Rekombinasi genetik adalah proses pemindahan fragmen DNA antar sel yang mampu membentuk susunan gen baru. Teknik rekayasa genetik memungkinkan manipulasi organisme dengan mengisolasi, memotong, dan menyisipkan gen yang diinginkan ke dalam vektor untuk diintroduksikan ke dalam sel inang. Sel inang yang mengandung gen rekombinan kemudian diseleksi untuk studi lebih lanjut.

1. REKOMBINASI
GENETIK

2.  Rekombinasi genetik ialah pembentukan
susunan gen baru dengan jalan pemindahan
segment DNA dari satu sel ke sel yang lain,
yang mampu bereplikasi, ditranskripsi dan
ditranslasi. Rekombinasi ini dapat terjadi
secara alamiah dan dapat dibuat /
direkayasa.

3. DNA REKOMBINAN
Rekayasa genetic
 Rekayasa genetic adalah teknik untuk
menghasilkan molekul DNA yang berisi gen
baru yang diinginkan atau kombinasi gen-
gen baru atau dapat dikatakan menipulasi
organisme.
 “To clone = to make identical coples”

4. Gen Cloning
 Gen cloning ialah isolasi dan pemurnian gen
spesifik dan memindahkan serta
menyisipkan gen yang diinginkan dari
genom besar yang komplek ke genom kecil
yang lebih sederhana kemudian
memperbanyak (replikasi) DNA
rekombinan ini, dan memasukkan pada sel
inang.

5. Pembuatan DNA rekombinan dapat
dibagi menjadi beberapa langkah.
1. Isolasi sumber DNA yang diinginkan, ini dapat
dikerjakan dengan 3 cara;
a) DNA dapat berasal dari total genomic organisme
yang diinginkan. Isolasi ini dapat dilakukan
dengan bermacam-macam cara.
b) DNA yang dibuat dari mRNA yang diisolasi dari
jaringan tertentu. Complementary DNA (cDNA)
dibuat dengan template mRNA tadi dengan
menggunakan enzim ”reverse transcriptase”
c) Dapat juga dengan DNA yang dibuat secara
invitro dari nukleotida dan enzim polimerase
DNA

6. 2. Pemotongan gen spesifik yang di inginkan,
pemotongan ini dilakukan dengan Enzim
endonukease restriksi. Enzim ini dapat memutus
rantai DNA pada urutan-urutan tertentu yaitu
pada gugus urut-urutan palindrom yang spesifik
untuk enzim tersebut. Enzim endonukease
restriksi tertentu hanya dapat memutus rantai
DNA pada urut-urutan tertentu saja, namun dapat
bekerja terhadap DNA yang berasal dari
organisme apa saja. Jadi suatu fragmen DNA
dapat disambung ke DNA lain kalau keduanya
diputus endonukease restriksi yang sama.
Beberapa enzim endonuklease restriksi memotong
dengan menghasilkan ujung tumpul (”blunt end”)
contohnya Hindll; dan beberapa yang lain
menghasilkan ujung lekat (”sticky end”) misalnya
ECORI.

7. Enzim Restriksi untuk memotong DNA:
Contoh: Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali oleh
Herbert Boyer pada tahun 1969 dari E.coli. Enzim EcoRI
memotong pada bagian antara basa G dan A pada sekuens
GAATTC.

8. 3. Langkah senjutnya ialah menyisipkan gen
yang diinginkan ini ke alat pembawa
(”cloning vektor”). Vektor ini dapat
plasmid. Bacteriofag atau kosmid. Jadi
menyambung gen yang telah dipotong tadi
ke DNA vektor.

9.  Penyambungan DNA dilakukan dengan
”enzim ligase”. Seperti telah dikatakan
dimuka DNA-DNA yang dipotong dengan
enzim endonukease restriksi yang sama
akan dapat disambungkan. Hanya saja,
kalau pemotongan itu menghasilkan ujung
yang lekat, karena ujung-ujung fragmen tadi
saling dapat berpasangan.

10.  Jika hasil pemotongan DNA dengan enzim
endonukease restriksi itu ujungnya tumpul
tidak dapat disambung. Untuk dapat
disambung pada ujung, perlu ditambahkan
fragmen DNA. Ada 3 cara penambahan;
n Penambahan ekor homopolimer
n Penambahan linker
n Penambahan adaptor

11. Penambahan ekor homopolimer
 Penambahan ekor homopolimer dilakukan
dengan menggunakan enzim terminal
transferase. Sedang untuk penyambungannya
dengan enzim ligase. (gambar 6) mula-mula
plasmid dipotong dengan menggunakan enzin
endonuklease restriksi yang menghasilkan
ujung tumpul, kemudian diberi ekor poli-T
dengan menambahkan dTTP dan enzim
terminal transferase. Ekor poli-A pada DNA
yang diinginkan akan berpasangan dengan
ekor poli-T pada plasmid. Dengan enzim ligase
terbentuklah DNA rekombinan atau DNA
Khimera.

13. Penambahan linker
 Linker merupakan potongan DNA rantai ganda
yang dibuat secara invitro dengan urutan nukleotida
yang ditetapkan (Caheller et al., 1997).
 Molekul ini disambungkan pada ujung-ujung
tumpul DNA asing yang akan disisipkan/
diinginkan dengan enzim ligase.
 Kemudian diperlakukan dengan enzin endonuklease
restriksi tertentu yang telah disesuaikan dengan
pembuatan linker tadi.
 Setelah terbentuk ujung lekat (”sticky ended”) maka
potongan DNA disisipkan ke vektot yang telah
dipotong dengan endonuklease restriksi yang sama
(gambar 7)

15. Penambahan adaptor
 Adaptor seperti juga linker merupakan segmen atau
potngan pendek DNA yang dibuat secara invitro, dengan
ujung satu lekat satu tumpul, tidak tumpul semula pada
linker (Wu et al,. 1978).
1) Misalnya DNA asing yang berisi sisi Bam HI yang
akan disisipkan ke vektor dengan tempat pemotongan
BamHI.
2) Molekul adaptor Bam mempunyai ujung tumpul
dengan gugus fosfat pada ujung 5’ dan ujung yang
tidak lekat.
3) Adaptor kemudian disambungkan pada DNA yang
akan disispkan
4) DNA asing dengan adaptor yang ditambahkan
kemudian difosforilasi pada ujung 5’ yang akhirnya
disisipkan pada vektor (gambar 8)

17. Vektor
Alat pemindah gen yang diinginkan / dipindahkan,
atau ”DNA carrier” disebut ”vektor”. Dikenal 4
macam vektor yang banyak digunakan dalam
rekayasa genetik.
 Plasmid
 Bacteriophage lambda
 Kosmid
 Bacteriophage rantei tunggal (phage M13)
Bacteriophage lambda dan phage M13 adalah virus,
sedangkan kosmid ialah gabungan “Cohesive ends“
bakteriophage dan plasmid.

18. Plasmid sebagai Vektor
Sifat-sifat berikut adalah sifat-sifat yang dimiliki plasmid
sehingga plasmid sesuai digunakan untuk vektor dalam
rekayasa genetik.
2) Ukuran kecil, sehingga mudah diisolasi dalam keadaan
utuh
3) Mempunya bentuk DNA sirkuler sehinggan tetap stabil
pada saat diisolasi
4) Melangsungkan independent replikasi/replikasi sendiri,
sehingga replikasi berlangsung diluar kontrol sel.
5) Terdapat dalam beberapa copy di dalam sel
6) Kerap kali memiliki gen untuk resistensi terhadap
antibiotik sehingga memudahkan detaksi dan seleksi
terhadap plasmid yang berisi gen yang diinginkan.

20. PLASMID
DALAM
PEMBENTUKAN
DNA
REKOMBINAN

21. Untuk dapat digunakan sebagai vektor
yang baik plasmid harus memenuhi sifat-
sifat berikut :
 Harus berukuran kecil
 Termasuk golongan plasmid “relaxed“
 Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu atau
lebih enzin restriksi pada tempat yang tidak
esensiil untuk replikasi.
Dari plasmid-plasmid yang memenuhi kriteria-
kriteria tersebut yang paling banyak dipakai
ialah pBR 322.

22. Sifat-sifat plasmid pBr 322 ialah:
 Relatif kecil dengan berat molekul 2,6 x 106
 Stabil, bertahan pada sel inang (host) dengan jumlah
1-20 copy/sel
 Dapat diperbanyak jumlahnya sampai 1.000 – 3.000 copy
tiap sel (dengan jalan menghambat sintesa protein)
 DNA asing yang besar (sampai 10 kilobasa) dapat
disisipkan
 Telah diketahui urut-urutan nukleotida sebanyak 4362
nukleotida secara komplit
 Mempunyai sisi pemutus tunggal untuk enzim restriksi
PstI, SalI, EcoRI, HindIII, BamHI
 Mempunyai dua penanda resistensi untuk antibiotik
ampicilin dan tetrasiklin, sehingga mudah diseleksi.

23. Sel inang
Sel inang yang baij digunakan untuk gene
yang diklonkan harus mempunyai sifat-sifat
antara lain:
2) Cepat tumbuh
3) Mampu tumbuh pada mediun kultur yang
murah
4) Tidak pathogenik
5) Stabil dalam kultur

24. Dengan demikian E.coli banyak
digunakan karena E.coli mempunyai
sifat-sifat berikut:
n Tumbuh dengan cepat
n Kebutuhan nutrisi sederhana
n Informasi genetiknya sudah banyak diketahui
dengan baik
n Kemampuan E.coli untuk dapat
menyokong/menampung tumbuhnya hampir
semua bakteriophage.

25.  Tetapi ternyata masih ada kekurangan karena
E.coli berbahaya kalau dipakai dalam jumlah
besar, sebab E.coli biasa jidup pada usus dan
potensial untuk menjadi pathogenik. Namun
telah dapat dibuat modifikasinya untuk
menghilangkan kekurangan tersebut, dan
karena proses biokimianya dan genetika E.coli
sudah banyak diketahui maka E.coli
merupakan sel inang yang paling banyak
dipakai untuk mempelajari kloning. Disamping
E.coli, Bacillus subtilis dan khamir
Saccharomyces cerevisiae juga banyak dipakai.

26. 3. Memasukkan DNA rekombinan yang
terbentuk ke sel inang
Memasukkan DNA rekombinan atau khimera
DNA (yaitu vektor yang berisi genom yang
diinginkan/disisipkan) ke dalam sel inang
dapat dilakukan dengan;
2) Transformasi
3) Transfeksi
4) DNA-packaging
5) Microinjection

27. Transformasi
 Masuknya molekul DNA apa saja ke sel hidup (baik sel
prokariotik maupun eukariotik) disebut transformasi.
(Brown, 1986).
 Teknik transformasi pada E.coli dengan perlakuan CaCl 2
yamg dilakukan oleh Mendel dan Higa (1970)
menunjukkan bahwa E.coli dapat menyerap DNA
bakteriophage lambda; dan pada percobaan selanjutnta
oleh Cohen et al., 1972 menunjukkan E.coli dapat juga
menyerap DNA plasmid dengan perlakuan sama (CaCl2)
menyebabkan prespitasi DNA pada dinding sel bagian
luar, dan mungkin garam tersebu menyebabkan terjadinya
perubahan dinding sel yang menaikkan kemampuan
mengikat DNA.
 Pengruh perendaman hanyalah pengikat DNA pada
dinding sel , tidak penyerapan masuk ke sel. Jadi pada saat
DNA ditambahkan ke sel yang sudah diperlakukan hanya
terjadi pengikatan DNA pada bagian luar dinding.
 DNA baru masuk meresap ke sel setelah suhu dinaikkan
0

28. Transfeksi
 Transfeksi sama dengan transformasi, hanya
perbedaanya pada transfeksi yang masuk
bukan plasmid tetapi DNA phange atau
virus. Seperti juga dengan plasmid; DNA
phange juga dicampurkan dengan sel E.coli
yang sudah mengalami perlakuan,
kemudian masuknya DNA diinduksi
dengan kejutan pemberian panas (”heat-
shock”)

29. DNA-packaging
 Transfeksi dengan molekul DNA lambda
tidak begitu efisien dibanding deng n
infeksi sel dengan partikel phange yang
masak.
 Maka lebih efisien kalauu molekul DNA
phange itu dikemas di dalam partikel
phange.

30. Microinjection
 Cara lain untuk memasukkan DNA ialah
dengan microinjection yaitu suatu cara yang
menggunakan jarum yang sangat kecil (super
kecik) yang dipakai untuk menyuntikkan atau
memasukkan molekul DNA secara langsung
ke inti sel yang di traansformasi. Di sini DNA
tidak perlu disematkan pada vektor, sebab
biasanya penggabungan DNA pada kromosom
inang dapat terjadi.

31. 4. Menyeleksi clone
(rekombinan)
Untuk menyeleksi sel bakteri yang
mengandung vektor yang berisi gen yang
kita inginkan dapat ditempuh beberapa cara
yaitu:
2) Cara genetik
3) Hibridisasi asam nukleat
4) Immunokimia

32.  Diambil contoh cara genetik dengan vektor
plasmid dan sel inangnya E.coli .
 Plasmid yang dipakai sebagai vektor berisi
dua gen resisten terhadap antibiotik yaitu
tetrasiklin dan ampisilin. Plasmid dipotong
dengan endonuklease spesifik yang
memotong gen resisten ampisilin. Den
asing yang diinginkan disisipkan pada
tengah-tengah gen resisten terhadap
ampisilin, maka gen ini tidak aktif lagi. Jadi
plasmid yang berisi gen yan diinginkan
tidak akan tumbuh pada media yang berisi
ampisilin.

33. Hibridisasi asam nukleat
 Banyak cara telah dikembangkan untuk
menyeleksi dengan jalan hibridisasi, yang
paling umum adalah cara Grunstein and
Hogness (1975). Cara seleksi ini
menggunakan RNA ”probe” yang
radioaktif.

34.  Koloni yang akan diseleksi pertama-tama dibuat
replikanya pada petri agar, yang sebelumnya telah
dilapisi kertas filter nitroselulosa. Ini dibuat dua
buah (petri yang satu disimpan untuk
referen/acuan. Kertas filter yang telah membawa
koloni diambil diperlakukan dengan basa (0,5 N
NaOH) sehingga koloni bakteri lisis dan DNA-nya
mengalami denaturasi (DNA jalin tunggal)
tertinggal pada kertas nitroselulodsa. DNA ini
ditambatkan pada kertas erat-erat dengan jalan di
oven pada suhu 800C. RNA yang dibuat
radioisotop dihibridisasikan ke DNA dan hasil
hibridisasi dipantau dengan autoradiografi. Koloni
yang memberikan autoradiografi positif adalah
koloni yang dicari (mengandung DNA yang
diingikan).