1. Гепатоциты приводят к
деградации
аутореактивных CD8 Т-
клеток
Hepatocyte entry leads to degradation
of autoreactive CD8 T cells
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.11
12251108

2.  Большиство аутореактивных Т клеток элиминируются в тимусе,
механизм инактивации или контроля Т клеток, специфичных
для внетимусовых антигенов существует в периферии.
 Изучая места, где ауторекативные Т клетки становятся
толерантными был обнаружен уникальный механизм
периферийного делетирования, в котором наивные
аутореактивные цитотоксические Т лимфоциты быстро
элиминируют в печени после внутрипечёноной активации. Т
клетки активно проникают в гепатоциты, входя в
эндосомальные/лизосомальные компартменты, и деградируют.
 Блокирование этого процесса ведёт к накоплению
аутореактивных CD8 Т клеток, прорыву толерантности и
развитию аутоиммунного гепатита.
 Проникновение клетки в клетку или эмпериполез — давно
наблюдаемый феномен, для которого не была ранее показана
физиологическая роль. Было предложено что такой
«самоубийственный эмпериполез» есть уникальный механизм
делеции аутореактивных Т клеток, критичный для сохранения
толерантности.

3. Аутореакивные Т клетки не индуцируют
генерализованные аутоиммунные процессы в
мышах, повсеместно экспрессирующих
родственный им антиген.
 Для моделирования аутоиммунного процесса
были перенесены Т клетки Des CD8
(экспрессирующие TCR специфичный к MHC-I H-
2Kb) мышам C57BL/6 (B6), экспрессирующих
повсуюду H-2Kb.
 В контроле использовались мыши B10.BR, не
экспрессирующие антиген.
 Несмотря на высокую частоту переноса
аутореактивных CD8 Т клеток у мышей-хозяев
никогда не развивалось аутоиммунной патологии
по оценке АлТ и ряду симптомов.

4. Механизм потери аутоиммунности
ограничен наивными Т клетками
 Каждая инъекция 108 Des клеток из лимфоузлов не
приводила к системной аутоиммунной реакции, что
показывало об очень эффективном механизме
умолкания донорских Т клеток, насыщение у
которого достигнуть нелегко.
 Когда in vitro полученные (культивированием с В6
гепатоцитами и IL-2) эффекторные Т клетки были
перенесены, они индуцировали тяжёлый гепатит у
мышей В6, но не у мышей B10.BR, не
экспрессирующих антиген.

5. Потеря аутоиммунности в В6 реципиентах
ассоциирована с активной миграцией донорских
клеток из лимфоузлов в печень и
внутрипечёночном удержании
 Были проведены измерения содержания донорских
лейкоцитов фенотипа CD8 в крови, лимфоузлах, печени и
селезёнке спустя короткое время после переноса.
Как и ожидалось, у не экспрессирующих антиген B10.BR контрольных реципиентов
донорные Т клетки сохранили наивность, оценённую по экспрессии CD69 через 5
часов после переноса Т клеток и по преимущественной миграции в лимфоидные
органы (отсутствуя в печени). В B6 реципиентах донорские Т лимфоциты очень
редко находились в крови и лимфоидных органах, а спустя 24 и 48ч после переноса
не детектировались в лимфоузлах вообще

6.  Перенос радиоактивно
меченых (хром 51)
клеток показал что Des
донорские клетки
вообще никогда не
накапливаются в
лимфоузлах.
Контрастом с отсутствием миграции в лимфоузлы донорских Т клеток
является высокое их содержание в печени мышей В6 и высокий
уровень экспрессии CD69 уже спустя 1 час после переноса, из чего
предполагается что большинство Т клеток входит в печень и
специфически в ней сохраняется после активации in situ.

7. Высокое содержание донорских Т клеток,
сохраняющихся в печени, теряется за первые
22 часа после переноса:
 Число CFSE меченных Des
клеток снижалось на 80-
90% к 22 часу после
переноса
Печень определена как место первичной активации
CD8 Т клеток, ведущей к толерантности, также
известно что наивные CD8 Т клетки после
внутрипечёночной активации погибают по Bim-
зависимому пути в течении 4 суток. Донорские Т
клетки, взятые через 2 суток из печени, показывают
высокой уровень экспрессии Bim. Если гипотеза о
преобладании Bim апоптоза верна — то Des клетки
должны начинать снижать своё количество после 2
суток.

8. Быстрая потеря Т клеток требует
распознавания родственного антигена в печени
и в ней не участвуют лимфоциты рецепиента
 Таким-же образом распределяются и убывают Des клетки в
мышах RAG-1-/- B6 (у которых не функциональны В, Т-клетки
и ЕК), мышах штаммов 178.3 (Β10.ΒR, экспрессирующим Η-
2Κb) и H-2Kb F1, что исключает участие ЕК и аллореактивные
клетки реципиента.
 Эксперимент по вводу OT-I CD8 Т клеток (где
экспрессировались TCR, специфичные к пептиду
овальбумина SIINFEKL) на сингенных мышах В6 вместе с
пептидом и перенос Des CD8 костно-мозговым химерам
178.3, у которых Η-2Κb экспрессировался только в клетках-
производных костного мозга, дал такое-же их распределение
по организму с накоплением в печени и быстрым убыванием
донорских Т клеток, из чего следует необходимость
распознавания антигена в печени.

9. Печёночно-активируемая делеция Т
клеток не зависит от апоптоза и
фагоцитирующих клеток
 Прокрашивание Аннексином 5 не усиливалось через
6 часов, время когда большая часть клеток уже
распалась, что сходится с тем, что апоптоз не имеет
отношения к массовой потере Т клеток.
 Это подтверждает и такая-же скорость распада Т
клеток Bim-/-.
Эффективное подавление макрофагов и
купферовских клеток с использованием
клодронатных липосом и блокирование
потенциально экспонируемых
фосфадитилсеринов на Т клеточной
поверхности с использованием димеров их
лигандов, Дианнексина, не привело к
предотвращению делеции Т клеток.

10. Наивные Т клетки активируются
проникновением в гепатоциты и в них
подвергаются деградации в лизосомах
 Для отслеживания судьбы Т лимфоцитов были
выполнены ультраструктурные исследования с помощью
электронной и конфокальной микроскопии через 3-6
часов после переноса Т клеток.
Лимфоциты
проникли в
гепатоциты и
распадались
в везикулах
за 12 часов.

12. Video 1
Синий DAPI – ядра. У Т
клетки ядро всё ещё
интактно.
Красный анти-LAMP-1 –
лизосом, рассеяна по
цитоплазме гепатоцита.
Зелёный кросс-реактивный
анти-FITC с CFSE – метка
донорских Т клеток.

13. Video 2
 Аналогичный
прокрас.
 DAPI у
лейкоцита
негативно,
ядро уже
разрушего.

14. Т клетки активно проникают
в гепатоциты
 Для изучения эффекта проникновения Т клетки и
гепатоциты кокультивировались и изучались
методами КМ, ПЭМ и СЭМ. Спустя 4 часа
наблюдалось расширение подосомальных
выступов к Т клеткам у гепатоцитов В6. Через 6
часов Т клетки полностью содержались в
больших везикулах внутри гепатоцитов.
 Фиксированные или инактивированные
нагреванием Т клетки не проникали, что говорит
о том, что со стороны Т клетки необходимо
активное участие.

16. Video 3

17. Video 4
Активно проникают в гепатоциты именно сами Т клетки.
Подвижность Des CD8 много выше по сравнению с инертными
гепатоцитами. Главную роль в проникновении Т клеток
подтверждает отсутствие взаимодействия после их инактивации.

18. Т клеточное проникновение в гепатоциты зависит
от активации Т клеток, перегруппировки
цитоскелета и вортманнин-чувствительных киназ
 Для определения молекулярного механизма проникновения
Т клеток в гепатоциты использовалась in vitro система в виде
ко-культуры, в которую добавляли ингибиторы потенциально
важных путей для процесса проникновения, таких как ТКР
передача сигнала, деградация внеклеточного матрикса
(ММР), формирование подосом и адгезии (клапсины), G-
белковый хемотаксис и полимеризация/деполимеризация
клеточного матрикса (актин, миозин).
 Киназа лёгких цепей миозина (MLCK) и ρ-ассоциированная
протеинкиназа 1 (ROCK) — две киназы, в основном
регулирующие клеточное движение и трансэндотелиальный
перенос, к которым есть ингибиторы:
 ML-7, ML-9 и вортманнин для MLCK, Y-27632 и H-1152 для
ROCK.

19. Перебор ингибиторов
 Подавляли проникновение Т клеток in vivo
только ингибиторы активации Т клеток (анти-
CD8 — Дасатиниб), ингибиторы
реорганизации актиновых филаментов
(цитохалазин Д) и вортманнин.

20. Вортманнин увеличивает число Т клеток
в крови и печени, и ведёт к прорыву
толерантности у В6 мышей
 Для проверки того, насколько эффективно вортманнин
ингибирует проникновение Т клеток in vivo В6 мыши
подвергались воздействию его до переноса Des CD8.
Поскольку вортманнин токсичен для организма и вызывает
снижение общего числа лейкоцитов, сравнение велось с
контролем B10.BR, также подвергавшихся вортманнину.
Вортманнин вызывал абсолютное и относительно
повышение содержания донорских Т клеток относительно
контроля В6. При этом Dеs CD8 были примерно также
активированны, как и в негативном контроле В6. На 3 день у
В6 после переноса Des CD8, подвергавшихся обработке
вортманнином наблюдалось развитие срыва толерантности
и тяжёлого аутоиммунного гепатита.

21.  Гистология биоптата печени мышей + и – контроля по Т
клеткам и вортманниму, показатели АлТ, FACS профиль В6
мышей по меченым донорским Т клеткам, распределение
содержания Des CD8 для В6 с + и – Ворт. относительно
содержания в контрольных В10.BR, содержание Т клеток в
печени для всех 4 групп мышей.