinar la viabilidad de las células cultivadas Se basa en la detección de los daños que producen los compuestos tóxicos sobre la integridad de la membrana de los lisosomas y sobre el control del flujo del colorante a través de la misma. Como respuesta se observa una disminución en la capacidad de las células para retener al colorante Rojo Neutro en el interior de los lisosomas, la cual es indicadora de la viabilidad celular
    18. 18. Método empleado para distinguir entre diferentes tipos de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, proteínas, entre otras. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos (cationes+) que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares.
    19. 19. ¿Para qué se realizó esto en la investigación? Para evaluar la acumulación de grasa intracelular SE USÓ TINCIÓN CON FLUORESCENCIA  Técnica más versátil y poderosa para la localización de proteínas dentro de una célula por microscopía óptica, y observación a través de microscopio de fluorescencia.  Químico fluorescente = es aquel que es capas de absorber la luz de determinada longitud de onda (de excitación) y emite luz (fluoresce) a una longitud de onda específica más larga.  Los fluorocromos emiten luz visible (+) o infrarroja (-).  En los microscopios, solo la luz fluorescente emitida por la muestra, se usa para formar la imagen. Se usó el fluorocromo rojo Nilo- DMSO
    20. 20. Cuando un investigador desea detectar la presencia de proteínas específicas, se recurre al método de anticuerpos unidos en forma covalente a los fluorocromos.(microscopía de inmunofluorescencia) La microscopía de fluorescencia convencional tiene limitaciones, la principial es :  Superposición de imágenes fluorescentes  Microscopía de barrido confocal. ¿Para qué se realizó esto en la investigación? Detectar los productos de la peroxidación de lípidos (reactivos (oxoLPP).)
    21. 21. . Ensayo que se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato-DH en un compuesto coloreado de color azul (formazan), permitiendo determinar la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas. ¿Para qué se realizó esto en la investigación? 1. Viabilidad, proliferación y supervivencia celular. 2. Función mitocondrial 3. Actividad de las oxidorreductasas mitocondriales
    22. 22. Se analizó mediante métodos de fluorescencia (DCFDA) la presencia de especias reactivas de oxígeno en todas las células (las que fueron tratadas con el FA complex, y las que no). Fisiológicamente Cantidades normales  Esenciales para la producción de energía.  Síntesis de compuestos  Fagocitosis  Transducción de señales.
    23. 23.  Envejecimiento  Cáncer  Enfermedades coronarias Patológicamente Cantidades aumentadas Detectar estado fisiológico, o patológico según la evaluación de ROS y estrés celular ¿Para qué se realizó esto en la investigación?
    24. 24. ES UNO DE LOS MÉTODOS MÁS PODEROSOS PARA DETECTAR UNA PROTEÍNA EN PARTICULAR EN UNA MEZCLA COMPLEJA DE PROTEÍNAS. Se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad relativa en la muestra Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función del peso molecular
    25. 25. En este método se usan 2 anticuerpos diferentes, uno específico para la proteína buscada y el otro unido a una enzima informadora (reporter).
    26. 26. Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su movilidad electroforética, es decir en función de su talla, o peso molecular SDS-PAGE SDS : Dodecilsulfato Sódico PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida
    27. 27.  Phospho-specific (Ser139)  Total histoneH2AX(CellsignalingTechnology)  β-actin (BDBios- ciences) ¿Para qué se realizó esto en la investigación? Para detectar proteínas específicas como las histonas, especialmente la H2AX
    28. 28. Poderosa técnica para la medición de la masa de las moléculas como las proteínas y los péptidos. ¿Para qué se realizó esto en la investigación? Análisis de lípidos carbonilados y la modificación de proteínas Tiempo inversamente proporcional a la masa
    29. 29. . Es una base de datos donde están las interacciones conocidas y predichas de las proteínas humanas. Las interacciones incluyen asociaciones directas (físicas) e indirectos (funcionales). Adicionalmente da información de proximidades en el genoma, fusión de los genes, datos bioquímico y moleculares, en resumen recolecta la información conocida de las proteínas. ¿Para qué se realizó esto en la investigación? Para tener un patrón establecido de las características propias de una proteína y poder analizar las modificaciones que presenta
    30. 30. • Lípidos intracelulares tinción Rojo Nilo y fluorescencia • Incremento de AG en la células HepG2 • El CoCl2 no presento ningún efecto acumulativo de lípidos ni el control ni en los hepatocitos con AG.
    31. 31. • Alteración en la forma del núcleo en células tratadas con AG y Ag/CoCL2 • Los oxoLPP mostraron gran intensidad tanto en células tratadas con AG y AG/CoCL2 • CoCL2 no mostro significancia con esta prueba A B fueron evaluados con CHH y microscopio de fluorescencia
    32. 32. • Se identificaron 3 bandas especificas por su intensidad en las muestras de Ag y AG/CoCL2 • Al analizar las bandas con MS se identificaron especies de Histonas H2A,1 H2B,1 H3,3 Y H4
    33. 33. Regulan metabolismo lipídico Reparación de ADN Splicing Remodelación de cromatina Proteínas del citoesqueleto
    34. 34. • Células tratadas con AG mostraron tener grandes cantidades de oxoLPP y LPP modificadas (en los grupos de AG y AG/CoCL2) • Se pudieron evidenciar modificaciones estructurales en hnRNPs lo que lleva Se ha demostrado que se afectan en estrés oxidativo en enfermedades hepáticas tal con la NAFLD y la esteatosis
    35. 35. RESEARCHERS HYPOTHESIS PROOF B.J. Stewart, J.R. Roede, J.A. Doorn, D.R. Petersen Demostration of excessive acumulation of lipid in hepatocytes is present in liver’s diseases (from HepG2 cell) M.Marmunti,M.Gavazza, A.Catalá Lipid peroxidation is one of the main events induced by oxidative stress and it can be particularly damaging to the liver nuclear membrane rich in PUFA. C.T. Shearn, D.S. Backos, D.J. Orlicky, R.L. Smathers- McCullough, D.R. Petersen, K.S. Fritz, P. Reigan. Although that liver can metabolized reactives oxoLPP has been shown that high level of modifications of liver and hepatocyte proteins due reactive oxoLPP J.J. Galligan, K.L. Rose, W.N. Beavers, S. Hill, K.A. Tallman, W.P. Tansey, L. J. Marnett Modifications of H3-H4 generate disruption in nucleosome formation which may challenge chromatic dynamics and histone turnover
    36. 36. • An accumulation of free fatty acids, induces an increase in the concentration of reactive oxygen species, which in turn generates an activation of lipid peroxidation mechanism. This last, produces reagents (oxoLPP) involved in the destruction of the core protein structures triggering disease states, such as non alcoholic steatosis. • With a clear knowledge of pathophysiological steatosis mechanisms, we could generate better and more efficient treatments, that can generate a stop in the disease progression reducing consequences, such as the steatohepatitis and cirrhosis. • Based on the same foundation of the previous one, we conclude that its important to investigate and treatments to prevent and avoid the disease
    37. 37. • Lodish, Harvery; Berk, Arnold; Matsudaira, Paul; Kaiser; Krieger, Chris A; Scott, Matthew; Zipursky, S. Lawrence; Darnell, James. “Biología celular y molecular”. 5. ed. Buenos Aires, Argentina. Editorial médica panamericana, 2005. pp: 313, 235, 187-189, 92-95. • Martínez Sánchez, Lina María; Vargas Grisales, Natalia; Toro Montoya, Andrés Eduardo; Pamplona Sierra, Ana Paulina; Queveda Orrego, Esteban. “Biología molecular”. 7. ed. Medellín, Colombia. Editorial Universidad Pontificia Bolivariana, 2014. pp: 139-140. • Anavi, Sarit; Ni, Zhixu; Tirosh, Oren; Fedovora, Maria. “Steatosis- induced proteins adducts with lipid peroxidation products and nuclear electrophillic stress in hepatocytes”. Redox biology. 2 de Abril del 2015. 158-168
    38. 38.  http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/38477.pdf  http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/liver/histo_hcytes.html  http://www.cyberlipid.org/perox/oxid0006.htm  http://www.aegastro.es/sites/default/files/archivos/ayudas- practicas/56_Enfermedad_hepatica_grasa_no_alcoholica.pdfc  http://www.bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol27_2_08/ibi03208.htm  http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf  http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lia/baiz abal_c_rh/capitulo4.pdf
    39. 39. María Alejandra Aristizábal Giraldo

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