1. Faculdade de Ciências e Tecnologias da Universidade Nova de Lisboa
Instituto de Medicina Molecular
Unidade de Bioquímica Física
Desenvolvimento de um sistema transportador de fármacos anti-HIV
que actuam ao nível do envelope viral
Sónia Alves
Projecto
Licenciatura em Bioquímica
Projecto orientado pelo Professor Doutor Miguel A. R. B. Castanho
2013

2. 3
Agradecimentos
Neste projecto tive oportunidade de contar com o valioso apoio de várias pessoas, sem o
contributo das quais este projecto de investigação não teria sido possível.
Nomeio em primeiro lugar o professor Miguel Botas Castanho, orientador deste projecto, a
quem agradeço ter-me dado a oportunidade de integrar o grupo de investigação de sistemas
transportadores de fármacos anti-HIV, que desenvolve os seus trabalhos no Instituto de
Medicina Molecular. O seu curriculum profissional conjugado com o seu prestígio
académico constituem para mim um exemplo e funcionam como incentivo adicional para
seguir esta licenciatura.
De seguida tenho de nomear o Tiago Nascimento Figueira, a quem coube a tarefa de guiar
os meus primeiros passos no acompanhamento desta investigação, pelo apoio e pela
supervisão do trabalho desenvolvido. Agradeço-lhe pela paciência, pela dedicação e pelo
seu exemplo.
Não posso ainda deixar de mencionar todos os outros investigadores do Instituto de
Medicina Molecular que de alguma forma se relacionaram comigo no decorrer deste
projecto. Todos eles foram prestáveis, atentos e conhecedores, contribuindo de forma
sempre positiva para o esclarecimento de dúvidas, para o direccionamento correcto das
minhas opções e para que pudesse efectuar um trabalho melhor.
A todos, o meu apreço por esta oportunidade de aprender e contribuir em projectos de
investigação de tão grande valor.
Neste momento, cabe-me ainda lembrar todos os professores da licenciatura de Bioquímica
na Faculdade de Ciências e Tecnologia. Foram eles que primeiro me transmitiram os
ensinamentos e experiências que agora tentei colocar em prática na elaboração deste
trabalho.
Por fim, e não menos importante, agradeço o apoio incondicional da minha família e o
incentivo que me deram ao longo destes anos. Aos meus amigos mais próximos, aos
colegas de curso mais chegados, agradeço a atenção e o tempo que me dedicaram.
A todos,
Obrigada!

3. 4
Índice
Resumo 7
Introdução 8
Vírus HIV 9
Morfologia do vírus 10
Ciclo de replicação 11
Processo de fusão 12
Estrutura da proteína viral gp 41 13
Lipidoma e interacções lipídicas 14
Inibidores de fusão 15
Single Domain Antibody 15
Enfuvirtide 17
Sifuvirtide 19
LJ001 20
Lipossomas 21
Classificação dos lipossomas 21
Aplicações 21
Lipossomas como sistema de drug delivery 22
Parte Experimental 25
Reagentes e Químicos 25
Preparação de amostras 25
Instrumentação 26

4. 5
Métodos 26
Partição para membranas 26
Anisotropia de fluorescência em estado estacionário 27
Variações no potencial dipolar membranar 27
Resultados 28
Interacção dos Single Domain Antybody com modelos miméticos 28
Interacção do péptido Sifuvirtide com membranas catiónicas 31
Interacção do péptido Enfuvirtide com membranas catiónicas 33
Efeito do LJ001 sobre a rigidez membranar 36
Combinação do Sifuvirtide e LJ001 37
Combinação do Enfuvirtide e LJ001 39
Conclusão 41
Referências 42
Anexos 48

5. 6
Resumo
Em 1965 foram descritos os primeiros sistemas de bicamadas fosfolipídicas fechadas,
denominadas de lipossomas. Durante as últimas décadas desenvolveram-se grandes
avanços nas indústrias médicas e farmacêuticas devido às potencialidades dos lipossomas
como sistemas de transportes de fármacos.
Os lipossomas nas suas várias formas têm a possibilidade de proporcionar a eficácia
terapêutica na área da entrega de drogas e ao mesmo tempo servir a investigação científica
fundamental como modelos simples de sistemas com elevada complexidade.
Neste trabalho estudou-se por métodos de espectroscopia de fluorescência, quais as
melhores composições lipídicas para a interacção de alguns inibidores de fusão do vírus do
HIV, Sifuvirtide, Enfuvirtide e LJ001, com o objectivo de se desenvolver um sistema
combinado de transporte de fármacos (drug delivery) lipossomal. Foi ainda estudada a
interacção de um novo tipo de single domain antibodies (fragmentos de anticorpo)
inibidores da fusão do HIV com modelos membranares lipossomais miméticos para o
envelope viral e células do hospedeiro.
Verificou-se selectividade diferente dos single domain antibodies para membranas com
composições diferentes. A presença de colesterol nas membranas miméticas virais
contribuiu para uma maior afinidade por parte dos anticorpos.
Na presença de misturas de lípidos catiónicos, o Sifuvirtide apresentou resultados
promissores para membranas fluidas, com as quais não possui afinidade na ausência de
carga. Embora tenha demonstrado elevada afinidade para membranas catiónicas, o
potencial de agregação com as vesículas do Enfuvirtide diminui a sua adaptabilidade para o
transporte lipossomal. A capacidade de ambos os péptidos de se combinar com o LJ001 nos
mesmos lipossomas reforça a hipótese colocada para um transportador dual.

6. 7
Summary
In 1965 the first liposomes, suspended bilayered structures composed by lipid molecules, were
described. During the last decades, substantial progress has been made in the pharmaceutical
industry due to the potentials and applicability of liposomes as drug delivery systems.
Liposomes in their various forms have the possibility to provide high therapeutic efficiency to the
targeted delivery of biologically unstable drugs and at the same time serve fundamental scientific
research as relatively simple models of more complex systems.
In the present work we have studied, through fluorescence spectroscopy methodology, how
different lipid compositions suit the interaction of HIV fusion inhibitor molecules Sifuvirtide,
Enfuvirtide and LJ001, for the development of a combined liposomal drug delivery system. We also
studied the interaction of a new type of single domain antibodies that also inhibit HIV entry with
model membranes of the viral envelope and host cell membrane.
Results show the studied single domain antibodies have different selectivity for the models used.
Presence of cholesterol in liposomal models contributed for an increase in antibody interaction
and higher apparent partition to the lipid phase.
In the presence of cationic lipid mixtures, Sifuvirtide presented promising results for fluid phase
liposomes that are unable to induce its partition when neutral. Although cationic liposomes
ensued a high partition of Enfuvirtide, the observation of peptide mediated aggregation of vesicles
in solution compromises its potential for drug delivery in these types of carriers. As both peptides
were able to partition to the same zwitterionic liposomes as LJ001, the hypothesis for a dual
delivery system that combines synergistic inhibitors is reinforce and new approaches become
available.

7. 8
Introdução
O vírus HIV é o responsável pela SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida.
Esta doença surgiu por adaptação do retrovírus SIV que infecta chimpanzés e da África
central, contudo, a doença não se manifestava nestes animais. Supõe-se que, durante muitos
anos, o HIV manteve-se isolado numa pequena percentagem de população africana e os
seus efeitos devastadores não foram suficientes para chamar a atenção do mundo científico.
No entanto, com a mobilidade populacional intensificou-se a transmissão do vírus,
permitindo que este se propagasse e fosse evoluindo por adaptação. Os estudos posteriores
demonstraram que o HIV possuía uma grande capacidade de mutação tendo-se identificado
duas estirpes: o HIV-2, uma versão menos agressiva, e o HIV-1, altamente mortífero.
O vírus HIV foi isolado em 1983, pelos médicos e pesquisadores Robert Gallo (o qual
demonstrou que o vírus era responsável pela SIDA) e Luc Montagnier (responsável pelo
isolamento do vírus).
Actualmente, estima-se que o número de pessoas infectadas por esta doença seja superior a
40 milhões em todo o mundo. Altamente transmissível e sem cura, tem-se apostado no
tratamento com medicamentos anti-HIV com vista á diminuição da quantidade de vírus no
organismo, de forma, a aumentar a qualidade de vida da pessoa infectada, atrasando a
evolução da doença e prevenindo a ocorrência de outras doenças associadas ao vírus –
doenças oportunistas [1]
.
Durante os últimos anos a cura e o tratamento desta doença têm sido as motivações de
trabalho de muitas comunidades científicas. No entanto, a capacidade de mutação do vírus
provocou o surgimento de inúmeras estirpes de HIV, inviabilizando o desenvolvimento de
uma vacina que permita.
Os tratamentos mais usuais são compostos por diferentes classes de medicamentos que têm
por principal objectivo o de retardar os danos causados pelo vírus e reduzir a sua
quantidade na corrente sanguínea - até que a sua detecção seja quase impossível, o que
significa que a reprodução do vírus é mínima e a doença não progride.
Na terapêutica da SIDA [1]
utilizam-se vários tipos de inibidores que actuam em diferentes
fases do ciclo de reprodução do vírus, sendo os mais relevantes:
 Os inibidores de Integrase que impede a inserção do material genético do vírus no
genoma da célula hospedeira.
 Os Inibidores da Transcriptase Reversa, actuam dentro da célula CD4, inibindo esta
enzima, e impedem que o RNA viral seja convertido em DNA viral evitando que
ocorra multiplicação do vírus para contágios de novas células.

8. 9
 Os Inibidores da Protéase, inibem a enzima de clivar poliproteínas impedindo-a de
criar proteínas de menor tamanho e com a conformação desejada pelos viriões do
HIV. Desse modo, ao inibirmos a protéase, os viriões perdem a capacidade de
infectar novas células.
 Os Inibidores de Fusão actuam nas membranas lipídicas do vírus e dos linfócitos
CD4 impedindo a fusão e, por consequência, a passagem do material genético do
vírus para a célula. Sendo estes os inibidores utilizados no trabalho experimental.
Vírus HIV
A Síndrome da Imunodeficiência adquirida (SIDA) foi descoberta em 1981, constituindo-se
como uma grande ameaça para a saúde humana desde então. A causa desta doença seria
identificada em 1983 e, posteriormente, foi nomeado o vírus da imunodeficiência humana
(VIH). O HIV é o retrovírus envelopado, que provoca a infecção principalmente a partir de
células do sistema imunitário - células-T e macrófagos, o que resulta em infecções
oportunistas fatais. [2]
Tratamentos actuais envolvem uma mistura de antivirais combinados, visando a inibição do
vírus nas várias etapas do seu ciclo de vida, aumentado consideravelmente o tempo de vida
dos pacientes e a sua qualidade de vida, porém continua a não estar disponível uma
estratégia eficaz e capaz de erradicar o vírus do organismo. [2]
A magnitude desta epidemia, e o desafio de desenvolver um tratamento eficaz, conduziu a
uma extensa investigação sobre os mecanismos moleculares de compostos que actuam no
ciclo de vida do vírus em diferentes fases.
O HIV-1, a versão mais severa e com taxa de transmissão mais elevada, pertence à família
Retroviridae, género Lentivirus, que inclui os retrovírus com genomas mais complexos.[1] [2]

9. 10
Morfologia do vírus
Figura 1- Estrutura da partícula viral HIV-1 (Adaptado da referência [1] )
O vírião do HIV é formado por uma bicamada lipídica do envelope viral de origem celular
e inclui várias proteínas derivadas da célula hospedeira, incluindo os principais antigénios
de histocompatibilidade, actina e de ubiquitina [3]
.
Associadas ao envelope viral existem dois tipos de glicoproteínas responsáveis pela ligação
a receptores presentes na membrana das células hospedeiras: a glicoproteína externa
(gp120) e a glicoproteína transmembranar (gp41). A glicoproteína externa e a
transmembranar organizam-se em heterodímeros com estrutura trimérica formando os
espigões virais [4]
.
A proteína matriz (p17) reveste a superfície interna da membrana viral, que envolve uma
cápside (p24) de forma icosaédrica que ocupa o centro do virião. No interior da cápside
existem duas cópias de RNA viral de cadeia simples positiva estabilizadas por um
complexo de proteínas da nucleocápside (p7) formando um complexo ribonucleoproteíco
que contém três enzimas essenciais: a protease (RP), a transcriptase reversa (RT) e a
integrase (IN). Na cápside ainda existem outras proteínas virais Nef, Vif, Vpr e Vpu (não
ilustradas na Figura 2).

10. 11
Ciclo de replicação
Figura 2 – representação do ciclo de vida do vírus HIV-1- adaptado da referência [4]
O ciclo de vida pode ser dividido em duas fases. A primeira fase inicia-se com o
reconhecimento da célula alvo pelo virião maduro e envolve todos os processos que
conduzem à integração do DNA viral no cromossoma da célula hospedeira. A segunda fase
designa-se por fase tardia e começa com a expressão regulada do genoma viral integrado e
envolve todos os processos até á maturação do vírus [1]
.
A fase inicial começa com a fusão do invólucro viral e da membrana plasmática da célula
hospedeira. A fusão é mediada pelas proteínas do invólucro viral, gp120 e gp41. A ligação
ocorre através de interacções específicas entre as glicoproteínas do envelope viral e os
receptores de quimioquinas (CCR5 ou CXCR4) presentes nas células. As células
susceptíveis à infecção são as células CD4+, nomeadamente linfócitos T CD4+,
macrófagos, monócitos e células dendítricas. A ligação ao receptor induz uma série de
mudanças estruturais na gp120 que são desencadeadas pela gp41 para expor, estender e
inserir a sua extremidade N-terminal do péptido de fusão hidrofóbico em membranas
celulares. [1] [5]
Após a fusão, a cápside do virião é libertada no citoplasma celular onde sofre desintegração
expondo o seu conteúdo, e o RNA viral é convertido em DNA viral de cadeia dupla,
reacção essa que é catalizada pela enzima transcriptase reversa (RT). O DNA viral de
cadeia dupla é exportado para o núcleo para ser integrado no genoma da célula hospedeira
pela integrase viral, e ser transcrito, pela maquinaria celular.

11. 12
A fase tardia inicia-se com a clivagem das moléculas de RNA viral no núcleo da célula
hospedeira, sendo estas posteriormente transportadas para o citoplasma, onde originam as
proteínas reguladoras Nef, Tat e Rev. [1] [5]
No retículo endoplasmático rugoso, ocorre tradução de RNAm originando a glicoproteína
do invólucro viral (gp160), [6]
que ao sofrer clivagem e origina as proteínas gp41 e gp120 ,
que são incorporadas na região da membrana celular que vai constituir o invólucro externo
do virião. [6]
O RNAm não clivado é retido no núcleo, onde permanece até ser processado ou degradado,
permanecendo latente. A razão pela qual a erradicação do vírus não tem sido possível é
devido a este estado de latência, em células infectadas, durante um longo período de tempo.
Processo de fusão
Como em todos os vírus envelopados, o vírus HIV-1 deve fundir a sua bicamada
fosfolipídica à membrana da célula hospedeira com a finalidade de transportar o seu
genoma viral para o compartimento citoplasmático. A glicoproteína do envelope (env) do
HIV medeia esta entrada através do processo de fusão. Estas glicoproteínas são produzidas
a partir de um precursor, a gp160, que é clivada por uma protease no complexo de Golgi.
Esta clivagem origina uma subunidade exterior, a gp120, e uma porção transmembranar, a
gp41, necessária, mas não suficiente para que o processo de fusão. Após a proteólise, a
gp120 e gp41 permanecem acopladas ao envelope viral como heterodímeros não
covalentes. [6][8][9]
Uma vez presente no organismo, o vírus é reconhecido pelas células dendríticas, formando
um complexo que migra até aos nódulos linfáticos onde é apresentado às células T
ocorrendo transferência do vírus para as células CD4+
por sinapse virológica. Para infectar
as células CD4+
o genoma viral e algumas proteínas virais devem ser transferidas para o
interior da célula, através da fusão das membranas, que leva á formação de um poro na
superfície da membrana celular.
Desta forma, o primeiro passo da fusão é o reconhecimento da gp120 da célula CD4+
e dos
seus co-receptores de quimiocina (CCR5 ou CXCR4 que induzem uma série de mudanças
estruturais na gp120, que causam um rearranjo dos domínios “inner” e “outer” da gp120.
As alterações na gp120, levam á formação á conformação “pre-hairpin” da gp41, ou seja, á
exposição de uma região altamente hidrofóbica da gp41, denominada por péptido de fusão
(extremidade N-terminal) que se insere na membrana celular levando á fusão das
membranas.[8]
Para completar o processo de fusão, a membrana viral tem de assumir
curvatura positiva para que ocorra formação do poro de fusão, e o seu material genómico
entre no citoplasma da célula hospedeira. [4] [9] [10]

12. 13
Figura 3 - Representação do processo de fusão e do mecanismode inibição
Estrutura da Proteína viral gp41
A gp 41 é uma glicoproteína transmembranar com uma estrutura trimérica, constituída por
duas regiões conservadas hidrofóbicas com estrutura de hélice α intercaladas por uma loop:
a região N-terminal ou HR2 (ectodomínio), onde está situado o péptido de fusão (região
hidrofóbica de quinze aminoácidos que está envolvida no processo de fusão), a região C-
terminal ou HR1 (domínio transmembranar que interage com proteína matriz).
No seu estado nativo a gp160 encontra-se numa configuração não-fusogénica, em que a
proteína gp41 está no seu estado nativo e é metaestável, sendo estabilizada pela gp120. No
entanto, verificou-se que alterações conformacionais na gp120 permitem que a gp41
exponha as suas regiões HR1 e HR2 atingindo um estado mais estável. A gp41 enrola-se
numa estrutura hairpin de seis hélices α expondo assim a região HR2, que possui o péptido
de fusão que penetra na membrana do hospedeiro para que ocorra a fusão das
membranas.[1] [12]

13. 14
Lipidoma e interacções lipídicas
Estudos demonstraram que o envelope lipídico do vírus HIV-1deriva da membrana
plasmática da célula do hospedeiro[13]
, devido á presença de elevados níveis de lípidos
encontrados nas membranas celulares, no entanto, existem algumas variações na sua
composição, devido aos elevados teores de colesterol e esfingomielinas.
A membrana celular é composta principalmente por glicerofosfolípidos, esfingolípidos e
colesterol. A presença de elevadas quantidades de colesterol está directamente relacionada
com a baixa fluidez da membrana, pelo que a composição lipídica da célula alvo tem um
papel importante no processo de fusão do HIV, uma vez que foi verificado que o baixo
conteúdo de colesterol pode ser um factor negativo no processo de fusão. A alteração do
teor de glicoesfingolípidos nas células alvo também pode contribuir para a baixa
susceptibilidade á entrada do vírus. Podemos portanto supor que os baixos valores destas
moléculas nas membranas celulares contribuem como um mecanismo de defesa contra
infecções, uma vez, que se encontram altamente presentes nas membranas virais.[11][14]
O colesterol é sintetizado no reticulo endoplasmático e é subsequentemente transportado
para os seus destinos celulares através do complexo de Golgi pela via secretora de
vesiculas. Coincidentemente a síntese e transporte de esfingolípidos também ocorre no
complexo de Golgi. Foi sugerido que a proximidade dos esfingolípidos e do colesterol no
complexo de Golgi pode levar á formação de estruturas precursoras, denominadas de
jangadas lipídicas, que podem ser transportadas para a superfície da membrana em
vesiculas.[15]
Jangadas lipídicas foram propostas para funcionarem como plataformas envolvidas na
transdução de sinal e como veículos de patogenicidade. Vários agentes patogénicos, como o
HIV-1, utilizam estas jangadas lipídicas em várias etapas do seu ciclo de replicação para
obter controlo das células alvo e para exercer os seus efeitos patogénicos. Estudos
verificaram que a depleção de colesterol destabiliza a estrutura do virião, provocando
alterações conformacionais na gp41,provando que o colesterol é essencial para o processo
de fusão, no entanto, isto não significa que o vírus tenha perdido a capacidade de se ligar às
células alvo. [14] [15]
Uma vez que o colesterol desempenha um papel fundamental na manutenção da membrana
das jangadas lipidicas, argumentou-se que a inibição da infecção por HIV-1 pela depleção
de colesterol é devida baixa densidade de co-receptores. No entanto, têm sido oferecidas
explicações alternativas em relação ao papel do colesterol na entrada do HIV-1:
 Colesterol é necessário para o processo de fusão das membranas;
 Colesterol é necessário para a conformação e função adequada do CXCR4;
 Toxicidade após a remoção do colesterol nas células.

14. 15
A dependência das membranas virais por colesterol e esfingomielinas sugere a utilização de
fármacos capazes de perturbar a composição lipídica dos viriões como inibidores da
infecção e do processo de fusão.[16] [17]
Jangadas lipidicas em membranas biológicas apresentaram tamanhos pequenos entre 10 a
100nm devido á presença de proteínas membranares integrais que actuam como barreiras
que limitam o tamanho destes domínios lipídicos. Estas proteínas possuem sequências de
aminoácidos consensos que reconhecem e interactuam com o colesterol e estão envolvidas
na regulação do seu transporte dentro da membrana.[18]
Verificou-se recentemente que a gp41 possui uma região adjacente á extremidade N-
terminal (segmento rico em resíduos de triptofano) termina com uma sequência de 5
aminoácidos (LWYIK) que corresponde ao motivo CRAC. Este motivo é inserido nas
bicamadas lipídicas das células alvo durante o processo de fusão, verificando-se maior
inserção nas bicamadas contendo maior quantidade de colesterol. Mutações na sequência
do motivo CRAC resultaram na perda da captação de colesterol, que no caso do HIV-1é um
factor negativo para a fusão de membranas.
Concluiu-se que a presença de colesterol é essencial para a constituição de jangadas
lipídicas, que contribuem para o aumento da patogenicidade do vírus, e é essencial a sua
presença nas membranas virais e celulares para que ocorra o processo de fusão. [18] [19]

15. 16
Inibidores de fusão
Inibidores de fusão são uma das classe de fármacos anti-retrovirais utilizadas no tratamento
da infecção do vírus HIV. Esta classe de fármacos interfere com a fusão e a entrada do
virião na célula hospedeira devido a alterações conformacionais das membranas virais ou
celulares ou na proteína de fusão. Alguns destes fármacos são produzidos com base nas
sequências das proteínas envolvidas no processo de fusão, que mimetizam regiões dessas
proteínas que competem pelas regiões de ligação, impedindo transições entre a curvatura
positiva para negativa necessárias para que ocorra a fusão das membranas.
Single Domain Antibody
São fragmentos de anticorpos que
consistem num único domínio
monomérico variável.
Os anticorpos são glicoproteínas,
produzidas pelos linfócitos B em
resposta á presença de substâncias
estranhas – os antigénios. As principais
acções dos anticorpos são a
neutralização de toxinas, destruição
celular e fagocitose auxiliada pelo
sistema complemento.
Figura 4 – Representação da estrutura do anticorpo
Os anticorpos encontram-se distribuídos por cinco classes (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE),
sendo esta classificação dependente da região efectora do anticorpo, da posição e do
número de ligações de dissulfureto. [20]
A estrutura do anticorpo é globular, em forma de Y, sendo composto por quatro cadeias
polipeptídicas interligadas e idênticas duas a duas. Possui duas cadeias pesadas (H) e duas
cadeias leves (L) distintas pelo número e sequência de aminoácidos.A cadeia leve de um
anticorpo consiste numa região variável (V) e numa região constante (C) que contêm,
respectivamente, as extremidades amina (NH2) e carboxilo (COOH).
Cada cadeia pesada é constituída na porção N-terminal por um domínio variável (VH ) e
um domínio constante (CH1 ) ligados por uma porção C-terminal constituída por dois
domínios constantes (CH2 e CH3 ). Cada região variável contém três sub-regiões em
forma de ansa, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR1,

16. 17
CDR2 e CDR3), que reconhecem e ligam-se especificamente a um determinado
antigénico, formando um complexo antigénio-anticorpo ou complexo imune.
A região do antigénio reconhecida pelo anticorpo é denominada de epítopo, enquanto a
região do anticorpo que reconhece o antigénio é o paratopo.
O tratamento com uma protease permite a clivagem desta região originando o Fab
(fragment antigen binding) e o Fc (constant region) que interage com a superfície das
células. (Imagem em anexo)
Fragmento Fab é composto pela cadeia L inteira e pelo domínio da cadeia H que contém a
extremidade amina, enquanto o Fc engloba os segmentos de ambas as cadeias H em que
estão as extremidades carboxilo. O Fc não está envolvido na especificidade do anticorpo ao
antigénio, mas exerce funções de efector, tais como a fixação a proteínas do sistema de
complemento.
Como foi referido em cima, a maioria dos anticorpos são compostos por duas cadeias
pesadas e duas leves e ambas as cadeias, na sua região variável contribuem com dois locais
de ligação ao antigénio. Além destes anticorpos convencionais os camelos, tubarões, lamas
produzem anticorpos incomuns compostos apenas por cadeias pesadas, com o domínio
variavel constituído por três CDR e não possuem o domínio CH1. Portanto, o local de
ligação ao antigénio é formado por um único domínio, Fc. O domínio variável é designado
VHH para camelos e VNAR para tubarões, mas mais geralmente, anticorpo de domínio
único (single domain antibody). [20] [21]
Contrariando o esperado estes anticorpos apresentam um nível de afinidade similar aos
anticorpos no seu formato original, sendo os três CDR suficientes para o reconhecimento
do antigénio.
Os sdAbs (single domain antibody) são os anticorpos com menor massa molecular
(~15kDa), o que lhes confere características vantajosas como a elevada solubilidade e
estabilidade térmica, a capacidade de re-enrolamento e a boa penetração no tecido in vivo
possibilitando a sua aplicação em tratamentos e diagnósticos bem como a produção e
manipulação rentável e eficiente em larga-escala (elevados níveis de expressão em
bactérias e leveduras).
Os sdAbs são uma grande expectativa para a elaboração de uma vacina, pois o seu tamanho
reduzido permite-lhes que se liguem a antigénios de difícil acesso, como o HIV-1. No
entanto, o seu tamanho reduzido também pode ser uma desvantagem in vivo, pois são
rapidamente eliminados pelo sistema. A solução encontrada seria a formatação dos sdAbs
em multímeros de forma a aumentar a sua massa molecular. [21] [23]
Pretende-se com a utilização destes anticorpos inibir a entrada do HIV-1 na célula
hospedeira, através do bloqueio das alterações conformacionais que ocorrem no gp41

17. 18
durante o processo de fusão. As alterações conformacionais que ocorrem na gp41 durante o
processo de fusão conduzem à exposição de zonas conservadas, tais como a região HR1,
permitindo a inibição por parte dos anticorpos mais precisamente nesta região.
Enfuvirtide
O Enfuvirtide, também designado por T-20, DP178 e Fruzeon, é um dos primeiros
inibidores de fusão utilizados no tratamento da infecção do HIV e o único aprovado pela
FDA para ser comercializado. [24]
O Enfuvirtide é um péptido sintético com 36 aminoácidos, que previne a fusão do envelope
viral com a célula CD4 inibindo a acção da gp41, ou seja bloqueando as alterações
estruturais necessárias para que ocorra a fusão, e é administrado por injecção cutânea. [25]
O ectodomínio da gp41 contém duas regiões de heptad repeat: HR1 ou terminal NHR, e
HR2 ou terminal CHR. Estas duas sequências foram modeladas para péptidos sintéticos se
associarem numa estrutura secundária em hélicesα. Estudos de cristalografia raio-X da
gp41 mostram que os dois domínios de repetição contêm três membros (um trímero) em
cada domínio, sugerindo que o trímero tem um papel importante nas mudanças
conformacionais essenciais para a fusão da membrana de HIV-1 com as células do sistema
imunitário.[6]
O Enfuvirtide possui uma parte da sequência igual à região HR2 da gp41 e por isso, liga-se
à cadeia complementar do gp41 (HR1) bloqueando a formação do domínio de seis hélices
(six hélix bundle), prevenindo a progressão da conformação do pré-hairpin, resultando na
inibição da fusão das membranas. O péptido contém uma parte da região NHR e do
domínio lipid-binding, mas carece do domínio pocket-binding, bloqueando a fusão das
membranas ligando a sua sequência N-terminal à gp41 e o seu C-terminal à membrana da
célula. [24] [26]
A sequência de Enfuvirtide e o seu arranjo numa eventual hélice-α (Figura 1), com
segmentos anfipáticos, sugere claramente que pode interagir com as membranas biológicas.
Estas interacções permitem definir um sistema lipossomal capaz de transportar o péptido
até ás membranas onde deverá actuar [27]

18. 19
Figura 5 – Mecanismo de actuação do inibidor de fusão, Enfuvirtide, na inibição do vírus HIV.

19. 20
Sifuvirtide
O Sifuvirtide é um péptido inibidor de fusão de segunda geração com uma eficácia
melhorada e com resultados clínicos promissores. É um péptido com propriedades
antivirais, constituído por 36 aminoácidos, com carga formal negativa. [28] [29] [30]
O efeito anti-viral do péptido é proveniente da similaridade das sequências de aminoácidos
comuns á glicoproteína gp41 do envelope viral, bloqueando a formação dos 6 hélices que
permitiriam a fusão das membranas. Um dos obstáculos para o tratamento do HIV-1 é a sua
variabilidade genética extremamente elevada, o que resulta em três grupos principais com
diversos subtipos e formas recombinantes. Assim, o Sifuvirtide está um pouco limitado,
ainda que inclua um grande painel de subtipos do vírus HIV-1, os quais representam a
grande maioria das infecções em todo o mundo.
Verificou-se que o Sifuvirtide não particiona para membranas compostas por POPC e
membranas de POPC/Colesterol, possuindo maior afinidade para membranas compostas
por fosfolípidos de colina mais rígidas, como o DPPC, sendo um dos lípidos mais comuns
na constituição das jangadas membranares dos vírus. Outra das propriedades deste inibidor
de fusão é que possui maior afinidade para membranas catiónicas e as interacções são
mediadas por forças electrostáticas. [28][29][31]
Viu-se uma oportunidade de utilizar estes lípidos como
transportadores do péptido aniónico para as membranas
celulares e os envelopes virais, com vantagens sobre a
estabilidade e eficácia do medicamento.
Constata-se, assim, que o Sifuvirtide constitui uma boa
alternativa ao Enfuvirtide, por possuir uma maior actividade
inibitória e uma menor toxicidade.
Figura 6-Estrutura secundária do
Sifuvirtide

20. 21
LJ001
O LJ001 é uma molécula anfipática, de pequenas dimensões, derivada da rodanina, que é
derivada de tiazolidinas presentes, na proteína NS5A do vírus da Hepatite C. O LJ001 actua
sobre as membranas lipídicas constituintes das capsulas virais, inibindo a sua capacidade de
fusão vírus-célula. Alguns dos vírus susceptíveis á acção antiviral do LJ001 são o HIV-1, o
Influenza A, Vírus da Hepatite C, Ebola, e outros. A LJ001 intercala em bicamadas
lipídicas, provavelmente através do anel fenilo na sua extremidade não-polar, e posiciona o
seu farmacóforo na extremidade polar oposta à actividade. Os danos provocados pelo
LJ001 afectam a fluidez das bicamadas lipídicas comprometendo a sua capacidade para
sofrer transições entre a curvatura positiva para negativa necessárias para que ocorra a
fusão e pode ainda representar um mecanismo de inibição viral com alvo um largo espectro
de vírus envelopados.[32][33]
Os vírus envelopados replicam-se dentro das células hospedeiras, recrutando as suas
próprias proteínas, e acumulam-se junto à membrana do hospedeiro onde, por endocitose,
são libertadas em vesiculas, servindo como veículo de transporte de DNA viral para a
próxima célula a ser infectada. Embora a membrana lipídica viral derive da do hospedeiro,
esta não possui algumas das propriedades bioquímicas e biofísicas das membranas
celulares, como por exemplo a capacidade de reparação da membrana.
A actividade do LJ001 é dependente da luz e presença de oxigénio molecular e tem como
alvo cadeias insaturadas dos fosfolípidos. O LJ001 medeia a oxidação com radicais de
oxigénio, que reagem com as ligações duplas (alcenos) das cadeias insaturadas dos ácidos
gordos, que resultam em fosfolípidos com grupos hidroxilos no meio da cadeia dos ácidos
gordos. Estas alterações têm um impacto negativo nas membranas virais, afectando a
fluidez (aumento da rigidez). [32][33]
Desta forma, crê-se que o LJ001 actua como um fotossensibilizador lipofílico, nas
membranas virais e não nas celulares isto porque as células têm múltiplos mecanismos
endógenos de cito-protecção contra hidroperóxidos de fosfolipídios, conseguindo por isso
superar os danos oxidativos feitas por LJ001 na membrana celular. [33]
O LJ001 não possui intensidade de fluorescência em solventes aquosos mas possui elevada
intensidade de fluorescência quando inserido em meios lipídicos intactos, permitindo assim
a utilização de técnicas de espectroscopia de fluorescência na detecção da interacção da
molécula com as membranas.
Um das vantagens do uso deste antiviral é sua capacidade de limitar o desenvolvimento de
resistência por parte dos vírus, embora, ainda estejam a decorrer estudos para o comprovar.

21. 22
Lipossomas
Estas vesículas podem ser definidas como associações coloidais de lípidos anfipáticos,
organizadas em estruturas fechadas e esféricas, podendo ser de origem natural ou formadas
a partir de lípidos sintéticos, disponíveis comercialmente.
Os lipossomas revelam potencial para transporte de fármacos até às células alvo,
apresentando as seguintes vantagens: acesso a locais antes inacessíveis; protecção contra
deposição indesejada; velocidade de transporte controlada; menor quantidade do princípio
activo. [34]
O objectivo destes transportadores é aumentar o potencial terapêutico de um composto,
impedindo que este se perca no trajecto para um alvo específico, evitando simultaneamente
a ocorrência de efeitos secundários nocivos noutra parte do organismo. Contudo, até hoje,
nenhum sistema estudado conseguiu cumprir eficazmente este objectivo, de modo a ser
largamente aceite pela indústria farmacêutica. [35][36]
Neste trabalho, a produção de lipossomas como modelos miméticos das membranas virais e
celulares permitiu observar qual a membrana que os inibidores fusão melhor se inserem.
Classificação dos Lipossomas.
Os lipossomas podem ser classificados pelo número de bicamadas presentes na vesícula,
pelo método da sua preparação, ou pelo seu tamanho, no entanto, as classificações mais
comuns para descrever os lipossomas são pela lamelaridade e tamanho.
Quando os lipossomas são descritos com base no número de bicamadas são denominados
por Vesículas unilamelares (ULV) ou vesículas multilamelares (MLV), Vesículas de
evaporação de fase reversa (REV) ou Vesículas de prensa francesa (FPV)
Quando a descrição é feita com base no método de preparação é-lhes atribuída a designação
de Vesículas de Injecção de Éter (EIV).
Já quando a descrição é feita com no seu tamanho as designações utilizadas são de grandes
vesículas unilamelares (LUV) ou vesículas unilamelares pequenas (SUV). [37][38]
Esquema representativo das características e utilizações dos lipossomas encontra-se em
anexo.
Aplicações
Os lipossomas têm provado durante os últimos anos serem úteis em várias áreas:
 Aplicações biomédicas
 Aplicações nas indústrias de cosméticos
 Aplicações indústrias agrícolas e pecuárias.

22. 23
No entanto, a área de maior interesse científico tem sido na utilização como sistemas
transportadores de fármacos com aplicações em tratamentos e diagnóstico de tumores e
infecções. Em aplicações clinicas, os lipossomas têm provado ser muito úteis devido á sua
capacidade de incorporação de fármacos, independentemente da sua carga ou massa
molecular e por reduzirem os efeitos secundários dos fármacos encapsulados em relação às
drogas livres. No entanto, índices terapêuticos (medição da eficácia sobre a toxicidade)
revelaram que os ganhos devem-se mais á redução da toxicidade do que á eficácia. Isto
porque os lipossomas são retidos nos tecidos endoteliais nas junções selantes e são expostos
a vários agentes de defesa do organismo que tendem a reduzir a sua presença no organismo,
comprometendo muitas das suas aplicações. Ainda assim, a sua depuração tende a ser mais
lenta que no caso de fármacos livres.

23. 24
Lipossomas como sistemas de drug delivery
Apesar dos avanços médicos em prolongar a vida das pessoas mantém-se as dificuldades no
tratamento da doença. O problema do contágio continua a ser a grande limitação, a que se
associa o aumento do número de estirpes com resistência aos antivirais, a dificuldade de
distribuição dos medicamentos e as perdas de efeito destes por acumulação ou rápido
metabolismo.
Desta forma, tem-se procurado desenvolver um sistema capaz de transportar compostos
terapêuticos até aos alvos específicos, evitando efeitos indesejáveis como perdas do agente
terapêutico por retenção ou degradação devido á acção de outros compostos. Porém, por
mais atractivos e simples que possam parecer, são muito poucos os sucessos até agora
obtidos. [34][35][36]
Em 1965, davam-se os primeiros passos nesta área, com a publicação por Alec Bangham e
colaboradores de um trabalho de investigação sobre a difusão de iões através de membranas
lipídicas artificiais, ainda que sem qualquer ligação ao sistema transportador de fármacos.
As estruturas fosfolipídicas viriam a ser designadas por lipossomas que passariam a servir
de modelo para o estudo de membranas biológicas. Em 1971, estas vesículas passaram a ser
utilizadas para fins médicos e farmacológicos, após o sucesso na incorporação de enzimas
nos lipossomas.[35]
Os lipossomas são formados espontaneamente quando os fosfolípidos estão dispersos num
meio aquoso, ocorrendo um rearranjo em que as cabeças polares dos lípidos ficam rodeadas
pela água, mantendo as cadeias apolares e hidrofóbicas protegidas no interior, resultando na
formação de vesículas esféricas multilamelares e unilamelares.
A utilização de lipossomas como veículos de fármacos exige a preparação e a
caracterização das vesículas de lipossomas de forma a garantir uma boa distribuição, com
dimensões adequadas para aprisionar no seu interior os medicamentos e sem acumulação de
drogas no organismo. [34]
Nos poucos estudos sobre a distribuição das vesiculas nos tecidos, em que o tamanho dos
lipossomas foi variado, verificou-se que as pequenas vesículas unilamelares sonicadas
apresentavam uma semi-vida mais longa em circulação do que as vesículas multilamelares,
e grandes quantidade de vesiculas multilamelares de maiores dimensões no organismo
acumulavam-se nos tecidos pulmonares.
Concluiu-se, através destes estudos, a importância de definir o tamanho das preparações de
lipossomas, levando à invenção de um método conveniente para a produção de vesículas
multilamelares com distribuição de tamanhos reprodutíveis e bem definidos. Para obter este
resultado, recorreu-se ao método de extrusão sequencial de vesículas multilamelares através
de uma membrana de policarbonato com poros de diâmetro menor.

24. 25
A extrusão de lipossomas representa assim uma primeira tentativa para produzir uma
população de vesículas unilamelares com uma distribuição de tamanho bem definido e
caracterizado. A extrusão é conveniente e facilmente reprodutível, não introduzindo
impurezas nas vesículas, e não induzindo a repartição dos fosfolípidos. As vesículas podem
ser extrusadas através de membranas de 0,2 pm, permitindo a produção de uma preparação
estéril para injecção in vivo.

25. 26
Parte Experimental
Reagentes e Químicos
Os sdAb F63, F63-MPR e F63-CRAC foram expressos e purificados pelo grupo do
Professor João Gonçalves (Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa) em
colaboração com a Unidade de Bioquímica Física. O péptido Sifuvirtide foi encomendado à
Bachem AG (Bubendorf, Suíça) e o péptido Enfuvirtide foi amavelmente cedido pela
Roche (Palo Alto, Califórnia, EUA). A molécula de LJ001 foi sintetizada e amavelmente
cedida pelo grupo do Professor Benhur Lee (Universidade da Califórnia, LA).
Os lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (POPC), 1-palmitoil-2-
oleoil-sn-glicero-3-etilfosfatidilcolina (EPOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-
fosfatidilcolina (DPPC) e 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfatidilcolina (EDPPC) foram
comprados à Avanti Polar Lipids (Alabaster, US-AL) enquanto que o colesterol (Chol) foi
comprado à Sigma Aldrich (St. Louis, US-MO). As sondas difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH)
e 4-[2-[6-(dioctilamino)-2-naftalenil]etenil]-1-(3-sulfopropil) (di-8-ANEPPS) foram
também compradas à Sigma. O L-triptofano (Trp), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N′-2-
etanosulfonico (HEPES), NaCl, dimetil sulfóxido (DMSO) e clorofórmio (os últimos dois
de grau espectroscópico) foram comprados à Merck (Darmstadt, Alemanha). O glicerol
usado é da VWR (Radnor, US-PA).
Preparação de amostras
As soluções stock de Sifuvirtide (1mg/mL), Enfuvirtide (1mg/mL) e Trp (3.6mM)
foram preparadas com um tampão HEPES 10mM a pH 7.4, com uma concentração salina
de 150mM NaCl (tampão de amostra). As soluções stock de sdAb F63 (10µM) F63-MPR
(42 µM) e F63-CRAC (25 µM) foram mantidas em tampão de amostra com 5% de glicerol.
A molécula de LJ001 (10mM) e a sonda DPH (8mM) foram solubilizadas em DMSO
enquanto que a sonda ANNEPS (1mg/mL) foi solubilizada em etanol.
As suspensões de LUV foram preparadas pelos procedimentos descritos
previamente na literatura [39] [40] [41]
. Resumidamente, a formulação lipídica foi primeiro
dissolvida em clorofórmio num balão de fundo redondo. Formou-se um fino filme lipídico
por evaporação do solvente sob fluxo de azoto e secagem em vácuo (overnight). A
ressuspensão do lípido foi feita com tampão de amostra seguido de 8-10 ciclos de
congelação e descongelação rápida. Esta resultante suspensão de MLV foi extrusada por
uma membrana de policarbonato Nuclepore da Whatman/GE Healthcare (Kent, Reino
Unido) com poros de 100nm de diâmetro. As formulações de LUV preparadas foram
POPC, DPPC, misturas de POPC:EPOPC e DPPC:EDPPC na gama de (4:1), (3:1), (2:1) e

26. 27
(1:1) e POPC:Chol (2:1). O tampão de amostra foi utilizado para preparar todas as restantes
amostras a não ser que mencionado o contrário.
Instrumentação
Medidas de absorvência foram realizadas num esptrofotómetro Genesys 10UV-
Visible da Thermo Fisher Scientific (Waltham, US-MA). Medidas de fluorescência em
estado estacionário foram realizadas num espetrofluorímetro Cary Eclipse da Varian
(Mulgrave, Austrália) para ensaios com os sdAb e LJ001 e num espetrofluorímetro da série
FLS920 da Edinburgh Instruments (Livingston, Reino Unido) para ensaios que envolveram
os péptidos. Em ambos os fluorímetros as medições foram feitas a 25ºC. Foram utilizadas
cuvettes de quartzo da Hellma Analytics (Müllheim, Alemanha) com percurso óptico de
0.5cm em todos os ensaios.
Extrusão das suspensões de MLV foi realizada num Mini-Extruder com suporte
para aquecimento da Avanti.
Métodos
Partição para membranas
LUV de uma solução stock à concentração de 15mM foram adicionadas
cumulativamente a amostras de Sifuvirtide (15µM), Enfuvirtide (10µM), F63 (13µM), F63-
MPR (13µM) e F63-CRAC (13µM), atingindo-se concentrações finais na gama de 0-5mM
como descrito na Tabela A1 (anexos). Permitiu-se um tempo de incubação de 10min entre
cada adição. Para os ensaios em que as LUV foram pré-incubadas com LJ001, a razão
molécula/lípido utilizada foi de 1/150 (0.66 mol% de LJ001 relativamente à concentração
stock de LUV).
A extensão de partição foi acompanhada por medidas da fluorescência em estado
estacionário do triptofano presente nos péptidos e sdAb, para cada concentração de lípido.
O comprimento de onda de excitação (λexc) utilizado foi 280nm e os espectros foram
traçados de 300 a 450nm. A intensidade de fluorescência foi corrigida para a diluição da
amostra, background, e dispersão da luz. [41]
Os coeficientes de partição (Kp) foram
determinados pelo ajuste da equação 1 aos dados experimentais [43] [44]
:
[ ]
[ ]

27. 28
onde IW e IL correspondem, respectivamente, à intensidade de fluorescência da amostra em
meio aquoso e em concentrações de lípido saturantes, γL é o volume molar do lípido e [L] é
a concentração de lípido.
Nos ensaios de partição dual de péptidos e LJ001 para a mesma membrana, o
espetro de emissão da molécula foi recolhido dos 480 aos 580nm, fixando o λexc nos
450nm.
Anisotropia de fluorescência em estado estacionário
LUV de POPC e DPPC a 3mM foram incubadas durante 15min com a sonda DPH
numa proporção molar final de 1/150 (0.66 mol% de DPH relativamente à concentração de
lípido na amostra). A molécula de LJ001 foi titulada da solução stock (10mM) para as LUV
marcadas atingindo concentrações finais na gama de 0-140µM, como descrito na tabela A2.
Para cada adição a amostra foi deixada a incubar durante 10min.
Um λexc de 350nm e um comprimento de onda de emissão (λemi) de 450nm foram
utilizados para, respectivamente, excitar e recolher a emissão polarizada da sonda. A
anisotropia em estado estacionário (<r>) da emissão do DPH foi calculada, para cada
concentração final de LJ001, através da equação 2:
onde Ivv e Ivh representam respectivamente a intensidade de fluorescência detectada nos
polarizadores vertical ou horizontal, com excitação polarizada vertical e G (G=Ihv/Ihh) é um
factor de correcção geométrico intrínseco ao aparelho.
Variações no potencial dipolar membranar
A sonda di-8-ANEPPS foi incubada overnight e em agitação com LUV numa
proporção molar de 1/50 (2 mol% de sonda relativamente à concentração de lípido), de
modo a assegurar incorporação eficiente. Os ensaios foram realizados com concentrações
finais de 200µM para as LUV, 4µM para a sonda di-8-ANEPPS, e 10µM para F63, F63-
MPR e F63-CRAC. Após adição do respectivo sdAb a amostra foi incubada durante 10min,
antes de serem analisadas.
As variações no potencial dipolar membranar, resultantes da interacção das
moléculas com a membrana, foram monitorizadas pelos desvios no espetro de excitação da
sonda. Estes espetros foram recolhidos entre 380 e 580nm fixando um λemi de 670nm,
posteriormente corrigidos para o background e subtraídos ao espetro controlo da sonda e
lípido sozinhos (considerando as mesmas concentrações finais relativas).

28. 29
Resultados e Discussão
Interacção dos Single Domain Antybody com modelos miméticos
Figura 7 - Interacção dos sdAb com modelos membranares. Partição de 13µM de F63(●), F63-MPR(■) e
F63-CRAC(▲) seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano, durante a titulação de pequenos volumes
de POPC (A) e POPC:Chol (2:1) (B) LUV. As curvas representam o melhor ajuste dos dados experimentais à
equação (1).
Quadro 1 - Coeficientes de Partição aparentes da interacção dos sdAb com modelos
membranares
Kp
app
x 10-3
(± SD)
F63 F63-MPR F63-CRAC
POPC 0.36 (± 0.2) 0.74 (± 0.1) 0.76 (± 0.2)
POPC:Chol (2:1) 1.66 (± 0.6) 2.58 (± 0.5) 2.47 (±0.3)
A B

29. 30
Figura 8 – Variações no potencial dipolar membranar. Espetros de excitação diferenciais da sonda di-8-
ANEPPS (4µM) inserida em 3mM de POPC (A) e POPC:Chol (2:1) (B) LUV após interacção com 10µM de
F63 (−), F63-MPR (−) e F63-CRAC (−). Cada espetro foi normalizado pela sua área total individual.
A partir da fluorescência intrínseca do triptofano, resíduo esse que se encontra presente nas
sequências dos anticorpos, podemos verificar que ocorre interacção de todos os anticorpos
com os modelos membranares independentemente da constituição da membrana lipídica ou
da utilização de motivos MPR e CRAC. Podemos observar diminuição do rendimento
quântico do triptofano, o que aponta para a ausência do seu efeito directo quando inserido
na membrana, podendo estar a ocorrer um fenómeno de quenching intramolecular por um
resíduo próximo na estrutura tridimensional da proteína, que é potenciado por modificações
conformacionais resultantes da interacção com os lipossomas.
Através do ajuste da equação (1), foi possível retirar os valores de Kp, que devem ser
tomados como aparentes, uma vez que a interacção dos anticorpos não envolve
directamente os resíduos de triptofano. Um aumento da interacção é verificado pelo
aumento destes valores para membranas com colesterol, que resultam da afinidade
intrínseca dos anticorpos para membranas virais.
Ocorreu maior interacção para os motivos MPR e CRAC em membranas com colesterol do
que para o F63, no entanto, o efeito não foi significativo sobre a dinâmica de
partição/interacção.
Pela sonda ANEPPS observa-se igualmente interacção dos vários anticorpos com ambos os
modelos membranares. Observa-se alteração do potencial dipolar das membranas a partir
da sonda ANEPPS, porém não é possível inferir directamente que haja partição, devido á
baixa magnitude do sinal. Este tipo de ensaios foi realizado meramente para confirmar a
interacção do ponto de vista do lípido, observada quando seguimos a fluorescência
intrínseca do triptofano, nos ensaios prévios.
Entre anticorpos verificou-se um ligeiro aumento da intensidade para os motivos MPR e
CRAC, enquanto o sinal extremamente baixo do F63 poderá ser explicado por precipitação
do anticorpo na amostra, que perde a estabilidade com o tempo e leva á diminuição da
concentração em solução e consequentemente á diminuição do sinal obtido pela sonda.
A B

30. 31
Em membranas com colesterol podemos observar um ligeiro aumento do sinal para
anticorpos que possuem motivos estruturais. Uma vez que no ensaio prévio, o F63 interage
com membranas com colesterol, não é possível atribuir este comportamento directamente á
presença dos motivos estruturais mas não podemos excluir essa possibilidade.
De forma a confirmar estes resultados, dever-se-ia proceder a uma melhor purificação dos
anticorpos e repetir os ensaios anteriores. No entanto, a produção destes anticorpos é feita
por um grupo exterior a este instituto, que não enviou a tempo um novo stock de anticorpos
que permite-se realizar replicados.
Interacção do péptido Sifuvirtide com membranas catiónicas
Figura 9 - Interacção do péptido Sifuvirtide com LUV. Partição de 15µM de Sifuvirtide seguida pela
fluorescência intrínseca do triptofano durante a titulação de pequenos volumes de misturas lipossomais de
POPC (A) e DPPC (B) com percentagens crescentes de EPOPC E EDPPC (0, 20, 25, 33 e 50%),
respectivamente. As curvas representam o melhor ajuste dos dados experimentais à equação (1).
A
B

31. 32
Quadro 2 - Coeficientes de partição da interacção do Sifuvirtide com misturas lipossomais
catiónicas.
O Sifuvirtide adsorve na superfície de membranas de fase DPPC gel, mas não interagem de
forma significativa com membranas constituídas por POPC fluido, não sendo observada
nenhuma mudança significativa na intensidade de fluorescência. O POPC serviu como
controlo negativo nesta experiência inicial, uma vez que não existe qualquer interacção do
péptido com este lípido.
No entanto, para bicamadas em fase DPPC gel, foi observado um aumento significativo da
intensidade de fluorescência, devido á preferência do Sifuvirtide por membranas rígidas.
No gráfico B, a presença e aumento da concentração de lípido catiónico num lípido para o
qual o Sifuvirtide não apresentava qualquer afinidade (Kp≈0) torna-se suficiente para que
ocorra partição.
A adição de lípido catiónico aos ensaios permitiu a observação de maior interacção do
Sifuvirtide para com as membranas, devido às interacções electrostáticas entre as
membranas e a carga negativo do péptido. Com o aumento da percentagem de lípido
catiónico verificou-se o aumento da partição, no entanto, também é possível observar picos
de saturação que fogem ao ajuste da recta (linhas a tracejado e sua inexistência),
possivelmente provocados pela agregação das vesiculas em torno do péptido, quando a
concentração lipídica face á concentração do péptido é muito elevada. A agregação das
Kp x 10-3
(±
SD)
POPC *
POPC:EPOPC
(4:1) 0.02 (± **)
POPC:EPOPC
(3:1) 0.14 (± **)
POPC:EPOPC
(2:1) 0.14 (± 0.03)
POPC:EPOPC
(1:1) 2.12 (± 0.4)
DPPC *
DPPC:EDPPC
(4:1) 0.03 (± **)
DPPC:EDPPC
(3:1) 0.19 (± **)
DPPC:EDPPC
(2:1) 0.59 (±0.07)
DPPC:EDPPC
(1:1)
*
* Não foi possível ajustar a equação (1)
** Número de replicados insuficiente.

32. 33
vesiculas induz um aumento da hidrofobicidade do meio que leva a um aumento da
estabilização do péptido, ocorrendo um máximo de rendimento quântico. Com a adição de
lípido, ocorre um aumento de carga positiva que provoca uma diminuição da estabilização
dos agregados por repelência entre as cargas, expondo o péptido a regiões menos
hidrofóbicas, observando-se a diminuição do rendimento quântico do péptido.
Embora o péptido particione significativamente melhor para membranas de DPPC,
observou-se maior agregação para razões péptido/lípido superiores, desta forma, a adição
de lípido catiónico às membranas de POPC, parece ser mais adequada para efeitos de
fusão/transfecção pela ausência de fenómenos de agregação e pela eficiência intrínseca que
lípidos em fase fluida possuem para processos de fusão, o que poderá adequar este modelo
para o delivery do Sifuvirtide directamente ao vírus.
Apesar de membranas fluidas aumentarem a eficiência, isto não é um factor essencial para
que haja fusão, uma vez que a rigidez, não é impeditiva para que ocorra fusão, apenas
existe mais tensão na transição da curvatura membranar de positiva para negativa.
Interacção do péptido Enfuvirtide com membranas catiónicas
Figura 10 - Interacção do péptido Enfuvirtide com LUV. Partição de 10µM de Enfuvirtide seguida pela
fluorescência intrínseca do triptofano durante a titulação de pequenos volumes de misturas lipossomais de
POPC (A) e DPPC (B) com percentagens crescentes de EPOPC E EDPPC (0, 20, 25, 33 e 50%),
respectivamente. As curvas representam o melhor ajuste dos dados experimentais à equação (1).
A
B

33. 34
Quadro 2 - Coeficientes de partição da interacção do Sifuvirtide com misturas lipossomais
catiónicas.
Na presença de LUV de POPC e DPPC, a intensidade de fluorescência do Enfuvirtide
aumenta, o que significa que os resíduos de Triptofano estão a ser incorporados
progressivamente nas membranas, devido ao ambiente hidrófobo.
O Enfuvirtide prefere membranas fluidas (POPC) a membranas rígidas (DPPC),embora não
seja significativo uma vez que a extensão da partição é semelhante para ambos os lípidos,
variando apenas o perfil.
Observam-se fenómenos de agregação para ambos os lípidos, sendo esse fenómeno menor
para membranas fluidas. Este fenómeno, tal como referido para o Sifuvirtide, corresponde a
um máximo de rendimento quântico, devido á estabilização da carga do péptido pelas
cargas positivas dos lípidos catiónicos.
Com a adição de lípido catiónico verificou-se um aumento da extensão da partição para
POPC e DPPC, o que já era expectável uma vez que essa interacção já ocorria sem a sua
presença. Observou-se ainda que para a mesma proporção de lípido catiónico as
membranas de POPC possuem uma extensão da partição mais elevada que em membranas
de DPPC.
Kp x 10-3
(±
SD)
POPC 1.25 (± 0.2)
POPC:EPOPC
(4:1)
10.5 (± **)
POPC:EPOPC
(3:1)
22.7 (± **)
POPC:EPOPC
(2:1)
*
POPC:EPOPC
(1:1)
*
DPPC 0.23 (± 0.08)
DPPC:EDPPC
(4:1)
*
DPPC:EDPPC
(3:1)
*
DPPC:EDPPC
(2:1)
*
DPPC:EDPPC
(1:1)
*
* Não foi possível ajustar a equação (1)
** Número de replicados insuficiente.

34. 35
Para fins de vectorização de Sifuvirtide e Enfuvirtide deverá sempre ter-se em conta uma
razão péptido/lipído catiónico, que equilibre a partição do péptido com a agregação
lipossomal (longe dos picos de rendimento quântico). Isto possibilitará maximizar a
partição de péptido para a superfície dos lipossomas minimizando a agregação mediada
pela carga do próprio péptido. Desta forma, devemos minimizar os agregados lipossomais
para obter uma boa distribuição no organismo.
Quadro 2 - Resumo dos coeficientes de partição obtidos nos ensaios com os péptidos
Sifuvirtide e Enfuvirtide.
Kp x 10-3
(± SD)
Sifuvirtide Enfuvirtide
POPC * 1.25 (± 0.2)
POPC:EPOPC
(4:1) 0.02 (± **)
10.5 (± **)
POPC:EPOPC
(3:1) 0.14 (± **)
22.7 (± **)
POPC:EPOPC
(2:1)
0.14 (±
0.03)
*
POPC:EPOPC
(1:1) 2.12 (± 0.4)
*
DPPC *
0.23 (±
0.08)
DPPC:EDPPC
(4:1) 0.03 (± **)
*
DPPC:EDPPC
(3:1) 0.19 (± **)
*
DPPC:EDPPC
(2:1) 0.59 (±0.07)
*
DPPC:EDPPC
(1:1)
* *
* Não foi possível ajustar a equação (1)
** Número de replicados insuficiente.

35. 36
Efeito do LJ001 sobre a rigidez membranar
Figura 11 – Efeito da molécula de LJ001 na rigidez de membranas lipídicas. Variação da anisotropia de
fluorescência da sonda DPH (20µM), inserida em 3mM de POPC (●) e DPPC (▲) LUV, após titulação com
LJ001.
Os dois lípidos utilizados demonstraram que as sondas são capazes de detectar a transição
correcta de fase da membrana.
A utilização da sonda florescente DPH permite verificar alterações na anisotropia de
fluorescência provocadas pela LJ001 bem como um aumento da anisotropia para
membranas fluidas, resultante da diminuição das oscilações da sonda emissora provocada
pela rigidificação.
O LJ001 tem ainda capacidade de levar á rigidificação de membranas que já são rígidas á
temperatura de ensaio (25º), evidenciado pelo aumento da anisotropia da sonda DPH.
Acredita-se que o modo de acção esteja relacionado com a presença de cadeias insaturadas
dos ácidos gordos nos quais actuam espécies reactivas de oxigénio, que são produzidas na
presença de LJ001. A presença de cadeias insaturadas proporciona uma melhor actuação do
LJ001 resultando numa anisotropia maior para as membranas de POPC do que para
membranas em fase de gel. A rigidificação de membranas de DPPC também ocorre no
entanto a anisotropia é menor, uma vez que as cadeias de ácidos gordos (palmitoil) são
saturadas, podendo outros pontos de oxidação ser o fosfato ou as ligações éster entre o
glicerol e o ácido gordo.
A própria inserção da molécula poderá ser responsável pela variação observada, num
potencial efeito de cunha.

36. 37
Combinação do Sifuvirtide e LJ001 nas mesmas membranas lipossomas
Figura 12 – Presença de Sifuvirtide e LJ001 nas mesmas vesículas lipossomais. Partição de 15µM de
Sifuvirtide seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano em POPC (A) e DPPC (B) LUV, pré-incubadas
(●) ou não (○) com LJ001 ([LJ001]/[L] é constante). Espetros de emissão da molécula LJ001 (33µM) em
tampão de amostra e em POPC (C) e DPPC (D) LUV, no final do ensaio de partição.
Uma vez que o Sifuvirtide possui afinidade intrínseca para membranas em fase de gel
(rígidas) colocou-se a hipótese da actividade da molécula de LJ001 potenciar a partição do
péptido. Para testar esta hipótese realizaram-se ensaios em que o lípido foi pré-incubado
com a molécula de LJ001 e posteriormente titulado com o Sifuvirtide.
O efeito esperado seria o aumento da partição do Sifuvirtide devido ao efeito de
rigidificação causado pelo LJ001 que aumentaria a afinidade já existente do Sifuvirtide para
o DPPC, no entanto, tal não foi verificado para as condições testadas e o rendimento
quântico do triptofano seguido no péptido diminuiu ao longo da titulação com lípido e
LJ001.
Verificou-se que a partição para membranas fluidas diminuiu ao contrário do que se
verificou no ensaio anterior. Isto é explicado pela afinidade do Sifuvirtide para membranas
A B
C D

37. 38
rígidas e por este não particionar para membranas fluidas, ainda que a presença de LJ001
posso rigidificar este tipo de membranas, a sua partição é sempre mais baixa do que para
membranas que já possuíam essa característica.
As razões lípido/LJ001 foram constantes durante as suas adições ao logo do ensaio.
De forma a verificar o possível aumento da partição serão realizados novos ensaios
alterando as condições do ensaio, no entanto, tais resultados, não serão incluídos neste
relatório.
A diminuição do rendimento quântico observado pode ser consequência de fenómenos de
transferência de energia em que a emissão do Sifuvirtide excita parcialmente a molécula de
LJ001 inserida no lípido.

38. 39
Combinação do Enfuvirtide e LJ001 nas mesmas membranas lipossomas
Figura 13 – Presença de Enfuvirtide e LJ001 nas mesmas vesículas lipossomais. Partição de 10µM de
Enfuvirtide seguida pela fluorescência intrínseca do triptofano em POPC (A) e DPPC (B) LUV, pré-
incubadas (●) ou não (○) com LJ001 ([LJ001]/[L] é constante). Espetros de emissão da molécula LJ001
(33µM) em tampão de amostra e em POPC (C) e DPPC (D) LUV, no final do ensaio de partição.
Quadro 2 – Coeficientes de partição dos péptidos Sifuvirtide e Enfuvirtide para LUV na
presença e ausência de LJ001
Kp x 10-3
(± SD)
POPC DPPC
- LJ001 +LJ001 - LJ001 +LJ001
Sifuvirtide * * * *
Enfuvirtide 1.25 (± 0.2) 1.62 (± **) 0.23 (± 0.08) 0.17 (± **)
* Não foi possível ajustar a equação (1)
** Número de replicados insuficiente.
C D
A B

39. 40
Este ensaio foi realizado de forma a verificar a presença do péptido e do LJ001 em ambas
as membranas lipídicas, sendo confirmado pelos resultados da partição. Uma vez que o
Enfuvirtide não apresenta grande afinidade para membranas rígidas, a presença de LJ001
não será um factor relevante para que ocorra aumento da partição.
O facto de observar-se uma diminuição do rendimento quântico na presença do LJ001,
embora se verifique partição, pode não implica que não esteja a ocorrer adsorção do
Enfuvirtide às membranas. A presença do LJ001 nas membranas pode levar a uma
competição por parte do Enfuvirtide, no entanto, podemos verificar que a inserção do
péptido não alterou a presença do LJ001 na membrana durante todo o ensaio.

40. 41
Conclusão
O vírus HIV possui uma grande capacidade de mutação, é altamente transmissível e de
difícil erradicação, e por essa razão tem sido alvo de diversas estratégias terapêuticas. Entre
as estratégias terapêuticas utilizadas estão os inibidores de fusão e os anticorpos, embora
existam outros fármacos que actuam em diferentes fases do ciclo de vida do vírus.
Neste trabalho foram realizados trabalhos com inibidores de fusão peptídicos e single
domain Antibodies (anticorpos). A actuação destas moléculas inibe a fusão das membranas
que por sua vez impede a entrada do vírus para as células e a integração do genoma viral no
genoma do hospedeiro, assim como os estados de latência que impedem a erradicação total.
De entre os fármacos utilizados na terapêutica da SIDA, na classe dos inibidores de fusão
apenas o Enfuvirtide é comercializado para o tratamento. No entanto, têm sido
desenvolvidos novas classes de fármacos anti-virais que têm apresentado resultados pré-
clínicos promissores.
O objectivo deste trabalho consistiu na procura de um sistema de delivery de fármacos a
partir da utilização de lipossomas. Através da exploração de diferentes tipos de lípidos,
constituintes das membranas do lipossoma, e de diferentes inibidores de fusão procurou-se
a melhor interacção/estabilização do fármaco com o veículo de transporte.
Os single domain Antibodys podem vir a ser agentes terapêuticos promissores. Inibem
HIV-1 pela sua ligação á proteína gp41, nomeadamente à região HR1, bloqueando as
alterações conformacionais da gp 41 que ocorrem durante o processo de fusão. Este tipo de
anticorpos possui como grande vantagem, o seu tamanho reduzido, que permite chegar a
locais do vírus de difícil acesso sem a utilização de um sistema de transporte lipossomal.
Entre os principais resultados podemos verificar que o F63 sdAbs interage com ambas as
membranas de POPC e POPC:Chol tal como se conclui pela figura 7. Ao interagir com o
lípido os 3 anticorpos estarão a sofrer alterações na sua estrutura terciária que modificam o
micro-ambiente dos triptofanos levando assim à diminuição do rendimento quântico
observado a concentrações elevadas de lípido.
A interacção das construções F63-MPR e F63-CRAC não está directamente relacionada
com a presença dos motivos estruturais MPR e CRAC, ambos com afinidade para
colesterol, mas esta hipótese não pode ser totalmente excluída com base nos resultados
apresentados.
Conclui-se que a presença de lípidos catiónicos nos ensaios aumenta a partição dos
péptidos Sifuvirtide e Enfuvirtide para formulações lipossomais em fase fluida e gel, no
entanto, verificam-se fenómenos de agregação vesicular mediadas por estabilização de
cargas em solução. Para efeitos de delivery este parâmetro e o seu valor crítico devem ser

41. 42
tidos em conta, uma vez que a agregação diminuirá a biodisponibilidade e a acção
pretendida para este sistema.
A vectorização do Enfuvirtide por adsorção a formulações catiónicas parece ser
comprometida pela elevada agregação observada, não sendo por isso uma boa opção para
sistemas de drug delivery.
Para o caso do Sifuvirtide misturas de POPC:EPOPC apresentam resultados promissores,
uma vez que a agregação é mínima para percentagens de lípido catiónico elevadas. Há
ainda o benefício da eficiência de fusão das vesículas ser superior com formulações de
lípido em fase fluida.
O LJ001 é uma molécula com capacidade de oxidar cadeias insaturadas dos ácidos gordos
presentes nos lípidos. O LJ001 actua sobre membranas fluidas induzindo rigidificação,
estando o modo de acção relacionado com a formação de espécies reactivas de oxigénio.
No entanto, o efeito de cunha mediado pela inserção da molécula na membrana também
deve ser considerado. Podemos ainda concluir que ocorre rigidificação de membranas que
já possuem essa característica (DPPC) embora o seu efeito não seja tão significativo como
para membranas fluidas.
Nos ensaios elaborados com LJ001 adicionado ao lípido verificou-se que ambos os
péptidos co-particionaram para as mesmas vesiculas lipossomais, porém não foi possível
explicar se a diminuição do rendimento quântico observada nestes ensaios foi resultado da
diminuição de péptido adsorvido ou de fenómenos de transferência de energia do triptofano
para o LJ001.
Novos ensaios serão elaborados para optimização das condições do ensaio de forma a
comprovar se a presença de LJ001 nos lipossomas com acção de rigidificação poderá
aumentar ainda mais a afinidade já existente do Sifuvirtide para membranas rígidas.

42. 43
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47. 48
Anexos
Sequência dos anticorpos
sdAb F63 (18,6kDa)
E L V L T Q T P S S V P A A V G G T V T I N C S G G G S D S T D Y C K G Y A N
Y S G G G S W Y Q Q K P G Q R P K L L I Y G A S D L A S G V S S R F K G S G S
G T Q F T L T I S G V Q C A D A A T Y Y C S G G G S S T Y A Y A Y S S G A Y S
G G G S F A F G G G T E L E I L S S G G G T S G Q A G Q H H H H H H G A Y P
Y D V P D Y A
sdAb F63-MPR (18,9kDa)
E L V L T Q T P S S V P A A V G G T V T I N C S G G G S D S T D Y C K G Y A N
Y S G G G S W Y Q Q K P G Q R P K L L I Y G A S D L A S G V S S R F K G S G S
G T Q F T L T I S G V Q C A D A A T Y Y C S G G G S S T Y A Y A Y S S G A Y S
G G G S F A F G G G T E L E I L S G G L W Y I K G G G Q A G Q H H H H H H G
A Y P Y D V P D Y A
sdAb F63-CRAC (19,2kDa)
E L V L T Q T P S S V P A A V G G T V T I N C S G G G S D S T D Y C K G Y A N
Y S G G G S W Y Q Q K P G Q R P K L L I Y G A S D L A S G V S S R F K G S G S
G T Q F T L T I S G V Q C A D A A T Y Y C S G G G S S T Y A Y A Y S S G A Y S
G G G S F A F G G G T E L E I L S G G V L N Y Y V W R G G G Q A G Q H H H H
H H G A Y P Y D V P D Y A
Sequência do Enfuvirtide
C – Y T S L I H S L I E E S Q N Q Q E K N E Q E L L E L D K W A S L W N W I – NH
Sequência do Sifuvirtide
C – S W E T W E R E I E N Y T R Q I Y R I L E E S Q E Q Q D R N E R D L L E – NH

48. 49
Tabela A1- Protocolo de adições para titulação de LUV
#
[L]
/mM
Vcuvette
/μL
V cumulativo
/μL
Vadicionar
/μL
CDiluição
0 0 500.00 0 0 1.00
1 0.1 503.36 3.36 3.36 1.01
2 0.2 506.76 6.76 3.40 1.01
3 0.3 510.20 10.20 3.45 1.02
4 0.4 513.70 13.70 3.49 1.03
5 0.6 520.83 20.83 7.13 1.04
6 1 535.71 35.71 14.9 1.07
7 1.5 555.56 55.56 19.8 1.11
8 2 576.92 76.92 21.4 1.15
9 3 625.00 125.00 48.1 1.25
10 4 681.82 181.82 56.8 1.36
11 5 750.00 250.00 68.2 1.50
Tabela A2- Protocolo de adições para titulação de LJ001
#
[LJ001]
/mM
Vcuvette
/μL
V
cumulativo
/μL
Vadicionar
/μL
CDiluição
0 0 500.0 0 0 1.0000
1 0.02 501.0 1.0 1.0 1.0020
2 0.04 502.0 2.0 1.0 1.0040
3 0.06 503.0 3.0 1.0 1.0060
4 0.08 504.0 4.0 1.0 1.0080
5 0.10 505.0 5.0 1.0 1.0101
6 0.12 506.0 6.0 1.0 1.0120
7 0.14 507.1 7.0 1.0 1.0141

49. 50
Figura A1- Mecanismo de ligação do vírus à membrana plasmática de uma célula.
Figura A2 – Representação das regiões Fab e Fc após clivagem por acção de uma protéase.

50. 51
Figura A3 – Esquema da estrutura da proteína gp41 do vírus HIV-1 e a sequência de
aminoácidos do Enfuvirtide localizada dentro da região HR2
Figura A4 – Estrutura molecular do péptido Enfuvirtide ( T-20)

51. 52
Figura A5 - Esquema representativo das várias utilizações dos lipossomas e inter-relação
entre os diversos parâmetros que os caracterizam. Adaptado de referência X