1. Paola Grammatico
Irene Bottillo
18-04-2015
Tecniche di nuova
generazione nella diagnostica
molecolare di patologie cardiache

2. Sequence revolutions

3. Throughput
Kb
Gb
Mb
Lenght of Read (bp)
70030050
NGS
whole genome
whole transcriptome
whole exome
target seq
Sequence revolutions

4.  Genome sequencing: intero genoma -> mutazioni puntiformi
+ riarrangiamenti cromosomici
 Exome sequencing: solo le regioni codificanti di un genoma
 Trascriptome sequencing: sequenziamento e
quantificazione degli RNA, sia codificanti che non-
codificanti -> fusioni intrageniche + mutazioni puntiformi +
isoforme + profili di espressione
 Target sequencing: diverse regioni/geni
contemporaneamente

5. NGS, applicazioni
RNA
 RNA-Seq
 studi di espressione
 Small-RNA
Regolazione
 metilazione
 analisi interazioni DNA-proteine
DNA
 resequencing geni/genomi noti
 sequenziamento de novo
 sequenziamento di regioni target
 identificazione SNP/mutazioni
 identificazione riarrangiamenti strutturali e CNV
transcriptome sequencing
whole genome sequencing
- target sequencing
- exome sequencing
ChIP-Seq

6. Molecular analysis of sarcomeric and non-sarcomeric genes
in patients with hypertrophic cardiomyopathy
Bottillo Irene1, D’Angelantonio Daniela, Caputo Viviana2, Paiardini Alessandro3 , Lipari Martina1, De
Bernardo Carmelilia1, Giannarelli Diana4, Pizzuti Antonio2, Majore Silvia1, Castori Marco1, Zachara
Elisabetta5, Re Federica5, Grammatico Paola1
1Medical Genetics, Department of Molecular Medicine, Sapienza University, San Camillo-Forlanini Hospital, Rome, Italy;
2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, Rome, Italy; 3Department of Biochemical Sciences,
Sapienza University of Rome, Rome, Italy; 4Biostatistic Unit, Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italy;
5Cardiomyopathies Unit, Division of Cardiology and Cardiac Arrhythmias, San Camillo-Forlanini Hospital, Rome, Italy

7. Scopo del lavoro
Il test genetico permette di confermare o escludere la HCM in casi
atipici, e di identificare portatori in fase pre-clinica attraverso
screening familiare
Analisi genetiche mediante
Sanger si limitano a 4-5 geni e
richiedono tempi/costi
impegnativi
Assenza di chiare correlazioni
genotipo-fenotipo
NGS di 62 geni cardiomiopatia-associati per un test molecolare
altamente sensibile e per determinare il contributo di ogni gene
nell’insorgenza ed espressione della HCM

8. Principali proteine coinvolte nelle cardiomiopatie
HCM
DCM
ARVD

10. Materiali e Metodi
 44 pazienti HCM adulti, 23 ♂ e 21 ♀
 NGS (Ion Torrent PGM) di 62 geni (CDS, ss, 5’UTR, 3’UTR)
ABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CALR3, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, CTF1, DES, DMD,
DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, EYA4, FHL2, FXN, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2,
LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL,
NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP,
TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTR, TXNRD2 e VCL

11. Esperimento Ampliseq su Ion Torrent PGM
ABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CALR3, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, CTF1, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD,
EYA4, FHL2, FXN, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2,
MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP,
TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTR, TXNRD2 e VCL
Analisi dei dati (Torrent Suite 4.0)
 Alignment on hg19
 Coverage/Read depth analyses
 varianti’ calling
Annotazione delle varianti (wAnnovar2 WEB SERVER)
Filtraggio delle varianti
 MAF < 0,01
Prioritizzazione delle varianti
 Exonic
 ±10bp from splicing junction
Validazione delle varianti (Sanger)
Materiali e Metodi
Predizioni funzionali
in silico Molecular Modelling
Correlazioni genotipo-
fenotipo

12. Risultati
 18.810 varianti/44 pazienti
~ 427 varianti/pazente
 Validazione del test NGS: confermate tutte le varianti identificate
precedentemente mediante Sanger di MYBPC3, MYH7, TNNT2,
TNNI3 in 23/40 pazienti

13. 155 varianti
SANGER
VALIDATION
FILTERING
(MAF<0,01) +
PRIORITIZATION
(Ex ± 10bp)
18.810
varianti
Risultati
106 non-sinonime
(nsSNV)
 81 missense
 15 intronic (±10 bp)
 4 nonsense
 4 frameshift
 1 stop-loss
 1 in frame deletion
49 sinonime in Htz

14. Risultati
 35/44 (82%) dei pazienti portatori di una o più varianti
non-sinonime
 4 pazienti: solo varianti sinonime
 4 pazienti negativi
 24/62 geni negativi
ACTC1, ANKRD1, CASQ2, CRYAB, CTF1, DES, EMD, EYA4, FXN, LDB3, MYL3, MYLK2, MYOZ2, NEXN, PLN,
PRKAG2, PTPN11, SGCD, TAZ, TCAP, TMEM43, TNNC1, TNNI3 and TTR

15. Numero varianti non-sinonime identificate per ciascun gene
Risultati

16. Risultati
Numero varianti non-sinonime identificate per ciascuna
categoria genica funzionale
“Other” includes the loci coding for
lysosomal, thioredoxin reductase,
anti-apoptotic and membrane
proteins

17. Risultati
Numero e zigosità dei cambi non-sinonimi identificati nei 44
pazienti HCM

18. Risultati
Numero dei pazienti mutate VS categoria genica
Sarcomeric
Other
Desmosomal
5 31
8
12 3
4

19.  Molecular Modelling
Risultati
Structural comparison of wild-type and mutant forms for (a)
FLH2 A37S; (b) LAMA4 E1646G; (c) MYH6 R23H; (d) MYH7
A226T; (e) MYH7 R143Q; (f) MYOM1 R711H; (g) PKP2
R767S; (h) RYR2 E1127G; (i) RYR2 R485Q. The mutation is
indicated in white. The predicted structural effects of
mutations are: (a, d) steric hindrance (red circles); (b) local
misfolding of linker domain (orange); (c, e, f, g) loss of
important inter-residues contacts; (h) loss of a π-anion
interaction; (i) loss of a π-cation interaction.
Effects of nsSNVs for (a) the cadherin domain of DSC2; (b)
the melibiase domain of GLA; (c) the FGF13 interaction
domain of SCN5; (d) the Na Channel of SCN5 (the
approximate position of the negatively charged Asp872
residue is shown in red, in each of the four protein
subunits forming the channel).

20. Pt Gene Mutation NM Status Type
dbSNP138
clin ass
Referenc
e
chr start end
Re
f
Var UNIPROT Domain
PolyPh
en-2
SIFT
Conservation-
GERP score
Comment
1
MYBPC3
c.T1664C,
p.M555T
000256 Htz missense -
Girolami
et al.
2006
chr11 47363668 47363668 A G Q14896
Ig-like C2-
type 4
B (0) T (1) 4.22
Mol Mod: No
predicted
deleterious
effect
RyR2
c.A3380G,
p.E1127G
001035 Htz missense rs200525962 - chr1 237730032 237730032 A G Q92736
B30.2/SPR
Y 2
D
(0.979)
DLT (0) 5.29
Mol Mod:
Probably
destructuring
the tertiary
structure (loss of
π-anion
interaction with
Trp1145)
3 TMPO
c.A1037G,
p.H346R
003276 Htz missense - - chr12 98927072 98927072 A G P42166
disordered
region
B
(0.001)
T (0.32) -1.03
Mol Mod: No
possible
prediction
5 MYH6 c.643-5C>T 002471 Htz intronic rs199859986 - chr14 23873602 23873602 G A - - - - -1.15
Branch-point
site broken
8
RBM20
c.G3373A,
p.E1125K
001134
363
Htz missense rs116908219 - chr10 112583294 112583294 G A Q5T481 -
PD
(0.911)
T (0.34) 6.16
Probably not
pathogenic
MYH6
c.2928+5G
>A
002471 Htz intronic rs28730772 - chr14 23862870 23862870 C T - - 4.37
Donor splice site
broken
CSRP3
c.T10C,
p.W4R
003476 Htz missense rs45550635
Knoll et
al. 2002;
Geier et
al. 2008
chr11 19213986 19213986 A G P50461
LIM zinc-
binding 1
PD
(0.888)
DLT (0.01) 6.02
Previously
reported alone
in CMD1M
pazienti and in
conjunction with
a sarcomeric
mutation in
HCM pazienti
Risultati
… … …
Dall’analisi della tipologia delle varianti, revisione della letteratura, analisi in silico e
molecular modeling, tutti i pazienti sono risultati portatori di almeno una nsSNV
patogenetica, o già descritta come un modificatrice del fenotipo

21. Risultati
 Correlazioni genotipo-fenotipo
 Age at diagnosis
 Family History
 Heart Transplantation
 NYHA
 Maximal Wall Thickness
 Left Ventricular Mass
 Cardiac magnetic resonance areas of contrast
 Left Ventricular Ejection Fraction
VS
 total number of nsSNVs
 number of sarcomeric nsSNVs
 number desmosomal nsSNVs
 number of nsSNVs in genes for K+ and Na+ channels and interacting proteins
 number of nsSNVs in mRNA splicing, cellular enzymes and nuclear genes
 number of cytoskeletal nsSNVs
 number of Z-disk nsSNVs
 number of intracellular calcium homeostasis nsSNVs
 ↑ num. nsSNVs: ↓ età di esordio
 nsSNVS in geni per Ca++ homeostasis, per canali K+ e Na+, e per
proteine del citoscheletro possono modulare l’espressione di HCM
 Sudden Cardiac Death
 Obstructive Cardiomyopathy
 Supraventricular Arrhythmias
 Non-Sustained Ventricular Tachycardia
 Syncope/Presyncope
 VO2
 Maximal oxygen uptake
 Diastolic Dysfunction
 Thoracic pains
 ECG Hypertrophy criteria
 Conduction abnormalities
 Hypertension
 Intracardiac Defibrillator
 Pacemaker
 Myectomy
 Coronary-Ventriculography
 AMI/NSTEMI
 Coronary Bypass

22. Discussione
 Ruolo di 62 geni nell’HCM
Percorso sperimentale/bioinformatico applicabile
in un contesto clinico
 82% dei casi: almeno una nsSNV rara

23. Discussione
3/44 pazienti sindromici
 Paz 24: ♀, 7 anni, sindrome di Cantù (AD, ipertricosi
congenita,osteocondrodisplasia, cardiomegalia, HCM e dismorfismi)
ABCC9 c.C3460T,p.R1154W (Htz): descritta in 3 pazienti con S. di Cantù
(vanBon et al 2012)
 Paz 27: ♀, 23 anni, malattia di Danon o glicogenosi da deficit di
LAMP2 (Lysosomal-Associated Membrane Protein 2), X-linked
recessiva (cardiomiopatia , debolezza muscolare, ritardo mentale)
LAMP2 c.453delT,p.F151fs mai descritta prima
 Paz 10: ♀, 65 anni
GLA c.A644G,p.N215S (alfa-galattosidasi A, malattia di Fabry, X-linked
recessiva, segni neurologici, angiocheratoma, insufficienza renale,
cardiomiopatia)
p.N215S già associata a forma con coinvolgimento solo cardiaco (Davies et,
al, Eng et al 1993)

24. Prospettive future …
Toward a prenatal non-invasive diagnosis of Congenital Heart
Diseases (CHDs): identification of early plasmatic markers (miRNAs)
Non-Invasive Prenatal Diagnosis (NIPD) targets cell-free
DNA andRNA (fetal + maternal) circulating in maternal
plasma
miRNA vengono rilasciati dalla
placenta e poi esportati nella
circolazione materna, qualificandosi
come BIOMARKER PRENATALI DI
PATOLOGIA
miR-19b, miR-22, miR-29c, miR-375
sono up-regolati in gravidanze di feti
CHD

25. Identificare miRNA come biomarcatori di CHD fetale in uno stadio precoce di
gravidanza
Scopo del progetto
Pazienti e Metodi
 Gravidanze di feti non-cromosomici
 Gravidanze di feti cromosomici (trisomia 13, 18, 21 e monosomia X)
 Gravidanze di controllo (non crososomici, no CHD)
Studio del miRNoma sia da plasma materno che da liquid amniotico

27. ... Grazie Prof. Paola Grammatico
Dr. Lilia De Bernardo
Dr. Daniela D’Angelantonio
Dr. Martina Lipari
Dr. Marco Castori
Dr. Silvia Majore
Dr. Elisabetta Zachara
Dr. Federica Re
Dr. Flavia Ventriglia
Dr. Antonella Giancotti
Dr. Angela Caiaro
Dr. Viviana Caputo
Dr. Alessandro Paiardini