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Diseño de la portada: DD DISSENY GRÀFIC, 2011
www.dddisseny.com
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Fotografía e ilustración de Rosaura Esteve P...
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Nuevo mecanismo de evasión a estrés
energético en melanoma
Tesis Doctoral
Rosaura Esteve Puig
Barcelona, Julio de 2011
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IV
Nuevo mecanismo de evasión a estrés
energético en melanoma
Memoria presentada por
Rosaura Esteve Puig
Para optar al gra...
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«...que tot està per fer i tot és possible...»
Ara mateix
L'àmbit de tots els àmbits (1981)
Miquel Martí i Pol
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A tots els qui estan aquí dins
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CONTENIDO
ÍNDICE 6
ABREVIATURAS 15
INTRODUCCIÓN 23
OBJETIVOS 59
RESULTADOS 63
DISCUSIÓN 111
CONCLUSIONES 125
MATERIALES ...
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ÍNDICE 6
Índice de figuras 10
Índice de tablas 14
ABREVIATURAS 15
Símbolos 22
INTRODUCCIÓN 23
CÁNCER 26
MELANOMA 28
Gene...
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LKB1/STK11 48
Generalidades del gen LKB1/STK11 48
Complejo LKB1:STRAD:MO25 49
LKB1 como multicinasa 50
LKB1 como supreso...
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La apoptosis inducida por estrés metabólico tras la inactivación del oncogén
BRAFV600E
está mediada por miembros de la s...
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Congelación 139
Tripsinización 139
Muestras tumorales 140
Reactivos y anticuerpos 140
Inhibidores, factores de crecimien...
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Figura 1I/ Linaje de las divisiones celulares mitóticas desde el huevo
fertilizado hasta la célula sencilla tumoral mos...
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Figura 7R/ El residuo Ser431 murino/Ser428 humano de LKB1 se fosforila en
respuesta a distintos factores de crecimiento...
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Figura 19R/ La inhibición de la señalización de BRAFV600E
reasocia los
complejos de LKB1-AMPKα en respuesta a estrés en...
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Figura 30R/ Restauración de la vía de estrés energético en las líneas
celulares de melanoma NRASQ61K
derivadas de pacie...
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Tabla 1I/ Alteraciones genéticas en melanoma maligno 33
Tabla 1A/ Modelos murinos de melanoma 181
Tabla 2A/ Secuencias ...
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ADN Ácido Desoxiribonucleico
AKT3 Oncogén viral del timoma murino AKT homólogo 3 (proteína cinasa
B, gamma), del ingl...
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Enhanced Green Fluorescent Protein
ERK Cinasa Regulada ...
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M/N
MAPK Del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase
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inglés Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide G...
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AA Aminoácido
D Ácido aspártico
Da Dalton
E Ácido glutámico
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CÁNCER
El cáncer es una enfermedad biológica y clínicamente compleja que engloba a
más de 100 enfermedades distintas co...
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células tumorales se adaptan para sobrevivir, se transforman en un fenotipo
tumoral resistente a la muerte celular, e i...
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oxígeno, proceso denominado glucólisis aeróbica, ya que «fermentan» en
presencia de oxígeno. No obstante, en células no...
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la radiación ultravioleta (UV) a lo largo de la vida, mientras que el
melanoma cutáneo se encuentra fuertemente asociad...
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estimulante del melanocito (MSH-α) que activa a la enzima adenilil ciclasa
(AC) a través de la vía de la activación del...
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aumento de la radiación UV-A y UV-B en la superfície terrestre22
, causando
efectos mutagénicos y carcinogénicos sobre ...
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aumento de expresión de N-cadherina, características que confieren la
capacidad de invadir la dermis, e incluso pudiend...
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Fase con un elevado potencial maligno y metastático, debido a la invasión de los
melanocitos en la dermis y a la capaci...
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del melanoma, pero la combinación de mutaciones en ambas vías de señalización
promueve la melanomagénesis32,17,41
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inhibición de la degradación por HDM2, ligasa E3 de ubicuitinas específica
para p5351,52,53,54
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En el melanoma familia...
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frecuencia entre el 50-70 % de los melanomas cutáneos (Tabla 1I). La mutación
más observada en BRAF es la sustitución d...
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enzimas de pigmentación 45
. MITF se expresa en muchos melanomas humanos, y es
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Figura 3I/ Vías de señalización diana en melanoma
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Así, conocer y entender la biología del melanoma da la oportunidad de
desarrollar terapias dirigidas.
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Otra vía de señalización diana importante para el tratamiento del melanoma es
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Así, mejorar el entendimiento de la biología del melanoma es ahora una nueva
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BRAF y no en CRAF. De este modo, mutaciones e...
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defosforilación de BAD, que tiene como resultado la inducción de la
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Complejo LKB1:STRAD:MO25
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LKB1 como cinasa de residuos Ser/Thr fosforila a AMPKα en el residuo Thr 172,
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Asimismo, LKB1 tiene una función clave en el desarrollo embrionario temprano
en mamíferos. Así, los ratones que carecen...
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PKA, y la prenilación de la cisteína 433 de LKB1 son esenciales para la
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fosforilación de Raptor175
. También se ha descrito que altos niveles celulares
de AMP activan a AMPK, responsable de l...
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Control del ciclo celular
LKB1 se encuentra implicado en el control del ciclo celular, mediando la
parada del ciclo cel...
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histopatológica de los estadios de la progresión del melanoma humano (Tabla
1A). Esto es debido a que desafortunadament...
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murino inducido por radiación UV neonatal es capaz de recapitular
histopatológica y cronológicamente todos los estadios...
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Nuevo mecanismo de evasión a estrés energético en melanoma

  1. 1. I Diseño de la portada: DD DISSENY GRÀFIC, 2011 www.dddisseny.com 93 804 7170 Fotografía e ilustración de Rosaura Esteve Puig
  2. 2. II Nuevo mecanismo de evasión a estrés energético en melanoma Tesis Doctoral Rosaura Esteve Puig Barcelona, Julio de 2011
  3. 3. III
  4. 4. IV Nuevo mecanismo de evasión a estrés energético en melanoma Memoria presentada por Rosaura Esteve Puig Para optar al grado de Doctora por la Universitat de Barcelona Tesis realizada en el Programa de Recerca en Oncologia Mèdica Institut de Recerca de l’Hospital Universitari Vall d’Hebron dirigida por el Dr. Juan Ángel Recio Conde Tesis adscrita en la Universitat de Barcelona Facultat de Biologia Departament de Bioquímica i Biologia Molecular tutorizada por la Dra. Maria Neus Carbó Carbó Programa de Doctorado en Biomedicina Bienio 2005-2007 Barcelona, Julio de 2011 Dr. Juan Ángel Recio Conde Dra. Maria Neus Carbó Carbó Rosaura Esteve Puig Director Tutora Doctoranda
  5. 5. V
  6. 6. VI
  7. 7. VII
  8. 8. VIII «...que tot està per fer i tot és possible...» Ara mateix L'àmbit de tots els àmbits (1981) Miquel Martí i Pol
  9. 9. IX
  10. 10. X A tots els qui estan aquí dins
  11. 11. 1
  12. 12. 2
  13. 13. 3
  14. 14. 4 CONTENIDO ÍNDICE 6 ABREVIATURAS 15 INTRODUCCIÓN 23 OBJETIVOS 59 RESULTADOS 63 DISCUSIÓN 111 CONCLUSIONES 125 MATERIALES Y MÉTODOS 129 BIBLIOGRAFÍA 151 ANEXO 173
  15. 15. 5
  16. 16. 6 ÍNDICE 6 Índice de figuras 10 Índice de tablas 14 ABREVIATURAS 15 Símbolos 22 INTRODUCCIÓN 23 CÁNCER 26 MELANOMA 28 Generalidades del melanoma 28 Aspectos clínicos 29 Biología del melanocito 29 Factores genéticos y medioambientales asociados a la adquisición del melanoma 30 Progresión del melanoma cutáneo 31 Alteraciones genéticas y vías de señalización claves en el melanoma maligno 33 MC1R 34 CdkN2A (p16INK4a y p14ARF ) 34 PTEN 35 RAS 35 BRAF 35 LKB1/STK11 36 MITF 36 Vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK 37 Vía de señalización PI3K/AKT/PKB 37 Otras vías de señalización 40 Tratamiento del melanoma 40 Dianas terapéuticas 41 BRAF 44 Generalidades del gen BRAF 44 BRAF mutante en tumores malignos y benignos 45 BRAF y melanoma 45 Senescencia y BRAF 46 Vía de señalización RAF/MEK/ERK como señalización de supervivencia tumoral 46
  17. 17. 7 LKB1/STK11 48 Generalidades del gen LKB1/STK11 48 Complejo LKB1:STRAD:MO25 49 LKB1 como multicinasa 50 LKB1 como supresor tumoral 51 Modificaciones postraduccionales de LKB1 52 Funciones de LKB1 53 Sensor del metabolismo energético 53 Control de la polarización celular 54 Control del ciclo celular 55 MODELOS DE MELANOMA MURINOS 55 OBJETIVOS 59 RESULTADOS 63 Identificación de fosfoproteínas implicadas en la señalización del Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) mediante el análisis proteómico DIGE y MALDI TOF/TOF 66 El HGF induce la fosforilación de LKB1S428 de manera dependiente de la vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK/p90RSK 69 LKB1S428 se fosforila en respuesta a diferentes factores de crecimiento y se encuentra constitutivamente fosforilada en líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E y en muestras tumorales 74 Las células de melanoma mutantes en BRAFV600E tienen alterada la respuesta a estrés metabólico 79 El tratamiento con factores de crecimiento induce el desacoplamiento del complejo LKB1-AMPKα 84 El efecto oncogénico de BRAFV600E induce el desacoplamiento del complejo LKB1- AMPKα 90 La reconstitución de la vía LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 por la inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E en condiciones de estrés energético induce apoptosis 93
  18. 18. 8 La apoptosis inducida por estrés metabólico tras la inactivación del oncogén BRAFV600E está mediada por miembros de la subfamilia BH3 98 La inhibición de la vía de RAS/MEK/ERK bajo estrés energético restaura la respuesta a estrés energético en células de melanoma mutantes en NRASQ61R 99 Agonistas de AMPK como posibles terapias en cáncer 102 El tratamiento con metformin/phenformin tras la inhibición del efecto oncogénico de RAS restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e induce apoptosis 102 El tratamiento con metformin/phenformin tras la inhibición del efecto oncogénico de RAS restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e induce apoptosis en células de melanoma mutantes en NRASQ61K u otras mutaciones derivadas de pacientes 106 DISCUSIÓN 111 CONCLUSIONES 125 MATERIALES Y MÉTODOS 129 Plásmidos 132 Generación de plásmidos 132 Diseño de los cebadores 132 Amplificación del gen de interés 133 Purificación del producto de la PCR y de la digestión enzimática 134 Defosforilación 134 Ligación 134 Transformación bacteriana 135 Maxipreps 135 Secuenciación del gen de interés clonado en el vector correspondiente 136 Generación de plásmidos mutantes 136 Generación de los plásmidos shRNA 137 Cultivos celulares 138 Líneas celulares 138
  19. 19. 9 Congelación 139 Tripsinización 139 Muestras tumorales 140 Reactivos y anticuerpos 140 Inhibidores, factores de crecimiento y fármacos 140 Anticuerpos para western blot 141 Anticuerpos para inmunoprecipitación 142 Transfección, infección retroviral y lentiviral 142 Transfección transitoria de plásmidos 142 Transfección transitoria de siRNA 143 Infección retroviral 143 Infección lentiviral 143 Purificación de fosfoproteínas 144 Análisis proteómico: DIGE y MALDI TOF/TOF 145 Inmunoprecipitación y Western Blot 146 Inmunoprecipitación 146 Western Blot 147 Ensayo de viabilidad celular y apoptosis 148 Ensayo de formación de colonias 149 Análisis de imagen 150 BIBLIOGRAFÍA 151 ANEXO 173 Figuras Anexo 176 Tablas Anexo 181 Publicación 194
  20. 20. 10 Figura 1I/ Linaje de las divisiones celulares mitóticas desde el huevo fertilizado hasta la célula sencilla tumoral mostrando las mutaciones somáticas que se adquieren a lo largo del tiempo en la célula tumoral y de los procesos medioambientales que contribuyen en ésta 27 Figura 2I/ Progresión de la transformación del melanocito 32 Figura 3I/ Vías de señalización diana en melanoma 39 Figura 4I/ Representación esquemática de la estructura primaria de LKB1, de la organización de las secuencias codificantes del gen y de sus dominios funcionales, y de los lugares de modificación postraduccional de la proteína LKB1 de Mus musculus 49 Figura 5I/ Representación gráfica de una parte del dendograma del cinoma humano 50 Figura 1R/ Validación de los candidatos identificados por MALDI TOF/TOF implicados en la señalización del HGF/c-Met 68 Figura 2R/ El HGF induce la fosforilación de LKB1S428 de manera dependiente de la vía de señalización de RAS/MEK/ERK e independientemente de la línea celular 70 Figura 3R/ El perfil de fosforilación LKB1S428 en respuesta al HGF a lo largo del tiempo correlaciona con el perfil de fosforilación de p90RSK (T359/S363) y de ERK1/2T202/Y204 71 Figura 4R/ La inhibición total de MEK1/2 suprime los niveles de fosforilación de ERK1/2, de p90RSK y de LKB1 71 Figura 5R/ La defosforilación del residuo Ser431 de Lkb1 está mediada por fosfatasas de residuos Ser/Thr 72 Figura 6R/ La inhibición total de p90RSK suprime parcialmente los niveles de fosforilación de Lkb1S431 73
  21. 21. 11 Figura 7R/ El residuo Ser431 murino/Ser428 humano de LKB1 se fosforila en respuesta a distintos factores de crecimiento 74 Figura 8R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E muestran una fosforilación constitutiva de la Ser428 de LKB1 75 Figura 9R/ Correlación positiva entre los niveles de fosforilación de LKB1 y de ERK1/2 en muestras tumorales murinas 76 Figura 10R/ Los tumores de mama HER-2 positivos presentan elevados niveles de fosforilación de la Ser428 de LKB1 respecto los tumores HER-2 negativos 77 Figura 11R/ Las muestras tumorales de carcinoma endometrial respecto las muestras normales del paciente presentan elevados niveles de fosforilación de la Ser428 de LKB1 78 Figura 12R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E presentan una mínima respuesta a estrés energético, y la anulación del efecto oncogénico de BRAF mediante el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) recupera la respuesta a estrés energético 80 Figura 13R/ La inhibición del efecto oncogénico de BRAF en las líneas celulares de melanoma BRAFV600E aumenta la respuesta a estrés energético por AICAR 81 Figura 14R/ La inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E mediante el tratamiento con sorafenib o el silenciamiento génico de BRAF restaura la vía de estrés energético en las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E 82 Figura 15R/ La inhibición de p90RSK en las líneas celulares de melanoma BRAFV600E no restaura la vía de estrés energético 84 Figura 16R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPK 86 Figura 17R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPKα independientemente de la actividad catalítica de LKB1 y dependientemente de la integridad del residuo Ser428 de LKB1 88 Figura 18R/ AMPKα se une directamente o indirectamente al dominio C-terminal de LKB1 89
  22. 22. 12 Figura 19R/ La inhibición de la señalización de BRAFV600E reasocia los complejos de LKB1-AMPKα en respuesta a estrés energético 91 Figura 20R/ El efecto oncogénico de BRAFV600E induce la disociación del complejo LKB1-AMPKα 92 Figura 21R/ La restauración de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en las células de melanoma BRAFV600E por la inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E induce apoptosis en condiciones de estrés energético 94 Figura 22R/ Las células de melanoma BRAFV600E se sensibilizan a estrés energético a partir de las 4 horas de tratamiento por inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E presentando un mecanismo apoptótico independiente de p53 96 Figura 23R/ AMPK (AMPKα1 y AMPKα2) se encuentra implicado en la restauración de la vía de estrés energético y en la activación de la apoptosis bajo estrés energético 97 Figura 24R/ Miembros de la subfamilia BH3 median la apoptosis inducida por la inactivación del efecto oncogénico de BRAFV600E bajo estrés metabólico 98 Figura 25R/ La inhibición del efecto oncogénico de NRASQ61R permite la restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 100 Figura 26R/ La sensibilización a la apoptosis en células de melanoma mutantes en NRASQ61R está mediada por la restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 101 Figura 27R/ Restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en respuesta a metformina e inhibición de la vía de RAS 103 Figura 28R/ Citotoxicidad en las líneas celulares de melanoma humanas BRAFV600E y NRASQ61R en respuesta a metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS 105 Figura 29R/ Restauración de la vía de estrés energético en células de melanoma NRASQ61K/WT derivadas de pacientes mediante el tratamiento que combina la metformina/phenformin junto la inhibición de la vía de RAS 107
  23. 23. 13 Figura 30R/ Restauración de la vía de estrés energético en las líneas celulares de melanoma NRASQ61K derivadas de pacientes en respuesta a metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS 108 Figura 1D/ Modelo de restauración del metabolismo «normal» en melanoma. Restauración de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 por la inhibición de la vía de RAS en condiciones de estrés energético induce apoptosis 115 Figura 2D/ Modelo de la señalización oncogénica de BRAFV600E , NRASQ61R , u otras alteraciones en la actividad de los receptores tirosina cinasa en cáncer 118 Figura 3D/ Modelo de regulación negativa de la actividad de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 mediado por la señalización oncogénica de BRAFV600E o NRASQ61R 120 Figura 1A/ Esquema del procedimiento experimental de purificación de fosfoproteínas y del análisis proteómico; e imagen del gel DIGE de los complejos de fosfoproteínas purificados en respuesta al Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) 176 Figura 2A/ Listado de parte de los candidatos identificados implicados en la señalización del HGF/c-Met por espectometría de masas (MALDI TOF/TOF) 177 Figura 3A/ El inhibidor de MEK1/2 U0126 no tiene efecto sobre la activación de AMPKα a las concentraciones de 1µM hasta 10µM 178 Figura 4A/ Las líneas celulares de melanoma murinas y humanas silenciadas de manera estable para LKB1 muestran que tan sólo una pequeña población de LKB1 se modifica en respuesta al HGF 179
  24. 24. 14 Tabla 1I/ Alteraciones genéticas en melanoma maligno 33 Tabla 1A/ Modelos murinos de melanoma 181 Tabla 2A/ Secuencias de los oligonucleótidos o cebadores utilizados para el clonaje y para la mutagénesis dirigida 183 Tabla 3A/ Características de los vectores plasmídicos generados 184 Tabla 4A/ Líneas celulares y sus características 186 Tabla 5A/ Anticuerpos específicos para WB e inmunoprecipitación (IP) 189
  25. 25. 15
  26. 26. 16
  27. 27. 17
  28. 28. 18 A ADN Ácido Desoxiribonucleico AKT3 Oncogén viral del timoma murino AKT homólogo 3 (proteína cinasa B, gamma), del inglés v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3 (protein kinase B, gamma) AMP Adenosina monofosfato, del inglés adenosine monophosphate AMPc Monofosfato de Adenosina Cíclico, del inglés cyclic Adenosine 3’-5’-Monophosphate o cAMP AMPK Proteína Cinasa Activada por 5’-AMP, siglas del inglés 5’-AMP activated Protein Kinase ARN Ácido Ribonucleico ARNm Ácido Ribonucleico mensajero, del inglés messenger ribonucleic acid (mRNA) ATM Del inglés Ataxia-Telangiectasia-Mutated ATP Trifosfato de Adenosina, del inglés Adenosine Triphosphate B BCL-2 Del inglés B-Cell Leukaemia/lymphoma 2 BRAF Oncogén viral de sarcoma murino, del inglés v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 BRG1 Del inglés Brahma/SWI2-Related Gene 1 BSA Albúmina Sérica Bovina, del inglés Bovine Serum Albumin C CDK Cinasa Dependiente de Ciclina, del inglés Cyclin Dependent protein Kinases CdkN2A Inhibidor de Cinasas Dependiente de Ciclina, del inglés Cyclin- Dependent Kinase inhibitor 2A CDS Secuencia codificante, del inglés coding sequence CREB Elemento de respuesta de unión a AMPc, del inglés cAMP- Responsive Element Binding D/E DIGE Electroferesis Bidimensional Diferencial Cuantitativa en Gel con tinción Fluorescente, del inglés Fluorescence 2-D Difference In Gel Electrophoresis DMEM Del inglés Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium DMSO Del inglés Dimethyl sulfoxide EGF Factor de Crecimiento Epidérmico, del inglés Epidermal Growth Factor
  29. 29. 19 EGFP Proteína de Fluorescencia Destacadamente Verde, del inglés Enhanced Green Fluorescent Protein ERK Cinasa Regulada por señales Extracelulares, del inglés Extracellular-signal Regulated Kinase F FACS Del inglés Fluorescence Activated Cell Sorting FBS Suero Fetal Bovino, del inglés Fetal Bovine Serum FGF Factor de Crecimiento de Fibroblastos, del inglés Fibroblast Growth Factor FITC Isotiocianato Fluorescente, del inglés Fluorescein Isothiocyanate Forskolin Forskolin es un extracto que proviene del Coleus forskohlii, 7β-Acetoxy-8,13-epoxy-1α,6β,9α-trihydroxylabd-14-en-11-one G GFP Proteína Verde Fluorescente, del inglés Green Fluorescent Protein GP Genes virales gag (matriz, cápside y nucleocápside), y pol (integrasa y transcriptasa reversa) GPCR Receptor con 7 dominios transmembrana Acoplado a la Proteína G, del inglés G Protein Coupled Receptor GST Del inglés Glutathione-S-Transferase H HER-2 Receptor de tipo 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano, del inglés Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 HGF Factor de Crecimiento de Hepatocitos, del inglés Hepatocyte Growth Factor HIF1α Del inglés Hypoxia Inducile Factor 1 alpha Hsp90 Del inglés Heat-shock protein 90 I/J/K/L IFN-α Interferón alpha, del inglés Interferon-α IGF-1 Factor de Crecimiento similar a la Insulina de tipo 1, del inglés Insulin like Growth Factor IP Inmunoprecipitación KD Inactividad catalítica de la cinasa, del inglés kinase dead LKB1 Del inglés Liver Kinase B1 o Serine/threonine kinase 11 (Stk11)
  30. 30. 20 M/N MAPK Del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase MC1R Receptor de la Melanocortina de tipo 1, del inglés Melanocortin Type 1 Receptor Metformin 1,1-Dimethylbiguanide hydrochloride, fármaco antidiabético MITF Factor de transcripción asociado a la microftalmia, del inglés Microphtalmia-associated Transcription Factor MO25 Del inglés Mouse protein 25 MSH-α Hormona Estimulante del Melanocito de tipo alpha, del inglés Melanocyte Stimulating Hormone-alpha mTOR Del inglés mammalian Target Of Rapamycin NRAS Oncogén viral RAS de neuroblastoma, del inglés neuroblastoma RAS viral oncogene homolog NSCLC Del inglés Non-Small Cell Lung Carcinoma O/P/Q OA Del inglés okadaic acid, aislado en Halichondria okadai OIS Oncogén inductor de senescencia, del inglés Oncogene-Induced cellular Senescence PBS Tampón Salino, del inglés Phosphate Buffered Saline PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa, del inglés Polymerase Chain Reaction PDGF Factor de Crecimiento que Deriva de Plaquetas, del inglés Platelet Derived Growth Factor PDGFRβ Receptor-β del Factor de Crecimiento que Deriva de Plaquetas, del inglés Platelet Derived Growth Factor Receptor-β PJS Del inglés Peutz-Jeghers Syndrome PKA Del inglés Protein Kinase A pRb Proteína del Retinoblastoma, del inglés Retinoblastoma protein PTEN Fosfatasa lipídica PTEN, del inglés Phosphatase and Tensin homolog PVDF Fluoruro de Polivinilideno, del inglés polyvinyledene fluoride R/S RAF Del inglés v-raf murine sarcoma viral oncogene RGP Fase de Crecimiento Radial, del inglés Radial-Growth Phase RHEB Del inglés Ras Homologue Enriched in Brain RTK Receptor Tirosina Cinasa, del inglés Receptor Tyrosine Kinase S Fase de síntesis del ciclo celular SCF Factor de Célula Madre, del inglés Stem-Cell Factor
  31. 31. 21 SDS-PAGE Electroforesis en gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato, del inglés Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Ser Serina, del inglés serine shRNA Del inglés small hairpin ribonucleic acid siRNA Del inglés small interfering ribonucleic acid (RNA) STK11 Cinasa 11 de residuos serina y treonina, del inglés Serine/Threonine Kinase 11 o LKB1 STRAD Del inglés STE20-Related Adaptor T TB Del inglés Terrific Broth TBS Del inglés Tris Buffered Saline TBST TBS-0,1%Tween TERT Transcriptasa Reversa de la Telomerasa, del inglés Telomerase Reverse Transcriptase Thr Treonina, del inglés Threonine Tm Temperatura de fusión, del inglés melting Temperature TNFα Factor alpha de Necrosis Tumoral, del inglés Tumor Necrosis Factor-alpha TPA Promotor Tumoral de Éster-Forbol, del inglés Phorbol-ester Tumor Promoter TPM1 Tropomiosina de tipo 1 Tyr Tirosina, del inglés Tyrosine TYR Tirosinasa U/V UV Ultravioleta, del inglés Ultraviolet VEGF Del inglés Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR-2 Del inglés Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 VGP Fase de Crecimiento Vertical, del inglés Vertical-Growth Phase W/X/Y/Z WB Del inglés Western Blot wt Tipo Salvaje, del inglés wild type
  32. 32. 22 A Alanina AA Aminoácido D Ácido aspártico Da Dalton E Ácido glutámico ºC Grados Celsius h Hora K Lisina kb Kilobase KDa Kilo Dalton µg Microgramo min Minuto µl Microlitro ml Mililitro µM Micro Molar M Molar ng Nanogramo nm Nanómetro pb Pares de bases nucletotídicas % Porcentaje o tanto por ciento Q Glutamina R Arginina rcf o g Fuerza de centrífuga relativa, del inglés Relative Centrifugal Force or g-force rpm Revoluciones por minuto S Serina T Treonina U Unidad/unidades V Valina V Volt Algunas de las siglas y abreviaturas se describen en su lengua de origen, el inglés, y figuran con la tipología en cursiva, por no tener una clara traducción a la lengua castellana, o ser ésta poco empleada.
  33. 33. 23
  34. 34. 24
  35. 35. 25
  36. 36. 26 CÁNCER El cáncer es una enfermedad biológica y clínicamente compleja que engloba a más de 100 enfermedades distintas con diversos factores de riesgo. Responsable de una de cada ocho muertes en todo el mundo1 y de una de cada cinco en Estados Unidos2 . Los diferentes tipos de cáncer comparten una patogénesis común, representando cada uno de ellos el resultado de un proceso de evolución Darwiniano. Así, inspirado en la teoría evolutiva, los primeros pasos del desarrollo neoplásico tumoral son debido a un proceso de selección natural. De modo que la inestabilidad genómica produce poblaciones celulares genéticamente distintas, generándose así, clones agresivos emergentes con distintos grados de metástasis como restultado final del proceso evolutivo3,4 . De manera genérica, la tumorogenésis implica múltiples pasos limitados al mismo linaje celular, que tiene como resultado la conversión de una célula normal en una tumoral. Esta conversión se basa en dos procesos, la adquisición continua de alteraciones genéticas y la selección natural que actúa sobre la diversidad fenotípica resultante (Figura 1I (Introducción)). En muchos cánceres, la regulación de las moléculas implicadas en la señalización celular se encuentra alterada, afectando a otras proteínas y a distintos procesos biológicos celulares. De este modo, la mayor parte de los tumores adquieren un conjunto de mutaciones ventajosas que son reflejo de los efectos de los mutágenos internos de la propia célula, y de los mutágenos externos a la célula. Consideramos mutágenos internos los defectos en la reparación del ADN que contribuyen en incrementar la carga mutacional5 , y mutágenos externos los factores medioambientales que participan activamente en el aumento del riesgo de cáncer. Consecuentemente, estos efectos en el genoma de la célula normal provocan transformaciones en la célula tumoral maligna que permiten una proliferación celular autónoma no restrictiva, fase conocida como expansión clonal que puede desencadenar una fase de invasión tumoral fuera de los límites del tejido normal, hasta llegar a una fase metastática a órganos distantes. Además, en el genoma de la célula tumoral se han descrito mutaciones que se seleccionan durante el inicio de los procesos terapéuticos, confiriendo una resistencia al tratamiento (Fig.1I). También indicar que el ambiente tumoral crea unas condiciones de estrés, como son los bajos niveles de oxígeno y de nutrientes, y los elevados niveles de productos residuales tóxicos que proceden del metabolismo celular tumoral, donde las
  37. 37. 27 células tumorales se adaptan para sobrevivir, se transforman en un fenotipo tumoral resistente a la muerte celular, e incluso prometastático. Figura 1I/ Linaje de las divisiones celulares mitóticas desde el huevo fertilizado hasta la célula sencilla tumoral mostrando las mutaciones somáticas que se adquieren a lo largo del tiempo en la célula tumoral y de los procesos medioambientales que contribuyen en ésta6 . Las mutaciones pueden ser adquiridas mientras el linaje celular es fenotípicamente normal, reflejo de las mutaciones intrínsicas adquiridas y de los efectos de los mutágenos exógenos durante la división celular normal. Así, el ADN de las células normales se encuentra continuamente dañado por los mutágenos de origen interno y externo, pero la mayor parte de este daño se repara. En contra, durante el desarrollo del cáncer los defectos en la reparación del daño al ADN pueden contribuir en la carga mutacional de la célula tumoral5 . En azul mutaciones intrínsecas, en naranja mutaciones por exposición a mutágenos externos medioambientales, en rojo mutaciones dirigidas, en gris mutaciones que confieren resistencia a la quimioterapia. En la tumorogénesis, el genoma de la célula tumoral maligna adquiere seis alteraciones esenciales como son la autosuficiencia a las señales de crecimiento, la insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento, la evasión del programa de muerte celular, la adquisición del potencial de replicación ilimitado, la sostenida angiogénesis, la invasión a tejidos y la metástasis7 . Además, se ha añadido una séptima alteración esencial en el genoma de la célula tumoral8 , la adquisición de un metabolismo aberrante, descrita por Otto Warburg en 19569 y revisada recientemente, donde se sugiere que puede ser clave en el tratamiento del cáncer. Según Warburg, las células tumorales pueden obtener la misma cantidad de energía de la fermentación como de la respiración9 , utilizando una cantidad muy elevada de glucosa. Así, las células tumorales utilizan diez veces más de glucosa respecto las células normales, metabolizándola principalmente a lactato bajo condiciones normales de
  38. 38. 28 oxígeno, proceso denominado glucólisis aeróbica, ya que «fermentan» en presencia de oxígeno. No obstante, en células normales la fermentación o glucólisis es un proceso bioenergético ineficiente comparado con la respiración o fosforilación oxidativa mitocondrial. Así, la glucólisis aeróbica es un fenómeno característico de las células tumorales, necesario para sostener el elevado índice de proliferación, y asegurar el crecimiento y la división celular, procesos que requieren una fuente extra energética y nutricional. De este modo, la alteración del metabolismo celular de la célula tumoral junto a las seis alteraciones descritas previamente, permiten retratar de manera más completa el fenotipo transformante maligno. De manera que algunas de las nuevas aproximaciones terapéuticas actuales en cáncer son terapias que consisten en dianas implicadas en la transformación metabólica tumoral, que en la actualidad se están investigando en ensayos preclínicos y clínicos10 . Otra subclase de alteraciones en cáncer son las mutaciones que confieren a algunos tumores resistencia a la radioterapia y quimioterapia, alteraciones que se pueden atribuir al metabolismo aberrante. De este modo, la reactivación del metabolismo «normal» en el tumor podría resensibilizar a las células tumorales, provocando un estado de quiescencia, y ser finalmente más favorable a otras intervenciones. MELANOMA Generalidades del melanoma El melanoma cutáneo es uno de los cánceres de piel menos frecuente, y representa el más letal. Su incidencia ha aumentado en la población occidental hasta triplicarse el número de casos en los últimos 30 años11,12 , siendo la sexta causa de malignidad más frecuente en humanos11 . Como ocurre en muchos cánceres, en el melanoma cutáneo existe una predisposición genética y un riesgo asociado a ciertos agentes medioambientales. De esta manera, el aumento de la incidencia del melanoma cutáneo, y la elevada letalidad asociada a su progresión, ha motivado grandes esfuerzos para definir los factores genéticos y medioambientales que conducen a la génesis y a la progresión del melanoma. El melanoma junto con el carcinoma de células basales y el carcinoma de células escamosas comprenden los distintos tipos de cáncer de piel. Respecto a su etiología en relación a los factores medioambientales, estudios epidemiológicos revelan que el carcinoma de células escamosas y el de células basales se encuentran asociados a la acumulación del daño al ADN mediado por
  39. 39. 29 la radiación ultravioleta (UV) a lo largo de la vida, mientras que el melanoma cutáneo se encuentra fuertemente asociado a exposiciones de radiación UV intensas e intermitentes. En función del tipo de exposición a la radiación UV y su distribución anatómica, el melanoma cutáneo se clasifica en diferentes tipos, como son el melanoma de extensión superficial, el melanoma nodular, el melanoma lentiginoso, el melanoma lentiginoso maligno, el melanoma mucoso acral, el melanoma lentiginoso acral, y otros subtipos menos comunes como el nevus celular maligno azul, el melanoma desmoplásico, y el melanoma nevoide. Aspectos clínicos Los signos clínicos clásicos del melanoma son la asimetría, la irregularidad del perímetro, el color, el diámetro, la elevación, el sangrado y el índice mitótico13 , signo añadido recientemente. Un examen regular de los signos clínicos clásicos del melanoma permite el diagnóstico del melanoma en una fase precoz, que junto una resección quirúrgica del melanoma hacen que el tratamiento sea eficaz en un 80 % de los casos. Sin embargo, la deficiencia de un examen regular de los signos clínicos del melanoma aumenta las probabilidades que el primer diagnóstico de un melanoma maligno cutáneo corresponda a un melanoma de fase avanzada. Desgraciadamente, la inexistencia de terapias eficaces en el melanoma de fase avanzada conduce a un mal pronóstico, con un índice de supervivencia de 6 meses; donde solamente un 5 % de estos casos muestran un índice de supervivencia de 5 años14 . Estos datos indican el requerimiento urgente de nuevas estrategias terapéuticas efectivas para el melanoma. Biología del melanocito El melanoma cutáneo proviene de los melanocitos cutáneos, células pigmentadas especializadas en la producción del principal pigmento responsable de la coloración de la piel, denominado melanina. Los melanocitos cutáneos derivan de la cresta neural y migran hasta la piel durante el desarrollo embrionario, y éstos finalmente residen en los folículos pilosos y en la lámina basal de la epidermis, donde se encuentran como células individualizadas intercaladas entre los queratinocitos basales, existiendo una homeostasis regulada por los queratinocitos15 . En respuesta a la radiación UV, los queratinocitos secretan factores que regulan la supervivencia, la diferenciación, la proliferación y la motilidad del melanocito. Y además, estimulan la producción de melanina en los melanocitos que tiene como resultado el bronceado de la piel. Concretamente, en respuesta a la radiación UV los queratinocitos secretan la hormona
  40. 40. 30 estimulante del melanocito (MSH-α) que activa a la enzima adenilil ciclasa (AC) a través de la vía de la activación del receptor de la melanocortina de tipo 1 (MC1R) del melanocito, donde la vía MC1R es la vía de señalización reguladora más importante de pigmentación. La activación del MC1R por MSH-α promueve el aumento intracelular del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), que tiene como resultado la activación transcripcional de múltiples genes diana, como el factor de transcripción de la microftalmia (MITF), de la tirosinasa (TYR) y de otras enzimas necesarias para la síntesis de melanina16 . Así, los melanocitos tienen una función protectora clave en la piel frente al daño al ADN por efecto de la radiación UV. En la biología del melanocito, el AMPc juega un papel muy importante en la proliferación y en la diferenciación, donde el AMPc activa la vía de ERK de manera dependiente de RAS y de BRAF17,18 . La señalización por AMPc promueve la fosforilación de CRAF, la incapacidad de unión a RAS, y finalmente su inactividad19,17 . Por este motivo, los melanocitos utilizan BRAF como efector principal de RAS, y de manera semejante, los melanocitos malignos presentan predominantemente mutaciones en BRAF y no en CRAF. Factores genéticos y medioambientales asociados a la adquisición del melanoma En el melanoma, como en la mayoría de cánceres, los factores de riesgo incluyen componentes genéticos y medioambientales. El melanoma es un tumor heterogéneo y con una elevada complejidad genética que incluye lesiones genéticas como la pérdida de supresores tumorales y/o la activación de oncogenes. Además, existen elementos genéticos adicionales que dirigen el proceso de melanomagénesis. El melanoma se encuentra asociado a la radiación solar, uno de los agentes carcinogénicos esencial para el desarrollo de lesiones premalignas en la piel. Por consiguiente, la exposición a la radiación solar se encuentra fuertemente implicada en la etiología del melanoma maligno cutáneo, siendo el máximo responsable la porción de radiación UV que proviene del espectro solar. La radiación solar está compuesta por radiación visible, infrarroja y UV, entre otras. Existen tres tipos de radiación UV, radiación UV de tipo A (UV-A, 400-320nm), UV-B (320-290nm) y UV-C (290-200nm), donde únicamente las radiaciones de tipo UV-A y UV-B alcanzan la superficie terrestre. La radiación UV-A y UV-B ejercen muchos tipos de efectos sobre la piel, incluyendo el bronceado, la carcinogénesis, la inmunomodulación y la producción de vitamina D. El aumento de la incidencia de melanoma se ha asociado epidemiológicamente con la disminución del grosor de la capa de ozono estratosférica durante estos últimos 30 años20,21 , ya que la reducción de la capa de ozono ocasiona un
  41. 41. 31 aumento de la radiación UV-A y UV-B en la superfície terrestre22 , causando efectos mutagénicos y carcinogénicos sobre la piel23 . Así, la mayor exposición y el aumento de la intensidad en la superficie terrestre de la radiación UV inducirían un mayor daño al ADN de los melanocitos, y facilitarían potencialmente la melanomagénesis. En este sentido, estudios epidemiológicos indican que una elevada e intensa exposición a la radiación UV, particularmente en neonatos, puede tener como consecuencia un aumento de la formación de melanomas cutáneos malignos24,25 . En cambio la exposición acumulativa y crónica a la radiación UV a lo largo de la vida se puede encontrar asociada al desarrollo de otras formas de cáncer de piel, como son los carcinomas de células escamosas. Progresión del melanoma cutáneo El melanoma cutáneo se encuentra fuertemente asociado a mutaciones críticas en los genes reguladores del crecimiento, como los onocogenes BRAF y NRAS, y en los genes reguladores del ciclo celular, como el gen CdkN2A que codifica dos supresores tumorales p16INK4a y p14ARF . También se encuentra asociado a la producción autocrina de los factores de crecimiento, como son el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor de crecimiento que deriva de plaquetas de tipo A (PDGF-A) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF); a la pérdida de los receptores de adhesión que contribuyen en la disrupción de la señalización intracelular de los melanocitos, como la molécula de adhesión celular en melanoma (MCAM) y E-cadherina; y en la capacidad del melanocito a escapar de la regulación fisiológica que existe por parte de los queratinocitos26 . Por lo tanto, la adquisición de las mutaciones críticas citadas anteriormente en los melanocitos normales son responsables del desarrollo y progresión del melanoma. Así, existe un modelo de desarrollo y progresión del melanoma cutáneo globalmente admitido. En una primera fase, los melanocitos pueden proliferar y extenderse provocando la formación de un nevus (Fig.2I). Esta proliferación en los melanocitos puede ser restrictiva en la epidermis, dando lugar al nevus de adhesión epidérmico; en la dermis, formando el nevus dérmico; o en ambos compartimientos, sucediendo el nevus compuesto. Los nevus son generalmente benignos pero pueden progresar a la fase de crecimiento radial del melanoma cutáneo (Radial Growth Phase, RGP), e incluso pueden dar lugar a una lesión intraepidérmica con una microinvasión local de la dermis. Las células de la fase RGP pueden progresar hasta llegar a la fase de crecimiento vertical (Vertical Growth Phase, VGP), siendo el estadio más peligroso debido al potencial metastático de las células. Así, entre otras características, las células en VGP presentan una pérdida de expresión de E-cadherina, y un
  42. 42. 32 aumento de expresión de N-cadherina, características que confieren la capacidad de invadir la dermis, e incluso pudiendo conferir la capacidad de infiltrarse al sistema vascular y linfático (Fig.2I). No obstante, no todos los melanomas cutáneos pasan por cada una de estas fases, ya que un 50 % de los melanomas cutáneos no provienen de la progresión maligna del nevus. Figura 2I/ Progresión de la transformación del melanocito (A) Piel normal. Con una distribución de los melanocitos dendríticos en la lámina basal de la epidermis. (B) Nevus. Como primer estadio del melanoma, el nevus melanocítico benigno presenta un aumento del número de melanocitos dendríticos. (C) Fase de crecimiento radial (RGP) del melanoma. Se considera como la primera fase del melanoma maligno con la migración de los melanocitos a la epidermis, formando nidos de melanocitos que no pueden penetrar la membrana basal epidérmica. (D) Fase de crecimiento vertical (VGP) del melanoma maligno.
  43. 43. 33 Fase con un elevado potencial maligno y metastático, debido a la invasión de los melanocitos en la dermis y a la capacidad de infiltración de los melanocitos al sistema vascular linfático. Alteraciones genéticas y vías de señalización claves en el melanoma maligno El melanoma es una enfermedad genéticamente compleja. Las alteraciones genéticas más frecuentes en melanoma son los polimorfismos en el gen receptor de la melanocortina de tipo 1 (MC1R)27,28,29,30 ; las mutaciones en los oncogenes como el oncogén viral del sarcoma murino RAF homólogo B1 (BRAF)31 y el oncogén viral RAS de neuroblastoma (NRAS)31,32 ; la sobreexpresión del oncogén viral del timoma murino AKT homólogo 3 (AKT3)33 ; las deleciones de los supresores tumorales como el inhibidor de cinasas dependiente de ciclinas 2A (CdkN2A)34 , la fosfatasa lipídica PTEN33,35 , el APAF-136 , el p5337 y el LKB138 ; y además, la amplificación de otros genes como la ciclina D139 y el factor de transcripción asociado a la microftalmia (MITF)40 (Tabla 1I (Introducción)). Tabla 1I/ Alteraciones genéticas en melanoma maligno Tipos de genes Gen Frecuencia (%)/ alteración en melanoma Referencias Oncogenes BRAF 50-70 % /mutado 31 NRAS 15-30 % /mutado 31,32 AKT3 Sobreexpresado 33 Supresores tumorales CDKN2A 30-70 % /delecionado, mutado o silenciado 34 PTEN 5-20 % /delecionado o mutado 33,35 APAF-1 40 %/ silenciado 36 p53 10 % /pérdida o mutado 37 Stk11 (LKB1) 10 % /mutado 38 Otros Ciclina D1 6-44 % /amplificado 39 MC1R polimorfismos 27,28,29,30 MITF 10-16 % /amplificado 40 El resultado de numerosas investigaciones en los últimos años, indican que la vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK y la vía de señalización PI3K/AKT son las vías de señalización más importantes en el desarrollo y mantenimiento del melanoma. Estas vías de señalización son reguladoras claves en la proliferación del melanoma. De este modo, la vía de RAS/RAF/MEK/ERK se encuentra hiperactivada en un 90 % de los melanomas humanos presentando mutaciones en el oncogén BRAF con un 50-70 %, o en NRAS con un 15-30 %, y la vía de PI3K/AKT se encuentra hiperactivada por la pérdida del supresor tumoral PTEN con un 5-20 % (Tabla 1I). Sorprendentemente, una única mutación en estas vías de señalización no es suficiente para promover el desarrollo
  44. 44. 34 del melanoma, pero la combinación de mutaciones en ambas vías de señalización promueve la melanomagénesis32,17,41 . Además, destacar que el factor de transcripción asociado a la microftalmia (MITF), considerado por ser un regulador clave en la biología del melanocito, se encuentra amplificado con una frecuencia de un 16 % de los melanomas humanos40 . Receptor de la melanocortina de tipo 1 (MC1R) El riesgo de melanoma se modula por alteraciones en los patrones de pigmentación de la piel, debido a alteraciones genéticas que pueden tener una función en la formación del melanoma y por exposición a la radiación UV. Dentro de las alteraciones más comunes en los patrones de pigmentación de la piel se ecuentran los polimorfismos del MC1R y las amplificaciones en MITF. MC1R es un regulador clave en la diferenciación, proliferación y pigmentación del melanocito. MC1R es un receptor con 7 dominios transmembrana acoplado a la proteína G (GPCR) que se expresa en los melanocitos epidérmicos. MSH-α es el ligando del MC1R, responsable de estimular la formación de AMPc a través de la vía del MC1R. Concretamente, MSH-α se une al MC1R que estimula al AC, induciendo la producción de AMPc42 , y los altos niveles de AMPc fosforilan y activan a la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB). CREB activa transcripcionalmente a varios genes, incluyendo a MITF43,44 , que activa transcripcionalmente a un grupo de genes que catalizan la conversión de la tirosina (Tyr) en melanina45 . La región que codifica por el MC1R humano es altamente polimórfica, y se conocen tres variantes del MC1R, MC1R R151C, R160W y D294H asociadas al aumento del riesgo de melanoma debido a una sensibilidad a los efectos citotóxicos de la radiación UV, como es el aumento de la generación de los radicales de oxígeno27,28,29,30 . Adicionalmente, estudios epidemiológicos muestran una correlación entre la presencia de las variantes de MC1R, y de los genes CdkN2A y BRAF, comúnmente mutados en melanoma46,47,27,48 . CdkN2A (p16INK4a i p14ARF ) El locus CdkN2A se asocia fuertemente al desarrollo del melanoma. Los melanomas familiares presentan mutaciones germinales de CdkN2A con una frecuencia del 30-70 % 34 (Tabla 1I). El gen CdkN2A codifica dos supresores tumorales p16INK4a y p14ARF (49) . El supresor tumoral p16INK4a inhibe la actividad cinasa de la proteína cinasa dependiente de ciclina 4/6 (CDK4 y CDK6, respectivamente), uniéndose y secuestrando a CDK4 y CDK6, y previniendo así la fosforilación de la proteína del Retinoblastoma (pRb)50 que tiene como resultado la inhibición de la progresión del ciclo celular. El supresor tumoral p14ARF estabiliza a p53 mediante la
  45. 45. 35 inhibición de la degradación por HDM2, ligasa E3 de ubicuitinas específica para p5351,52,53,54 . En el melanoma familiar, el gen CdkN2A generalmente se encuentra mutado alterando únicamente al supresor tumoral p16INK4a , o ambos supresores tumorales p16INK4a y p14ARF . Además, este gen también se encuentra mutado en muchos melanomas esporádicos. La inactivación de p16INK4a por mutaciones puntuales, deleciones, metilación del promotor o por silenciamiento transcripcional promueve la liberación de CDK4 y CDK6 que se unen a ciclina D1 y a pRb, donde pRb fosforilada por CDK4 y CDK6 libera el factor de transcripción E2F promoviendo la transición de la fase G1 a la fase de síntesis (S) del ciclo celular (Fig.3I). Así, la vía de señalización p16INK4a /pRb es un regulador clave de la senescencia del melanocito, y en consecuencia, la inactivación de esta vía conduce a la progresión del ciclo celular contribuyendo en el proceso de melanomagénesis. PTEN La pérdida del supresor tumoral PTEN se detecta aproximadamente entre un 5-20 % de las lesiones melanocíticas33,35 (Tabla 1I). PTEN es una fosfatasa lipídica que inhibe la activación de AKT por PI3K (Fig.3I). El gen PTEN reside en la región del cromosoma 10q, una área cromosómica comúnmente delecionada en melanoma, siendo PTEN una de las dianas somáticas más alteradas de la vía de PI3K/AKT. La pérdida de PTEN conduce a la hiperactivación de la vía de PI3K afectando a procesos biológicos importantes como son la supervivencia celular, proliferación, crecimiento (como aumento de la masa celular) y motilidad. En el melanoma las deleciones en PTEN pueden ser concomitantes a mutaciones en BRAF, pero no con mutaciones en NRAS55 . RAS El oncogén RAS activa las vías de señalización RAF/MEK/ERK y PI3K/AKT, ambas vías son efectoras de RAS e importantes en el desarrollo del melanoma (Fig.3I). La activación mutacional del oncogén RAS se asocia entre un 15-30 % al melanoma humano (Tabla 1I), y además, destacar que las mutaciones en NRAS y BRAF son mutuamente excluyentes en el melanoma56 . Las mutaciones en el gen RAS se producen más frecuentemente en la isoforma NRAS. Concretamente, la mutación más predominante en NRAS es la sustitución de una glutamina (Q) por una leucina (L) en la posición 61 (NRASQ61L )31 . BRAF Las mutaciones somáticas en el gen BRAF prevalecen en el melanoma. BRAF es el principal componente más comúnmente mutado de la vía RAS/RAF/MEK/ERK, con una
  46. 46. 36 frecuencia entre el 50-70 % de los melanomas cutáneos (Tabla 1I). La mutación más observada en BRAF es la sustitución de la valina (V) por un ácido glutámico (E) en la posición 600 (BRAFV600E )31 . BRAFV600E activa constitutivamente la señalización de ERK, responsable de la estimulación de la proliferación y de la supervivencia, y esencialmente del crecimiento tumoral y del mantenimento de las funciones biológicas celulares57 (Fig.3I). Paradójicamente, el efecto oncogénico de BRAFV600E es insuficiente en melanocitos para la conversión plenamente maligna, ya que la expresión del mutante BRAFV600E en melanocitos normales promueve senescencia58,59 , y el modelo murino condicional para la expresión específica de BRAFV600E en melanonitos propuesto por Dankort y sus colaboradores desarrolla hiperplasias melanocíticas benignas41 . Por el contrario, la expresión de BRAFV600E combinada con el silenciamiento del supresor tumoral PTEN desarrola melanomas con una penetrancia del 100 %, y con metástasis observadas en nódulos linfáticos y pulmón41 . En función de las áreas expuestas a la radiación solar, existen claras diferencias genéticas entre los distintos tipos de melanoma. Concretamente, en los melanomas sin daño crónico inducido por la radiación solar poseen frecuentemente mutaciones en el gen BRAF asociadas a la pérdida de PTEN, o únicamente mutaciones en NRAS. Además, los melanomas que presentan mutaciones en BRAF tienen un número menor de copias del supresor tumoral PTEN respecto los melanomas con mutaciones en NRAS56 . Mientras que los melanomas con daño crónico inducido por la radiación solar tienen raramente mutaciones en el gen BRAF y frecuentemente muestran un aumento del número de copias de la ciclina D1. LKB1/Stk11 El gen LKB1 se localiza en el cromosoma 19p13.3. Codifica para una proteína con actividad serina/treonina (Ser/Thr) cinasa y además, es un supresor de tumores asociado al desarrollo de distintos tipos de cánceres humanos. Concretamente, en el melanoma maligno cutáneo esporádico se ha detectado mutaciones somáticas del gen LKB1/STK11 con una frecuencia del 10 %60,61,38 (Tabla 1I). En el melanoma primario y en el nevus melanocítico benigno, se encuentra con una baja frecuencia la pérdida de heterozigosidad del cromosoma 19p, sugiriendo que podría ser LKB1 un gen relevante en el desarrollo y progresión del melanoma maligno. Factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF) MITF tiene una función clave en el melanoma humano. Es uno de los genes más importantes para la pigmentación, el crecimiento y la supervivencia del melanocito, la transcripción de factores de diferenciación, y de numerosas
  47. 47. 37 enzimas de pigmentación 45 . MITF se expresa en muchos melanomas humanos, y es un gen diana y un marcador de diagnóstico para esta enfermedad. Existe una gran controversia acerca del mecanismo tumorigénico de MITF. Por un lado, en líneas celulares de melanoma los niveles de expresión de MITF son significativamente bajos, donde el aumento de los niveles de expresión de MITF reduce la proliferación celular del melanoma e incluso en presencia del oncogén BRAF62 . De este modo, estos niveles altos de expresión de MITF reducen la tumorigenicidad de la célula de melanoma63 , predisponiendo la parada del ciclo celular y la diferenciación a través del control de los reguladores del ciclo celular como son p16INK4a , CDK2 y p21Cip (45) . Por otro lado, y de manera crítica los bajos niveles de MITF también promueven apoptosis y parada del ciclo celular. Estudios recientes muestran que MITF coopera con BRAFV600E en la inmortalización de los melanocitos normales mediante la expresión de distintas proteínas, como la transcriptasa reversa de la telomerasa (TERT), el mutante dominante negativo de p53 (p53DD) o la proteína cinasa CDK4 activada40 . Así, se ha observando que entre un 10-16 % de los melanomas malignos mutados en BRAF presentan amplificaciones de MITF, y contrariamente, el 84-90 % restante de los melanomas malignos mutantes en BRAF se caracterizan por una degradación de MITF mediada por la hiperactivación de ERK. Vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK La vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK regula las decisiones del destino celular por debajo de receptores tirosina cinasa (RTK), citocinas y receptores GPCR (Fig.3I). En melanocitos, esta vía de señalización se encuentra activada por factores de crecimiento como el factor de célula madre (SCF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el HGF64 . Individualmente estos factores de crecimiento inducen una activación transitoria de ERK, promoviendo un efecto mitogénico modesto. Así, la desregulación de esta vía es clave para la proliferación celular del melanoma, ya que un 90 % de los melanomas humanos presentan una hiperactivación de ERK. En el melanoma, la activación de ERK se puede producir por diferentes causas que incluyen la producción autocrina de los factores de crecimiento65 , raramente por mutaciones activantes del receptor del factor de crecimiento como c-Kit66 o alteraciones mutacionales en los componentes de la vía de ERK. El componente más comúnmente mutado de esta vía es BRAF, mutado en la posición 600 (V600E)31 . BRAFV600E estimula constitutivamente la señalización de ERK, estimulando la proliferación y supervivencia; promoviendo el crecimiento
  48. 48. 38 tumoral; y el mantenimento de funciones esenciales57 . Paradójicamente, el efecto oncogénico de BRAFV600E es insuficiente para la conversión plenamente maligna en melanocitos, ya que BRAFV600E induce senescencia58,59 , lo que le ha dado el atributo de oncogén inductor de senescencia celular (OIS). Así, en la progresión del melanoma maligno el oncogén BRAFV600E se encuentra asociado al silenciamiento de uno o más genes supresores de tumores, siendo los más comunes PTEN o CdkN2A40,67,17,68 . En referencia a este suceso, recientemente se ha descrito que BRAFV600E coopera con la pérdida de PTEN para la inducción del melanoma metastático41 . Además, existen otros genes que cooperan y se encuentran por debajo de BRAFV600E , como son MITF62,69 , BRN-2, ciclina D170 , p16INK4a (71,58) , metaloproteínasa de matriz enzimática para el mantenimiento tumoral (MMP-1)72 y sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS)69 . Como se ha mencionado anteriormente, otro mecanismo frecuentemente asociado a la activación de la vía de RAS/RAF/MEK/ERK son las mutaciones activantes en NRAS. Donde se ha demostrado que el oncogén RAS que estimula las vías de señalización que controlan la superivencia celular, la proliferación y la diferenciación, puede inducir el melanoma en ratones deficientes en p16INK4a . De manera que RAS tiene una función relevante en el mantenimiento tumoral73,74 . Además, a diferencia de los tumores BRAFV600E , el oncogén RAS presenta más opciones de supervivencia celular porqué activa a múltiples efectores de distintas vías de señalización como ERK y PI3K67 (Fig.3I). Vía de señalización PI3K/AKT/PKB La vía de señalización PI3K regula multitud de respuestas biológicas celulares como la supervivencia celular75,76 , la proliferación celular77,78,79 , el crecimiento celular80 , el ciclo celular, la migración celular y la invasión de la matriz extracelular81,82 . Por este motivo, esta vía se encuentra alterada en una gran variedad de cánceres83 . Concretamente, se ha detectado la hiperactivación de la vía de PI3K en una cierta proporción de melanomas, donde un 3 % de las lesiones melanocíticas metastáticas poseen mutaciones en PI3K84 ; y un 5-20 % de los melanomas avanzados presentan la pérdida de función del supresor tumoral PTEN, responsable de la hiperactivación de la vía de PI3K35 . Además, se ha observado que AKT3 se encuentra sobreexpresado entre un 43-60 % de los melanomas esporádicos33 . Curiosamente, en el melanoma no coinciden las mutaciones en NRAS y BRAF, o en NRAS y PTEN, ya que son mutuamente excluyentes debido a que NRAS debido a que se encuentra por encima de la vía de señalización de los componentes BRAF y PI3K (Fig.3I). Así, la presencia del oncogén NRAS con mutaciones adicionales en BRAF o en PTEN son innecesarias, ya que BRAF y PI3K siempre se encontrarían activadas por el oncogén NRAS (Fig.3I).
  49. 49. 39 Figura 3I/ Vías de señalización diana en melanoma Esquema de las vías de señalización claves en melanoma. En la parte superior de la figura se encuentran los fármacos que se han desarrollado para el tratamiento del melanoma y las dianas para las diversas vías de señalización más importantes implicadas en el melanoma maligno. No obstante, las mutaciones en BRAF y PTEN son coincidentes en más de un 20 % de los casos32 , donde la activación de ambas vías, la vía de señalización de BRAF y de PI3K, cooperan para la estimulación de la proliferación (Fig.3I). En experimentos in vitro donde reproducen el melanoma en cultivos tridimensionales, se requiere la inhibición de las vías de señalización de ERK y de PI3K para la supresión del crecimiento celular, demostrando que estas dos vías de señalización son muy importantes en la melanomagénesis85 . De acuerdo a este modelo, se observa que el oncogén transformante de melanocitos RAS es más eficente respecto el oncogén BRAF67 , debido a que el oncogén RAS se encuentra activando la vía de RAF/MEK/ERK y la vía de PI3K/AKT (Fig.3I). Curiosamente, las mutaciones en BRAF son más frecuentes en melanoma respecto las mutaciones en NRAS. Este hecho probablemente refleja otras presiones genéticas y biológicas que se desconocen que favorecen la progresión del melanoma con mutaciones prevalentes en BRAF respecto mutaciones en NRAS.
  50. 50. 40 Otras vías de señalización Las alteraciones genéticas más importantes en melanoma que contribuyen a la reducción de la apoptosis incluyen mutaciones en NRAS y BRAF; a la pérdida de PTEN; a la sobreexpresión de AKT3, de limfoma 2 /leucemia de células B (BCL- 2), del factor nuclear κB (NF-κB); y a la activación de β-catenina. De este modo, no sorprende que algunas de estas vías de señalización promuevan el crecimiento, ya que existe una coordinación simultánea de las vías de proliferación y de supervivencia celular con el crecimiento celular (Fig.3I). Tratamiento del melanoma El melanoma es una enfermedad extremadamente agresiva con un elevado potencial metastático y con una resistencia notable a agentes citotóxicos. Consecuentemente, las células de melanoma tienen bajos niveles de apoptosis espontánea in vivo frente a otros tipos de células tumorales, y son relativamente resistentes a la inducción de apoptosis inducida por fármacos in vitro86 . Esta resistencia a la apoptosis en melanoma coincide con el hecho que aproximadamente un 70 % de los melanomas presentan mutaciones en BRAF. Preferentemente, en melanoma se encuentra el mutante BRAFV600E , responsable de la activación de manera constitutiva de la vía MEK/ERK y de la inhibición de la apoptosis mediante la regulación de los miembros de la familia BH3 a través de la activación dependiente de ERK87 . Muchos fármacos quimioterapéuticos se utilizan para la inducción de apoptosis en células malignas. Pero en melanoma la resistencia a la apoptosis desencadena una resistencia farmacológica86 , y por este motivo actualmente existe una gran barrera para el tratamiento del melanoma debido a esta extraordinaria resistencia a la quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia. La mayoría de los protocolos terapéuticos aprovados para el melanoma maligno se reducen a terapias adyuvantes postoperatorias. El interferón alpha (IFN-α) es una de las inmunoterapias adyuvantes utilizada más común, aunque su eficacia es cuestionable. La dacarbazina (DTIC) es una referencia como agente quimioterapéutico para el tratamiento del melanoma avanzado, y fármacos como la carmustina (BiCNU), paclitaxel (Taxol), temozolomida y cisplatino se usan como agentes únicos con actividad en cánceres metastáticos88 . Desafortunadamente, todas estas terapias son ineficaces, contribuyendo poco en la supervivencia del paciente, y por lo tanto, la identificación de nuevas vías de señalización centrales en la iniciación y progresión del melanoma es una nueva área excitante de investigación para el tratamiento del melanoma.
  51. 51. 41 Así, conocer y entender la biología del melanoma da la oportunidad de desarrollar terapias dirigidas. Dianas terapéuticas Las dianas tumorales más atractivas son aquellas que hacen a la célula cancerígena dependiente de la progresión tumoral. De manera que esta dependencia muchas veces recae en la adicción de la célula tumoral al oncogén, debido a que le da una fuerte hiperactivación de la vía de señalización respecto a la célula normal. Así, debido a la fuerte dependencia de les células cancerígenas a los oncogenes, éstas presentan una mayor sensibilidad a la inhibición de los oncogenes frente las células normales (Fig.3I). Sin embargo, no todos los oncogenes pueden ser dianas tratables, pero las enzimas como las cinasas, las proteasas y las fosfatasas son altamente estudiadas, porqué éstas poseen un dominio catalítico con profundos bolsillos, susceptible de ser inhibido catalíticamente (Fig.3I). Los fármacos se diseñan contra este dominio catalítico, de manera que la unión selectiva al dominio catalítico inhibe la actividad enzimática del oncogén. Por este motivo, las cinasas NRAS y BRAF son dianas terapéuticas validadas en melanoma y tienen un notable interés. Los primeros fármacos utilizados en clínica dirigidos contra la vía de señalización de RAS, fueron los inhibidores farnesil transferasa de RAS, diseñados para bloquear una modificación postraduccional esencial en RAS89 . Aunque estos fármacos no resultaron muy específicos, éstos se pudieron combinar con cisplatino, mejorando su eficacia90 . Posteriormente, se generó el inhibidor multicinasa sorafenib o BAY 43-9006 (Nexavar , Bayer Pharmaceuticals Corporation, West Haven, CT, USA) que inicialmente fue desarrollado como inhibidor de las cinasas de Ser/Thr de RAF (CRAF y BRAF)91 . Pero resultados de distintos estudios in vitro mostraron que el inhibidor sorafenib tiene como dianas BRAF, CRAF y receptores de tirosina cinasa del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y del factor de crecimiento que deriva de plaquetas (PDGF)91 . Sorafenib previene el crecimiento tumoral mediante la combinación de dos actividades antitumorales, la inhibición de la proliferación celular tumoral y de la angiogénesis tumoral. Así, sorafenib ejerce un efecto farmacológico dual que sugirió en el año 2006 que este componente podría ser potencialmente efectivo en un amplio rango de cánceres, especialmente en aquéllos que estuviesen vascularizados. Como monoterapia, sorafenib muestra una modesta actividad contra el melanoma, donde su IC50 en humanos es de aproximadamente 5µM92 , siendo inefectiva en pacientes con melanoma. En ensayos farmacocinéticos monoterapéuticos del
  52. 52. 42 sorafenib muestran una IC50 por encima de 5µM92 . Sin embargo, la combinación con carboplatina y paclitaxel presenta un resultado más esperanzador93 . Aunque BRAF sea el centro para el desarrollo de fármacos de RAF, otras isoformas de RAF no pueden ser obviadas, ya que BRAF activa a CRAF en células de mamífero94 ; y pese a que CRAF no se requiere para la activación de MEK en la presencia del mutante BRAFV600E , éste se requiere para la proliferación celular57 . Además, cuando en el melanoma se encuentran mutaciones activantes en RAS, el responsable de la activación de MEK es CRAF y no BRAF17 . Por lo tanto, estos hechos sugieren que los fármacos para los diversos RAF (panspecific Raf drugs) podrían ser mejores agentes antimelanoma respecto los fármacos específicos para BRAF. Posteriormente, se iniciaron ensayos clínicos con el inhibidor BRAF CHIR-265 para el melanoma cutáneo. En la actualidad, existen distintos inhibidores de segunda generación de BRAF como son RAF265 (Novartis)95 , XL281 (Exelixis/Bristol Myers Squibb)96 , AZ628 (AstraZeneca)97 , SB-590885 (GlaxoSmithkline) y PLX-4720 (Plexxikon/Roche)98 . Un nuevo fármaco para el tratamiento del melanoma metastático es el PLX-4032 de estructura análoga a PLX-4720 (Plexxikon Inc and Hoffman-La Roche Ltd). Es un inhibidor selectivo de la cinasa mutada BRAF, desarrollado para el tratamiento de los cánceres con mutaciones activantes en BRAF, concretamente para el mutante BRAFV600E , inhibiendo así a BRAFV600E con una IC50 de 13nM98 . En la actualidad, PLX-4032 se utiliza en investigaciones clínicas de fase II y fase III, siendo uno de los fármacos para el tratamiento de melanoma con más expectativas99,100,101,102 . Una alternativa a estos fármacos son los que tienen como diana a MEK1/2, como PD0325901 y AZD6244, responsables de la inhibición in vitro de la proliferación, de la formación de colonias en agar y de la invasión en matrigel de células de melanoma humanas mutantes en BRAFV600E . Y estos fármacos son efectivos in vivo contra el melanoma mutante BRAFV600E de ratones xenografts103 . Además, las células de melanoma BRAF mutantes son más sensibles a los inhibidores de MEK respecto las células de melanoma RAS mutantes104 . Por lo tanto, las células mutantes en BRAF son más adictivas a la señalización de MEK, respondiendo mejor a la inhibición de MEK respecto las células mutantes en RAS. Los fármacos AZD6244 y PD0325901 fueron testados en ensayos clínicos en pacientes con melanoma avanzado105,106,107 . En referencia a la inhibición de esta vía de señalización, también se utilizó la toxina letal del ántrax para la degradación selectiva e inactivación de MEK1 y MEK2108 , la cuál fue testada en ensayos clínicos.
  53. 53. 43 Otra vía de señalización diana importante para el tratamiento del melanoma es la vía de PI3K, que tiene como agentes diana las proteínas PKB, AKT y otros componentes por debajo de la vía de señalización de PI3K, como la diana de mamífero rapamicina (mTOR). Los inhibidores de mTOR como CCI-779 o RAD001 son los más avanzados, ya que inhiben mTOR, PTEN, y PI3K/AKT. Así, la correcta combinación de inhibidores de mTOR con otras dianas terapéuticas podría ser muy beneficiosa en determinados pacientes, debido a que ambas vías de señalización RAS/ERK y PI3K/AKT contribuyen en la supervivencia celular del melanoma. Por este motivo, es interesante la combinación de los fármacos anti RAS/ERK y anti PI3K/PKB con fármacos que induzcan apoptosis, como los fármacos anti NF-κB o BCL-2 como señales de supervivencia. La pérdida de función de p16INK4a en multitud de melanomas, aseñalan CDK4 y CDK6 como otras dianas potencialmente terapéuticas. Los inhibidores pan CDKs como los flavopiridol son ámpliamente inactivos y no hay ninguna evidencia de la actividad clínica en el melanoma maligno, pero éstos podrían ser efectivos en algunos pacientes, porqué la inhibición de las CDKs preferencialmente suprime la expresión del ARNm de proteínas antiapoptóticas. Así, la combinación de estos fármacos con otros agentes terapéuticos podrían ser una oportunidad para tratar el melanoma. Otras aproximaciones serían el uso de agentes diana que se encuentran en diversas vías de señalización. Como la chaperona o proteína de choque caliente 90 (Hsp90) que regula el plegamiento y la función de nuevas proteínas sintetizadas, como por ejemplo de muchas proteínas cinasa como CRAF, BRAF, CDK4 y CDK6. La inhibición de la Hsp90 por la anisomicina benzoquinona (17AAG) causa la degradación de las proteínas que requieren la presencia de Hsp90 para su estabilidad y/o función, a través de la señalización al proteasoma dependiente de la ubicuitinización. Sorprendentemente, la inhibición de la Hsp90 no promueve altos niveles de toxicidad, ya que debido a que la Hsp90 es una chaperona que regula a muchísimas proteínas, se esperaba una alta toxicidad. De manera importante, el mutante BRAFV600E respecto a BRAF salvaje (wt) parece ser más sensible a la inhibición de la Hsp90 por 17AAG, pero 17AAG también es diana de las proteínas BRAF y CRAF wt que se encuentran por debajo del oncogén RAS109,110 . Así, 17AAG como diana de muchas proteínas de distintas vías de señalización, es un tratamiento que no aumenta la sensibilidad en las células de melanoma mutantes para BRAF. Y de manera semejante, la inhibición del proteasoma mediante PS-341 demostró una mínima actividad del fármaco contra el melanoma in vitro e in vivo111 .
  54. 54. 44 Así, mejorar el entendimiento de la biología del melanoma es ahora una nueva y excitante aproximación terapéutica. BRAF Generalidades del gen BRAF BRAF (del inglés v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) es una proteína cinasa citoplasmática específica de residuos Ser y Thr, y es uno de los miembros de la familia de proteínas cinasa RAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene). La familia RAF consta de tres miembros, ARAF, BRAF y CRAF112 . Es uno de los componentes de cinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) de la vía de señalización mitogen-activated protein kinase (MAPK)113,114,57 . Los productos genéticos de RAF son los efectores de RAS, los cuales participan en la vía de señalización de las MAPK y conectan las señales extracelulares con la regulación transcripcional. Las proteínas RAF (MAPKKKs) se reclutan en la membrana plasmática, y las cinasas RAF son activadas por una serie de fosforilaciones y defosforilaciones. Las proteínas RAF activas fosforilan y activan a MEK1 y MEK2 (MAPKKs), las cuales fosforilan y activan seguidamente a ERK1 y ERK2 (MAPKs). Finalmente, éstas fosforilan diversas dianas citoplasmáticas y nucleares, incluyendo los factores de transcripción Ets-1, c-Jun y c-Myc. Así, estos múltiples pasos en la vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK proporcionan un mecanismo de amplificación de señal. BRAF respecto ARAF y CRAF, en lugar de presentar residuos Tyr en la posición 448 y 449, codifica por residuos de ácido aspártico (D448 y D449 , respectivamente), mimetizando tirosinas fosforiladas. Así, la activación de BRAF requiere pocos pasos de fosforilación. De manera relevante, BRAF es la única proteína de la familia RAF que se encuentra frecuentemente mutada en cáncer, probablemente debido a que la activación constitutiva de BRAF requiere pocos sucesos mutacionales. BRAF se encuentra mutado en multitud de tumores humanos, incluyendo el melanoma con un 70 %, el cáncer de colon, de tiroides, de carcinoma de ovario y algunos sarcomas con un porcentaje menor31,115 , datos que estimulan el estudio intensivo de este gen. A lo largo de estos últimos 8 años, se han identificado en la proteína BRAF 35 aminoácidos diana mutados en melanoma116 . El aminoácido mutante diana más predominante en BRAF, que representa un 95 % de todas las mutaciones de BRAF en melanoma, es la valina en posición 600. La mutación en el aminoácido valina consiste por el cambio de la timina por una alanina en la posición nucleotídica 1799, resultado de la sustitución del residuo valina (V) por un glutamato (E) en la posición aminoacídica 600 de la
  55. 55. 45 proteína BRAF (BRAFV600E ). Se cree que esta mutación mimetiza la fosforilación de los residuos T599 /S602 que se encuentran flanqueando la posición 600, causando así la activación constitutiva de BRAF. BRAF mutante en tumores malignos y benignos BRAF es un oncogén que dependiendo del contexto celular puede actuar como un clásico oncogén inductor de senescencia celular. De modo que por un lado BRAFV600E mutante puede actuar como oncogén promoviendo una fuerte proliferación celular, y por otro lado como OIS promoviendo la parada del ciclo celular. El oncogén BRAFV600E se puede encontrar en distintos tipos de melanomas junto con la adquisición de mutaciones adicionales en otros genes117 . Concretamente, en un 50-70 % de los casos de melanoma cutáneo son BRAFV600E mutante, donde BRAFV600E es responsable de la estimulación constitutiva de la vía de señalización RAF/MEK/ERK, de la proliferación independiente de factores de crecimiento y de la transformación de los melanocitos normales en inmortales. También se puede encontrar BRAFV600E en un 82 % de los nevus benignos118 , lesiones melanocíticas benignas que permanecen inalterables a lo largo del tiempo. De esta manera, en los nevus benignos BRAFV600E se comporta como un OIS debido a la exposición continua de la activación de la señalización RAF/MEK/ERK, sugiriendo que la mutación única en BRAF es insuficiente para la transformación oncogénica maligna. Así, mientras BRAFV600E estimula la proliferación celular en melanoma, en melanocitos induce senescencia. BRAF y melanoma En melanocitos el factor transcripcional MITF se encuentra por debajo del control de señales dependientes de BRAF para la producción de melanina en respuesta a MSH-α, y además, los niveles de MITF se encuentran significativamente disminuídos en los melanocitos respecto las células de melanoma. Así, en melanocitos normales BRAF puede ser activado por la vía de AMPc, teniendo un papel clave en la proliferación y diferenciación del melanocito, ya que el AMPc activa la vía de ERK a través de la vía dependiente de RAS y de BRAF. De manera que por un lado, la vía de AMPc a través de PKA promueve la fosforilación dependiente de CRAF, causando la incapacidad de unión de RAS con CRAF y la inactivación de CRAF, y por otro lado, la vía de AMPc induce la activación de BRAF. Como consecuencia, probablemente los melanocitos normales utilizan preferentemente BRAF como principal efector de RAS, y de manera
  56. 56. 46 similar en células de melanoma se encuentran frecuentemente mutaciones en BRAF y no en CRAF. De este modo, mutaciones en RAS excluyen mutaciones en BRAF, pero no en CRAF. Senescencia y BRAF La senescencia es el mecanismo clave de protección celular contra el cáncer, provocando la parada irreversible de la proliferación celular debido a una proliferación extensa, una activación oncogénica o por algún tipo de estrés celular119,120 . Las células tumorales presentan una proliferación celular aberrante y no entran en estado de senescencia, debido a la inactivación de las vías de señalización claves como son las vías de los supresores tumorales p16INK4a /pRb y p53. Intrigantemente, BRAF se encuentra mutado por encima del 80 % de los nevus benignos118 , y aunque muchos de los nevus permanezcan indolentes durante décadas pueden progresar raramente en melanoma. Sin embargo, BRAF se encuentra frecuentemente mutado en los melanomas cutáneos malignos, indicando que la molécula BRAF se comporta como un OIS en los nevus benignos, y como oncogén en el melanoma cutáneo maligno, paradoja desarrollada anteriormente. Se conoce que BRAFV600E induce la expresión del supresor tumoral p16INK4a induciendo senescencia en melanocitos primarios humanos in vitro71,58 , y por el contrario, en ratones deficientes del p16INK4a el efecto oncogénico de BRAFV600E es esencial para la transformación de los melanocitos llegando a la inducción del melanoma maligno74 . Así, estos estudios sugieren que la pérdida del p16INK4a contribuye en la transformación del melanocito normal al melanocito mutante en BRAFV600E o célula de melanoma. Por lo tanto, para la progresión del melanoma se requiere la inactivación de la vía p16INK4a y pRb, ya que la adquisición de las mutaciones en NRAS o BRAF promueven una hiperproliferación y una consecuente senescencia mediada por el supresor tumoral p16INK4a . Vía de señalización RAF/MEK/ERK como señalización de supervivencia tumoral La vía de transducción de señales RAF/MEK/ERK és una vía evolutivamente conservada que estimula la supervivencia celular, y la proliferación celular mediante la coordinación del crecimiento celular y de la división celular. De manera relevante, un 30 % de los cánceres humanos tienen alterada la vía de RAF/MEK/ERK, donde la activación constitutiva de uno de los componentes de la vía de señalización de ERK media la estimulación de la proliferación celular
  57. 57. 47 y la protección frente la apoptosis o muerte celular, controlando la actividad y la abundancia de los miembros de la familia BCL-2 para promover la supervivencia celular. La familia BCL-2 consta de proteínas proapoptóticas y de proteínas prosupervivencia. Las proteínas proapoptóticas se subdividen en dos subfamilias, la subfamilia de las proteínas BAX o BAK; y la subfamilia de BAD, BIK/NBK, BID, BIM/BOD y BMF. Las proteínas proapoptóticas BCL-2 presentan únicamente un dominio BH3, y éstas se encuentran formando complejos con las proteínas prosupervivencia, reflejo de la regulación en respuesta al estrés energético o a las señales de supervivencia celular. Las proteínas prosupervivencia son las BCL-2, BCL-xL, y MCL-1, que presentan un dominio BH1-3 que puede unirse al dominio BH3 de la otra familia de proteínas proapoptóticas. Frecuentemente, la expresión de las proteínas prosupervivencia BCL-2 se encuentra elevada en tumores, y en tumores asociados a una pobre prognosis y resistencia terapéutica121 . De manera importante, la señalización de ERK regula las proteínas BCL-2 para promover la supervivencia. Pues la activación de ERK puede reprimir los niveles del ARNm de BIM122 , puede fosforilar a FOXO3A, e inducir su degradación por el proteasoma123 ; y consecuentemente reprimir la transcripción de la proteína proapoptótica BIM. Más recientemente, se ha demostrado que la activación de ERK puede inhibir la unión de la forma extra larga de BIM a miembros de la familia de prosupervivencia BCL-2, como son BCL-xL y MCL-1124,124 . También la activación de ERK puede promover la ubicuitinización y la degradación de la proteína proapoptótica BAD por el proteasoma, mediante la fosforilación de BAD en la Ser 112 de manera dependiente de p90RSK (RSK)125 . Los factores de crecimiento que utilizan la vía de ERK estabilizan y aumentan la expresión de las distintas proteínas BCL-2 de supervivencia, siendo notablemente las proteínas BCL-2, BCL-xL y MCL-1126 . Las proteínas de la familia BCL-2 tienen un lugar de unión a CREB en la región reguladora 5', y pueden ser fosforidas por RSK o MSK, cinasas dependientes de ERK, que fosforilan y activan a CREB127 . De manera adicional, la expresión de los mutantes HRAS, MEK2, PI3K o PKB protegen a la célula del proceso de anoikis mediante una reducción en los niveles de ARNm de BMF128 . Así, el oncogén BRAF aumenta la resistencia a apoptosis inducida por agentes quimioterapéuticos, promoviendo la fosforilación e inactivación dependiente de ERK de las proteínas proapoptóticas BAD y BIM. En coherencia con estos hechos, la inhibición del oncogén BRAF provoca la estabilización de BIM y la
  58. 58. 48 defosforilación de BAD, que tiene como resultado la inducción de la apoptosis. En cambio, la inhibición de la vía de PI3K no promueve una acumulación dramática de las proteínas proapoptóticas BIM y BAD, ni una activación de BIM, ni una defosforilación de BAD. De esta manera, se sugiere que la activación constitutiva de ERK como resultado de mutaciones en la vía de RAS/RAF/MEK/ERK, modifica directamente la señalización de muerte celular a través de la fosforilación e inactivación de BAD y BIM, respectivamente129 . LKB1/STK11 Generalidades del gen LKB1/STK11 LKB1/Stk11 es una cinasa de tipo B1 de residuos Ser/Thr del hígado, conocida como una proteína supresora de tumores, donde su pérdida o alteración fue asociada originalmente al síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), enfermedad hereditaria de carácter autosómico dominante130,131 . LKB1 es uno de los genes más frecuentemente mutados en distintos tipos de cánceres esporádicos como en cáncer de pulmón132 , de cérvix133 , de piel38 , de mama, de páncreas, de próstata y de ovario. Concretamente, entre un 15-35 % de los casos de cáncer de pulmón humano esporádico presentan lesiones en LKB1, particularmente en múltiples subtipos de carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)132 . Además, recientemente se han encontrado mutaciones somáticas en un 20 % de los carcinomas de cérvix133 y mutaciones somáticas en un 10 % de los melanomas malignos cutáneos esporádicos38 . LKB1 se localiza en el brazo pequeño del cromosoma 19, concretamente en la región 19p13.3134 . Su estructura génica consta de 10 exones, donde 9 de ellos son codificantes, pudiéndose encontrar dos variantes por splicing diferencial. Las dos proteínas son productos del mismo gen LKB1, cuyas diferencias residen en la secuencia aminoacídica del extremo carboxi terminal de la proteína LKB1. La isoforma pequeña es LKB1s, producto de los exones del 1 al 8 y del exón 9a, isoforma de 48KDa. La otra isoforma es más larga, nombrada LKB1L, producto de los exones del 1 al 8 y del exón 9b, isoforma de 50KDa135 . Así, LKB1L humano consta de 433 residuos aminoacídicos, y en ratón de 436. En el extremo N-terminal posee un dominio regulador (residuos del 1 al 48) y una señal de localización nuclear entre los residuos 38-43. Es una proteína con actividad cinasa en residuos Ser/Thr, cuyo dominio catalítico se situa entre los residuos 49-309, y su dominio regulador en el extremo C-terminal entre los residuos 310-436 (Fig.4I).
  59. 59. 49 Complejo LKB1:STRAD:MO25 En su forma activa, LKB1 se encuentra formando un complejo con dos proteínas, la pseudocinasa adaptadora relacionada con STE20 (STRADα o STRADβ) y la proteína adaptadora de ratón 25 (MO25α o MO25β). Este complejo heterotrimérico le confiere a LKB1 la actividad catalítica y la translocación del núcleo al citoplasma. En los complejos, estas tres moléculas LKB1:STRAD:MO25 se encuentran presentes en cantidades equimolares semejantes136 . LKB1 se une a STRADα a través del dominio catalítico, donde la interacción promueve la actividad catalítica cinasa in vivo de LKB1 y la translocación de LKB1 del núcleo al citoplasma137 . MO25α se une al complejo LKB1:STRAD a través de STRAD, y tiene una función muy importante en la estabilización del complejo al citoplasma celular, promoviendo la actividad catalítica de LKB1. LKB1 se localiza en el núcleo y en el citoplasma. De manera que LKB1 posee una señal de localización nuclear (NLS) muy conservada, donde la mutación o carencia de la NLS provoca la incapacidad de entrada de LKB1 al núcleo y la completa función de LKB1 como supresor tumoral138,139 , sugiriendo que la Figura 4I/ Representación esquemática de la estructura primaria de LKB1, de la organización de las secuencias codificantes del gen y de sus dominios funcionales, y de los lugares de modificación postraduccional de la proteína LKB1 de Mus musculus En rojo se representa los lugares de autofosforilación, en gris los lugares de fosforilación por otras cinasas y en verde la farnesilación de la cisteína 433 (C433).
  60. 60. 50 localización citoplasmática de LKB1 es importante para su función como supresor tumoral140 . LKB1 como multicinasa LKB1 es una máster cinasa localizada en el centro del dendograma del cinoma humano141 , que en su forma activa forma el complejo LKB1:STRAD:MO25, y es capaz de fosforilar y activar a otras cinasas o proteínas. La búsqueda de sustratos de LKB1 que median su función como supresor tumoral permitió identificar a la proteína cinasa activada por 5'-AMP (AMPK) como sustrato directo de LKB1143,144,145 . AMPK es un heterotrímero, compuesto por una subunidad catalítica (AMPKα) y dos subunidades reguladoras (AMPKβ y AMPKγ). AMPK se activa cuando los niveles intracelulares de ATP disminuyen y los niveles intracelulares de AMP aumentan, debido a una privación de nutrientes o hipoxia146,147,148 . Análisis bioquímicos y genéticos en distintas especies (Drosophila melanogaster, Mus musculus...) mostraron que LKB1 es la cinasa que fosforila a AMPKα y que activa el T-loop en condiciones de estrés energético143,149 . LKB1 fosforila directamente y activa a AMPK, un sensor del metabolismo central que regula el metabolismo de los lípidos, del colesterol y de la glucosa en tejidos metabólicos especializados, como el tejido hepático, adiposo y muscular. Así, AMPK coordina las actividades celulares anabólicas y catabólicas en células normales y en células transformantes150,151,152 . Figura 5I/ Representación gráfica de una parte del dendograma del cinoma humano LKB1 se localiza en el centro del dendograma del cinoma humano. LKB1 fosforila y activa a AMPK (AMPKα1 y AMPKα2) y puede fosforilar el T- loop de todos los miembros de la subfamilia AMPK (NUAK1, NUAK2, BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2/3 i MARK4)142 . Representados en color los sustratos para LKB1, en gris los que no son sustratos para LKB1.
  61. 61. 51 LKB1 como cinasa de residuos Ser/Thr fosforila a AMPKα en el residuo Thr 172, en consecuencia activa a AMPK en respuesta a las alteraciones en los niveles energéticos intracelulares y en la disponibilidad de nutrientes, controlando el crecimiento celular y el metabolismo celular. Adicionalmente, LKB1 es capaz de fosforilar y activar a 13 cinasas de la subfamilia de la proteína cinasa AMPK, un total de 12 cinasas humanas NUAK1, NUAK2, BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 y MELK, relacionadas con AMPK142 (Fig.5I). De manera singular, 4 de las 14 cinasas son miembros de la familia de proteínas asociadas a microtúbulos (microtubule- associated protein, MAP) y de la familia de las cinasas microtubule affinity- regulating kinase (MARK), requiriéndose en los estadios tempranos embrionarios, y siendo claves en el establecimiento de la polaridad celular153 . LKB1 como supresor tumoral Primeramente, LKB1 fue descrito como supresor tumoral, ya que es uno de los genes más frecuentemente mutados en distintos tipos de cánceres esporádicos. Además, se observó que la sobreexpresión de la proteína LKB1WT en líneas celulares que no expresan endógenamente LKB1, como son la línea celular de melanoma humano G361 y la línea celular de cáncer de cérvix humana HeLa, tienen como resultado la parada del ciclo celular en la fase G1154 . En estos últimos años, los estudios de LKB1 muestran que participa en nuevas vías de señalización que podrían enlazar el metabolismo celular con el control del crecimiento celular y en la polaridad celular. Así, LKB1 y AMPK controlan el crecimiento celular y el metabolismo celular, y ambas proteínas tienen funciones conservadas en la polaridad celular, donde la disrupción de estos procesos están implicados en la carcinogénesis. De manera relevante, en todas las células el requerimiento fundamental es el acoplamiento de la disponibilidad de nutrientes con las señales extracelulares, y que únicamente los factores de crecimiento estimulan la proliferación si los nutrientes son suficientes para garantizar la división celular, procesos donde LKB1 participa. Así, LKB1 podría ser el nuevo enlace directo que conectara el metabolismo celular con el cáncer. En relación a su capacidad como supresor tumoral, otros estudios muestran que los mutantes inactivos para el dominio catalítico de LKB1, mutantes aislados a partir de los pacientes con PJS, se localizan única y exclusivamente al compartimiento nuclear y son incapaces de inhibir la proliferación celular. Por lo tanto, se asume que la actividad catalítica intrínseca de la cinasa de Ser/Thr de LKB1 se requiere para el bloqueo de la división celular.
  62. 62. 52 Asimismo, LKB1 tiene una función clave en el desarrollo embrionario temprano en mamíferos. Así, los ratones que carecen de las dos copias de alelos LKB1 o LKB1-/- son inviables a partir del 8,5-11 días del embrión, debido a la deficiencia en la vasculogénesis, en el desarrollo de la placenta, en el cerramiento del tubo neural y entre otras155 . Pero de manera importante, un estudio realizado en ratones con una única copia del alelo LKB1 (LKB1+/- ) muestra que estos ratones a las 45 semanas de edad desarrollan pólipos en el tracto gastrointestinal, donde los análisis histológicos revelan que los pólipos gastrointestinales son remarcablemente semejantes a los de los pacientes con PJS156,157,158,159 . Además, estos ratones LKB1+/- que desarrollan pólipos muestran una pérdida del alelo de LKB1WT (159) , sugiriendo que la pérdida total de LKB1 se requiere para la formación del pólipo, siendo éste un supresor tumoral. Modificaciones postraduccionales de LKB1 LKB1 se fosforila en 8 residuos (Fig.4I), y la fosforilación de estos residuos no tienen efecto sobre la actividad catalítica cinasa de LKB1. El residuo Ser 428 de LKB1 humano (LKB1S428 ) se fosforila en respuesta a elevados niveles de AMPc a través de la cinasa PKA160,161 , en respuesta al EGF a través de la cinasa p90RSK (162) , o por PKCζ163,164 . La mutación de la Ser 428 por una alanina en LKB1 (LKB1S428A ), mutación que impide la fosforilación de este residuo, tiene como consecuencia la supresión de la proliferación celular en ser sobreexpresado este mutante en la línea celular G361. Resultados que sugieren que la fosforilación de la Ser 428 es esencial para la inhibición de la proliferación celular en la línea celular G361 que no expresa LKB1 endógeno originariamente160 . Por el contrario, las mutaciones en la Ser 31 y 325, y la Thr 366 de LKB1 no tienen ningún efecto sobre la capacidad de suprimir la proliferación celular en G361161 . De manera singular, la fosforilación del residuo Thr 366 es diana única en las células expuestas a la radiación ionizante y a la radiación UV. La irradiación induce el daño al ADN, y por consiguiente provoca la activación de la cinasa Mutante-Ataxia-Telangiectasia (ATM) responsable de la fosforilación in vivo de la T366 de LKB1138 . Además, se conoce que en respuesta al daño al ADN por irradiación, LKB1 se une en el dominio N-terminal de unión a sustratos de la proteína ATM165 . LKB1 presenta una secuencia aminoacídica consenso para la prenilación. Esta secuencia está conservada en Xenopus y Drosophila, pero no en Caenorhaditis elegans. Esta forma de prenilación se farnesila y raramente se geranilgeranilila. La fosforilación del residuo S431 murino/S428 humano por
  63. 63. 53 PKA, y la prenilación de la cisteína 433 de LKB1 son esenciales para la regulación de la polaridad celular166 . Funciones de LKB1 LKB1 es una cinasa multifunción con un potencial ilimitado orquestando la actividad celular. De esta manera, LKB1 tiene un papel clave en el metabolismo energético intracelular, regulando la respuesta a estrés metabólico y la proliferación celular a través de la vía LKB1/AMPK/TSC1- TSC2/mTORC1167,168,169 . Además, como ya se ha indicado, LKB1 es importante en la inducción de la polaridad celular170 , teniendo una función central en la polarización de las células epiteliales171 , y en el control del ciclo celular, mediando la parada del ciclo celular en G1 por inducción de la expresión de p21 dependientemente de p53140 . Sensor del metabolismo energético LKB1 es una cinasa multifunción implicada en el metabolismo celular y en la proliferación celular a través de la regulación de la cinasa de estrés metabólico AMPK. De este modo, LKB1 como sensor del metabolismo energético regula la vía de estrés y de proliferación LKB1/AMPK a través de la fosforilación del acetil coenzima A carboxilasa (ACC) y de los supresores tumorales, como son Tuberous Sclerosis 2 (TSC2) y p53167,168,169 . El descubrimiento de LKB1 como cinasa reguladora de AMPK, fue un dato relevante que enlazó dos procesos íntimamente relacionados, la tumorogénesis y la regulación del metabolismo energético. Conexión sugerida por Otto Warburg9 , aproximadamente hace unos 60 años. Durante el estrés metabólico energético el índice de AMP/ATP intracelular aumenta, y estos cambios se detectan mediante el sensor LKB1, que en respuesta a estrés energético se activa la vía de estrés LKB1/AMPK disminuyendo el consumo de energía celular para la inhibición de las vías anabólicas como la síntesis proteica, y aumentando la producción de energía por la activación de las vías catabólicas como la glucólisis y la oxidación de ácidos grasos. La AMPK puede ser fosforilada y activada por LKB1143,144,145 y por la proteína Ca2+ -calmodulin-dependent protein kinase kinases (CaMKKs)172,173,174 , existiendo distintas vías de señalización alternativas que pueden activar a AMPK. LKB1 fosforila y activa directamente al residuo Thr 172 que se encuentra en la región T-loop de la subunidad catalítica α de AMPK, esta modificación es absolutamente esencial para la actividad catalítica de AMPK142 . Así, el aumento de los niveles celulares de AMP activan al sensor energético LKB1, que activa a la cinasa AMPK que inhibe directamente a mTORC1 a través de la
  64. 64. 54 fosforilación de Raptor175 . También se ha descrito que altos niveles celulares de AMP activan a AMPK, responsable de la fosforilación de los sustratos TSC1/TSC2 que inhiben a Rheb y por último a mTORC1176,177,167 . TSC1/TSC2 y Rheb tienen una función importante en la activación de la vía de mTORC1, activación que sucede debido a la pérdida de los supresores tumorales PTEN, NF1, LKB1 o p53. Concretamente, TSC2 inhibe indirectamente a mTORC1 a través de la regulación de las pequeñas GTPasas Ras homologue enriched in brain (RHEB), ya que la pérdida de TSC1 o TSC2 promueve la hiperactivación de mTORC1178 . Así, la vía de mTORC1 regula el crecimiento celular incluyendo la síntesis proteica, la biogénesis ribosomal, la angiogénesis y la autofagia a través de los efectores por debajo de mTORC1. Los efectores por debajo de mTORC1 son el regulador de traducción de proteína de tipo 1 de unión al factor de iniciación de traducción eucariota 4E (4EBP1), y la cinasa 1 ribosomal S6 (S6K1) que contribuyen en la regulación de la traducción de proteínas dependiente de mTORC1179 . También podemos encontrar que mTORC1 controla la traducción de reguladores del crecimiento celular como la Ciclina D1, el Factor Inducible de Hipoxia 1 alpha (HIF1α) y de Myc, que a su vez promueven procesos como la progresión del ciclo celular, crecimiento celular y angiogénesis180 . De este modo, no es sorprendente encontrar en líneas celulares de melanoma la activación de la vía de mTORC1181 . Control de la polarización celular LKB1 es un regulador de polaridad celular conservado evolutivamente. Primeramente, LKB1 fue descrito en la regulación de la polaridad en Caenorhabditis elegans, conocido como PAR-4. En distintos estudios describieron que PAR-4 se requiere para las divisiones asimétricas que promueven la formación del eje anteroposterior del embrión primerizo. En Drosophila melanogaster, LKB1 se identificó como un mutante de deleción donde su carencia, pérdida de la localización posterior del ARNm materno de LKB1, afecta al desarrollo del eje anteroposterior, mostrando defectos en la polarización del citoesqueleto de microtúbulos. La capacidad de LKB1 como regulador de la polaridad celular se encuentra conservada en células de mamífero, como las células neuronales y las células epiteliales pancreáticas. Esta capacidad se encuentra mediada por la translocación de LKB1 del núcleo al citoplasma a través de STRAD, de esta manera, puede inducir polaridad celular en células intestinales no polarizadas mediante la remodelación del citoesqueleto de actina, la relocalización de la catenina p120 y la zona occludens 1 a la formación de complejos de unión, y la clasificación de las proteínas de superficie de los dominios apicales a los basolaterales171 . Además, LKB1 se requiere en la migración neuronal y en la posición del centrosoma182 .
  65. 65. 55 Control del ciclo celular LKB1 se encuentra implicado en el control del ciclo celular, mediando la parada del ciclo celular en la fase G1 por inducción de la expresión de p21, resultado de la asociación de LKB1 al promotor p21 de manera dependiente de p53140 . Contrariamente, otros estudios a partir del análisis del mutante para el dominio catalítico de LKB1 que se caracteriza por encontrarse exclusivamente en el núcleo e incapaz de ser relocalizado al citoplasma, demostraron que el mutante para el dominio catalítico de LKB1 promueve la expresión de proteínas necesarias para la transición del ciclo celular, como son pRb, Ciclina E, y Ciclina A2, y además LKB1 media la parada en G1 independientemente de p21 y/o p53183 . Otros trabajos documentan que LKB1 suprime el crecimiento tumoral debido a la asociación de LKB1 con Brahma/SWI2-related gene 1 (BRG1), una asociación necesaria para la inducción de la parada del ciclo celular184 . MODELOS DE MELANOMA MURINOS En esta última década, la secuenciación del genoma humano ha permitido acelerar la investigación biomédica, su análisis genómico ha sido una explosión de conocimiento en la biología y en la genética molecular del melanoma, con la identificación de nuevas dianas y vías de señalización críticas en la iniciación y en la progresión de esta enfermedad. Sin embargo, en la actualidad el melanoma cutáneo es uno de los cánceres humanos que presenta un elevado potencial metastático y una notable resistencia a agentes terapéuticos86 . Datos que indican que la excelente selección de los oncogenes y de las vías claves que intervienen en el desarrollo y progresión del melanoma es extremamente importante para el éxito de las aproximaciones terapéuticas. Actualmente, la ingeniería genética aplicada en modelos animales ha permitido entender mejor el desarrollo y progresión tumoral in vivo. Así, el diseño de un excelente modelo de melanoma cutáneo maligno murino es clave para permitir el test experimental directo de las distintas hipótesis para la búsqueda de nuevas dianas moleculares y de exitosas aproximaciones terapéuticas. El modelo ideal de melanoma murino debería recapitular la etiología de la radiación UV, la histopatología y la cronología de los distintos estadios de la progresión del melanoma cutáneo maligno humano, y mimetizar la genética del melanoma humano a través de manipulaciones genéticas e inmunológicas. Mayoritariamente, los modelos de melanoma de ratón existentes presentan grandes dificultades para inducir el melanoma (Tabla 1A (Anexo)), típicamente estos modelos desarrollan melanomas dérmicos y no muestran una similitud
  66. 66. 56 histopatológica de los estadios de la progresión del melanoma humano (Tabla 1A). Esto es debido a que desafortunadamente, la piel del ratón en neonatos y en adultos presenta una localización y distribución de los melanocitos que no coincide con la piel humana185,186 . Además, los melanocitos murinos son altamente resistentes a la inducción del melanoma por radiación UV, y que curiosamente, la mayoría de los modelos de melanoma que son capaces de iniciar el melanoma se caracterizan por el uso de carcinógenos químicos o por la combinación de estos con radiación UV187,188,189,190,191 . Por ejemplo, el modelo de ratón deficiente en p16INK4a es altamente susceptible a la inducción del melanoma dérmico metastático mediante el carcinógeno químico DMBA192 . El modelo condicional de ratón de BRAFV600E inducible y PTEN deficiente es capaz de recapitular los aspectos clave patofisiológicos del melanoma humano mediante la administración tópica del carcinógeno 4-hidroxitamoxifeno (4-HT), un componente no medioambiental41 . Y la no administración de 4-HT en este modelo murino, no muestra ningún tipo de lesión por encima de los 18 meses de edad41 (Tabla 1A). Únicamente, el modelo de melanoma cutáneo maligno murino manipulado genéticamente, mediante la sobreexpresión del HGF, muestra que a partir de una única dosis de radiación UV en neonatos, y no en adultos, es necesaria y suficiente para inducir tumores con una elevada incidencia y siendo reminiscente al melanoma humano193 . Este modelo de melanoma cutáneo maligno murino se caracteriza por ser transgénico para el gen HGF, sobreexpresión que consiste con la presencia del promotor del gen de la metalotioneína que fuerza la sobreexpresión del HGF, siendo el HGF el ligando para el receptor c-Met responsable de la activación de RAS/MEK/ERK y de PI3K/AKT, vías de señalización claves en el desarrollo y progresión del melanoma. Concretamente, el modelo de melanoma murino transgénico para el HGF es inducido por una única dosis de 9,58KJ/m2 (UV-A,320-400nm, 3,31KJ/m2 ; UV-B 280-320nm, 6,24KJ/m2 ; UV-C 250-280nm, 0,03KJ/m2 ) que corresponde a una dosis de luz natural solar de medio verano en una latitud media193 . Este modelo murino transgénico para el HGF destaca por presentar una piel muy semejante a la piel humana, con una distribución de los melanocitos en la dermis, en la epidermis y en la zona de unión entre la epidermis y la dermis. El modelo murino transgénico para el HGF sin ser irradiado desarrolla espontáneamente un melanoma dérmico metastático en la vejez194,195 , mientras que la radiación UV en estado adulto (a las 6 semanas de edad) provoca la formación de un neoplasma cutáneo no melanocítico no tumorogénico193 . Con importancia, el modelo transgénico para el HGF inducido por radiación UV neonatal (a los 3,5 días de edad) genera un melanoma cutáneo maligno murino con una relativa elevada penetrancia (Tabla 1A). El melanoma cutáneo maligno
  67. 67. 57 murino inducido por radiación UV neonatal es capaz de recapitular histopatológica y cronológicamente todos los estadios de la progresión del melanoma maligno cutáneo humano. Además, los análisis moleculares de los melanomas murinos originados en este modelo transgénico para el HGF inducido por radiación UV neonatal, indican que como en el melanoma humano, se encuentran bucles de la señalización autocrina del receptor tirosina cinasa c-Met, frecuentemente se encuentra la pérdida del gen supresor tumoral p16INK4a , mientras que raramente se encuentran mutaciones en p53193 .
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