O documento discute a aplicação da técnica de DNA fingerprinting na investigação criminal. Descreve os passos de extração do DNA, amplificação por PCR usando a sequência Alu como marcador, e electroforese para comparar amostras e identificar suspeitos.

1. DNA e a Investigação criminal DNA Detecção da Sequência Alu (TPA-25) num dos intrões de um alelo do gene “tissueplasminogeneactivactor” (TPA) Técnica de PCR (PolimeraseChainReaction) Electroforese – Dnafingerprinting

2. 3. Replicação da informação genética 2. Localização, natureza química e estrutura 1. Ácidos nucleicos 4. Extracção de DNA 5.4. Conclusão 5. DNA e a identificação de suspeitos 5.3. Comparação de resultados 5.2. Electroforese (DNA finger printing ) 5.1. Técnica de PCR Os conteúdos ... DNA

3. Ácidos Nucleicos – DNA - RNA

4. Ácidos nucleicos Localização do material genético PROCARIONTES –O DNA encontra-se livre no citoplasma.

5. Ácidos nucleicos Localização do material genético EUCARIONTES O DNA encontra-se no interior do núcleo (cerca de 99%).

6. MODELO DA DUPLA HÉLICE DE DNA JamesWatson e Francis Crick (1953)

7. MODELO DA DUPLA HÉLICE DE DNA JamesWatson e Francis Crick (1953)

8. MODELO DA DUPLA HÉLICE DE DNA JamesWatson e Francis Crick (1953)

9. Replicação do DNA

10. Replicação semiconservativa

11. Replicação do DNA

12. Actividade PráticaExtracção de DNA de células do epitélio bucal Procedimentos 1- Preparar uma solução salina muito concentrada. 2- Colocar 20 ml dessa solução salina na boca e bochechar vigorosamente durante 2 minutos. 3- Colocar o obtido em 2 num copo e filtrar em seguida. 4- Marcar duas linhas num tubo de ensaio, uma ao meio do tubo e outra perto do bordo. 5- Transferir o filtrado para um tubo de ensaio até à primeira linha. 6- Adicionar, cuidadosamente, isopropanol até à segunda linha. 7- Observar com atenção e registar. Materiais: - Copo - Funil - Papel de filtro - Palitos Reagentes: - Água - Sal - Isopropanol

14. Alguns sites com animações ... DNA - experiência de Hershey e Chase http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio21.swf DNA – Experiência de Meselson e Stahl http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf DNA – Replicação 1 http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swf DNA – Replicação 2 http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf Síntese proteica http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120077/micro06.swf Síntese proteica – Célula procariótica/Eucariótica http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120077/bio25.swf Ciclo celular http://nobelprize.org/educational_games/medicine/2001/cellcycle.html Animações em Biologia celular http://www.johnkyrk.com/index.pt.html

15. O DNA e a identificação de suspeitos……DNA fingerprinting(amplificação da sequência Alu)

17. Recolha do DNA dos eventuais suspeitos e vítima.

18. Amplificação do DNA pela técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) .

19. Electroforese em gel de agarose (separação de fragmentos de DNA).

20. Comparação dos resultados obtidos (DNA fingerprinting).

23. Nucleótidos (dNTP’s)

24. DNA polimerase

25. (constrói uma nova cadeia de DNA por emparelhamento com a cadeia progenitora durante a replicação do DNA).

27. Magnésio.Esta enzima é chamada de Taq polimerase, por ter sido originalmente extraída da bactéria Thermus aquaticus, que vive em águas vulcânicas cuja temperatura se situa perto da ebulição, sendo, por isso, estável e funcional a altas temperaturas). ?

28. PCR e suas aplicações Aplica-se em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Alguns exemplos … 1 – Medicina forense (pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime . como pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pele ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada numa impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de DNA fingerprinting). 2 - Detecção de patogenes 3 - Sexagem de organismos 4 - Análise de populações 5 - Clonagem do DNA 6 - Análise de expressão de genes e proteínas 7 - Organismos geneticamente modificados

30. A Taqpolimerase, para começar a construir a nova cadeia de DNA, tem que se ligar a um fragmento de cadeia dupla que possua uma extremidade 3’-OH livre.- Os cientistas usam primers específicos que irão ligar-se a sequências que flanqueiam a porção de DNA que lhes interessa amplificar. A temperatura utilizada é geralmente de 55°C e o processo dura entre 30-60 segundos.

32. ELECTROFORESE (DNA fingerprinting) Consiste na migração de moléculas carregadas electricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas num gel através da aplicação de uma corrente eléctrica.

33. DNA satélite:marcadores de variabilidade genética Verde: minissatélite Alu - DNAs satélites são sequências no DNA, que se repetem sucessivamente, e não parecem codificar proteínas essenciais. - Possuem a capacidade de “saltar”, ou de se copiarem, para outros locais do genoma, com grande frequência ao longo das gerações. - Longas repetições destas sequências estão espalhadas por todo o genoma humano (>30%), ocupando regiões de tamanhos variáveis. Mesmo no interior de intrões de genes!

34. Elemento Alu - Tamanho ~ 300 pb. - Distribuído por todo o genoma nos primatas. - 500-2000 cópias no genoma humano (alguns inseridos nos últimos mil anos). Uma cópia de Alu, denominada TPA-25, encontra-se com frequência num dos intrões de um alelo do gene “tissueplasminogeneactivactor” (TPA): Gene TPA (s/ Alu) primer primer intrão exão exão Gene TPA (c/ Alu) primer Alu TPA-25 primer Para detectar a sua presença, vamos amplificar (PCR) este intrão do gene TPA: Se contiver o TPA-25, os fragmentos de DNA serão mais longos (400pb), caso contrário serão mais curtos (100 pb).

35. Genótipos possíveis para a presença ou ausência do Alu TPA-25 900pb Marcador de peso molecular - conjunto de fragmentos de peso molecular conhecido, que servem de termo de comparação em relação à amostra. Assim, é possível estimar o tamanho dos fragmentos de DNA a analisar, comparando a distância por eles percorrida com a percorrida pelo marcador no gel de agarose. 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb Homozigótico para presença de TPA-25 Homozigótico para ausência de TPA-25 Marcador de peso molecular Heterozigótico Esta técnica permite identificar a informação herdada do pai e da mãe e distinguir indivíduos, como na cena de um crime. Assim, será necessário utilizar não um, mas vários marcadores genéticos*, utilizando uma abordagem semelhante, a esta para cada um deles. ? *15 marcadores genéticos STR (short tandem repeat) recomendados pelo Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de Genética Forense (GEP-ISFG).

36. DNA fingerprinting numa mesma família Em indivíduos não-aparentados, o número de repetições das regiões de satélites é demasiado diferente para que o padrão das várias regiões seja semelhante. O padrão transmite-se de pais para filhos, mas nunca é igual entre irmãos. Apenas gémeos verdadeiros têm padrões de bandas iguais.

38. 100-1000 microlitro+pontas

41. 94ºC – 30seg – Desnaturação

42. Tm ºC – 30seg – Hibridação

43. 72ºC –30seg – Amplificação (1min/kb) - Ciclos de amplificação (25-40)

44. 72ºC – 5-7min – Extensão final - Preparação do DNA a partir de amostras de cabelo 1. Remover um cabelo com folículo. 2. Inserir a folículo (ELIMINAR o resto do cabelo) num tubo de 1,5ml. 3. Incubar a folículo em 100μl de tampão de digestão (contendo ~6μg de proteinase K) durante 1 hora a 55° C, seguido de 10 minutos a 95° C 4. Usar 3μl desta solução como amostra genómica.

45. Actividade PráticaAmplificação de DNA genómico - PCR - Procedimento da reacção de PCR Misturar num tubo de PCR 50μl por reacção: - H2O..................................................................... qb 50μl - DNA.................................................................... ~250ng - primer directo...................................................... 25pmol - primer inverso .................................................... 25pmol - Tampão Taq (10x)............................................... 5μl - Mistura dos 4dNTPs 25mM cada ....................... 1μl - Taq polimerase.................................................... 1 unidade NOTA: O DNA é sempre o último a ser adicionado de modo a evitar contaminações.

46. Actividade PráticaAmplificação de DNA genómico - PCR

47. Actividade PráticaAmplificação de DNA genómico - PCR

49. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Materiais: - Erlenmeyer de 250ml - Espátula - Balança - Microondas - Tina de electroforese - Fonte de electroforese - Micropipetas P20 e P100 - Pontas para micropipeta amarelas - Microtubos - Transiluminador de UV Reagentes: - Tampão TAE (solução 50x: trisbase242g; ácido acético glacial 57,1ml; EDTA 0,5M, pH 8,0 , 100ml; água desionizada q.b. 1000ml) - Água- ultra-pura - Tampão de amostra (solução 6x: azul de bromofenol 0,25% p/v; xileno de cianol FF; 0,25% p/v; glicerol 30% p/v) - Brometo de etídeo 0,5μg/ml

50. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Preparação do gel de agarose 1 - Preparar uma solução de agarose em tampão TAE com concentração final de 1,5% (p/v). Aquecer a mistura no microondas, com agitação frequente, até toda a agarose se ter dissolvido. 2 - Colocar o tabuleiro da tina de electroforese no respectivo suporte de preparação do gel ou, na sua falta, selar com fita adesiva de autoclave. 3 - Colocar o pente em posição conveniente no tabuleiro para um correcto posicionamento dos poços: distância à extremidade e à base do gel. 4 - Verter a agarose no tabuleiro até uma altura de ~5mm. Eliminar bolhas de ar que se tenham formado, aspirando com uma micropipeta e deixar solidificar à temperatura ambiente. 5 - Quando o gel se tiver formado, retirar lentamente o pente para não danificar os poços, colocar o tabuleiro na tina de electroforese, de modo a que os poços estejam do lado do eléctrodo negativo, e adicionar tampão TAE até ~1mm acima do gel.

51. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Preparação das amostras 1. Para cada amostra, misturar num microtubo: 100-500ng de DNA, 4μl de tampão de amostra (5x conc.) e água ultra-pura q.b. 20μl. 2. Aplicar as amostras nos respectivos poços, enchendo lentamente cada poço com uma micropipeta. Não deixar extravasar a amostra do poço para não contaminar os poços vizinhos. 3. Colocar a tampa da tina. Verificar que as amostras estão colocadas do lado do pólo negativo (cátodo) e que a migração será no sentido do pólo positivo (ánodo). 4. Ligar os cabos à fonte de electricidade. Ligar a fonte e regular para uma voltagem de 1-5V/cm (distância medida entre os eléctrodos). Verificar se há desprendimento de bolhas dos eléctrodos devido à electrólise e se, passados alguns minutos, o azul de bromofenol já começou a migrar no sentido correcto. 5. Após migração julgada conveniente (por avaliação da posição do azul de bromofenol a sensivelmente 3/4 do comprimento do gel), desligar a corrente eléctrica na fonte, desligar os cabos e retirar a tampa da tina. Retirar o gel cuidadosamente para não partir e corá-lo em banho numa solução de brometo de etídeo 0,5μg/ml, durante 30-45 min à temperatura ambiente.

52. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Preparação das amostras (cont.) O brometo de etídeo é um agente mutagénico potente, usar sempre luvas e colocar em recipiente próprio todo o material que tenha entrado em contacto com este corante 6 - Examinar o gel à radiação ultra-violeta e fotografar para arquivar. (As radiações U.V. são extremamente perigosas, particularmente para os olhos, provocando lesões na retina. Evitar qualquer exposição dos olhos a estas radiações. Usar sempre óculos protectores ou máscaras de material opaco aos U.V).

53. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting

54. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting

55. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting

56. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting

57. Actividade PráticaElectroforese em Gel de Agarose - DNA fingerprinting Imagem obtida através do transiluminador de UV (Alu-TPA-25)

59. Alguns sites com animações ... Técnica do PCR http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/game/index.html DNA – dupla cadeia http://nobelprize.org/educational_games/medicine/dna_double_helix/ Código genético http://nobelprize.org/educational_games/medicine/gene-code/

62. 2009_Apresentação -P12_Téenicas de EngGenet P1

64. www.odnavaiaescola.org

65. http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/

66. http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reactionhttp://www.crbm1.gov.br/bio65/artigocien_65.asp

67. www.gep-isfg.org/ISFG/Portugues/portada.php

68. http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/T%E9cnicas%20B%E1sicas%20de%20Biologia%20Molecular%20final.pdf