1. MICROCULTIVO
Los mohos viven como saprofitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposición de la materia
orgánica y al reciclado de materia orgánica, utilizando enzimas extracelulares como celulasas y pectinasas,
manteniendo de esta manera la fertilidad del suelo.
Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los champiñones) e indirectamente en la
elaboración de cerveza, vino y pan (Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas con ésta). Además el
queso Roquefort se produce inoculándolo con Penicillium roquefortii durante su elaboración y otros quesos
suaves como el camembert se producen inoculando Penicillium camemberti. El moho crece sobre la superficie
produciendo una proteasa que descompone la estructura del queso. Otros ejemplo es el interés en la producción
de proteína de origen unicelular a partir de mohos, ya sea apara alimento del hombre o del ganado, por ejemplo
el uso de Candida utilis y la levadura desecada Saccharomyces cerevisiae Además de la producción de
alimentos, los mohos producen ácido cítrico para bebidas embotelladas, se basa en el crecimiento de
Aspergillus niger, el descubrimiento de penicilinas como productos metabólicos de Penicillium notatum
revolucionó la medicina moderna, hoy en día se produce con una variedad denominada Penicillium
chrysogenum. Existen otros antibióticos producidos por mohos estos son las cefalosporinas, griseofulvina, ácido
fusídico
Algunas características de los mohos.
• Los mohos tienen las siguientes características:
• Son eucariontes, presentan un núcleo rodeado de membrana
• No contienen clorofila
• Se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza
• Los filamentos se llaman hifas y al conjunto de hifas se le llama micelio
• El interior de la hifa puede estar septada o no
• Son inmóviles, aunque existen esporas móviles
• La mayoría son esporulados
• La espora se forma por la fusión de los núcleos de dos células
• Si las esporas asexuales están contenidas en un saco, este recibe el nombre de esporangio, a la hifa
que lo sostiene, esporangióforo, y a las esporas esporangiosporas. Si se forma fuera de un saco, se
les designa conidiosporas.
• Las esporas sexuales que se forman dentro de un saco (ascas) se denominan ascosporas
• Muestran requerimientos nutricionales mínimos y su pH es cercano a 5,6
• Los límites de temperatura para su desarrollo es de -6 > 70°
• Se multiplican abundantemente a humedades elevadas
• La mayoría de los mohos son aeróbicos
• Son heterótrofos, pero crece bien en cultivos simples
• Algunos son termodúricos
• Algunos producen micotoxinas
Las levaduras se distinguen de los mohos en que son unicelulares, no suelen formar filamentos y se reproducen
por fisión binaria o gemación. Generalmente son de forma ovalada
La identificación de los mohos, unicelulares o filamentosos se realiza a través de:
• Morfología colonial
• Microcultivo
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2. • Morfología microscópica
• Pruebas metabólicas (levaduras)
• Composición de la pared celular
• Respiración
• Nutrición
• Reproducción
• Genética molecular.
Morfología colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el diámetro oscila
entre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cóncavas de aspecto brillante o mate, opacas, de
bordes lisos.
Morfología colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de diámetro, de color olivo,
verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado,
algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares.
Morfología microscópica: La morfología microscópica se observa con la ayuda del microscopio a seco fuerte
mediante la realización del microcultivo, observándose las siguientes estructuras:
1.- Según su nivel de organización celular pueden ser:
- Unicelulares (levaduras)
- Pluricelulares (mohos)
- Dimórficos (posee ambos tipos de micelio)
Fig. 71 a.- Unicelular b.- Pluricelular
Por su tamaño
Fig. 71 Macroscópicos Microscópicos
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3. Por su forma
Fig. 72 Amorfos (masa algodonosa) Definida (crecimiento circular)
Fig. 73 Por su ausencia o presencia de septos
Aéreo fuera del sustrato
Profundos dentro del sustrato
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4. Fig. 74 Por su localización
Por su aspecto
Algodonoso, aterciopelados, terrosos, húmedo, seco.
Por su función:
- Micelio vegetativo: se encarga de la captación de nutrientes.
- Micelio aéreo o reproductor: producción de esporas (sexual y asexual)
b) De acuerdo al color de las hifas:
- Hialino: cuando no está pigmentado.
- Dematiáceo: cuando posee color café oscuro.
c) Su sistema de reproducción es asexual y sexual:
- Las esporas asexuales son:
Talosporas.
a) Artrosporas: Son esporas que se forman por fragmentación de las hifas.
b) Blastospora: Se forman en las levaduras por la gemación a partir de una célula ya preexistente.
c) Clamidospora: Estas esporas son redondas y tienen doble pared gruesa que les confieren resistencia.
Conidiosporas
a) Microconidias: Son esporas unicelulares
b) Macroconidias: Son esporas multinucleadas.
Esporangiosporas
Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al
micelio vegetativo, por una estructura llamada esporangióforo.
- Las esporas sexuales son:
Zigosporas: esporas contenidas en cigosporangios en los Zimomycetes.
Ascosporas: esporas contenidas en saquitos denominados ascas en los Ascomicetes.
Oosporas: esporas contenidas en oosferas correspondientes a los Oomycetes.
Basidiosporas: esporas contenidas en basidios correspondientes en Basidiomicetes.
Morfología colonial de mohos y levaduras
71

5. Fig. 75 Diferentes forma de levaduras y mohos
OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE MOHOS.
Determinar: Tamaño, forma, aspecto, color, producción de pigmento difusible y anotar los días de incubación. A
continuación se muestran dibujos de mohos filamentosos.
Una vez realizada las observaciones las cepas se pueden sembrar en tubo para su conservación o para la
realización del microcultivo
Sembrar por punto en tubos con PDA y ADS
Fig. 75 Conservación de cepas de mohos.
IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (MICROCULTIVO)
1. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí estéril y caliente.
Fig.76 Forma en que se cortan los cuadros de agar par el microcultivo
2. Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que está sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en
una caja de Petri (previamente esterilizada).
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6. Fig. 77 Material parta el microcultivo y puesta del cuadro de agar
3. Tomar con el asa él inoculo del moho previamente seleccionado.
4. Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar.
5. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio.
Fig. 78 Inoculación del cubo de agar, y colocación del glicerol para mantener la huemdad
6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri.
7. Incubar la caja a 28° C durante 48 h.
REALIZAR OBSERVACIONES MÍNIMO CADA 12 h PARA IDENTIFICAR LOS CUERPOS FRUCTÍFEROS.
1. Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta Pasteur.
Fig. 79 Observación del crecimiento del hongo y retiro del glicero para su inactivación
2. Adicionar 5 ml de formaldehído para inactivar el moho durante 15 minutos.
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7. Fig. 80.- Inactivación del moho
3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un
portaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente.
4. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón, colocar un cubreobjetos
sobre el colorante y sellar la preparación. Observar las preparaciones a 10X y 40X.
Fig. 81.- Realización de la preparación en fresco del microcultivo
5. Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía realizar la comparación de las estructuras
reproductoras y vegetativas, identificar de que moho se trata. Por ejemplo: Rizopus sp
Fig. 82 Aspergillus Penicillium Alternaria
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8. Fig. 83 Rhizopus sp
OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LEVADURAS
Para la identificación de levaduras utilizamos generalmente reacciones de fermentación de carbohidratos.
Observar las levaduras que pueden aparecer sobre la superficie o en el seno del agar. En el primer caso son
circulares y de diámetro mayor al de las bacterias; en el seno del agar suelen aparecer estrelladas y algo más
pequeñas, son de aspecto húmedo y pueden ser coloridas.
Fig. 84 Crecimiento de levaduras
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS.
1. De una placa de PDA incubada a 35°C seleccionar una colonia de levadura.
2. Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria.
3. Teñir la preparación con cristal violeta, lavar y dejar escurrir.
4. Observar la preparación en 10X y 40X y dibujar.
75

9. Fig. 85 Observación microscópica de levaduras
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10. Métodos de conservación de cepas
En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que conservar, teniéndose varios
métodos para su conservación pero es necesario tomar en cuenta las características del microorganismos, los
materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues sucede que nuestras cepas tipo
pueden en un momento sufrir las siguientes daños como la deshidratación, cambios genéticos o perdida de la
viabilidad y finalmente la muerte celular.
Fig. 91 Deshidratación del medio en tubo con tapón de algodón.
Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios
de microbiología son:
Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservación;
Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y
Que estas células permanezcan genéticamente estables.
Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica
microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios
métodos de conservación para los microorganismos. Los métodos de conservación de cepas se van a
agrupar en tres apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos
alternativos y métodos restringidos.
A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto.
Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aún así
no se puede descartar algún cambio originado por el método preparatorio en si mismo. Los métodos de
conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.
a) Conservación por congelación.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas
inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de
agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se
recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista,
pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y
estabilidad de las células conservadas por este método son los siguientes:
1º.- Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de
la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten
en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es
preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en
algunos pleomórficos e incluso en algunos más sencillos.
2º.- Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación bien
estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones
de la temperatura sean rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo que
para descongelar conviene poner las células a 37ºC.
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11. 3º.- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos
cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que
tiene una temperatura de –195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una
temperatura de –140ºC.
Aquellos congeladores que sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y –40ºC, como ocurre con la
mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentración de solutos
que existen en la suspensión celular, su punto de congelación baja. El daño que se produce en las
células es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si
se añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que
se produce y se evita el aumento de la concentración iónica.
Para la conservación en congeladores, las células se almacenan en criotubos (tubos de plástico
esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente), preparando lotes de varios
tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. De esta
manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Este método no se debe
emplear para la conservación de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el género
bacteriano Clostridium, ya que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto con el
oxígeno y puede afectarse la viabilidad.
4º.- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda
producir en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos
que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol,
a una concentración del 15 al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche
descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa o inositol. En su elección influye
el tipo de microorganismo que se quiera conservar.
b).- Conservación por liofilización.
Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el agua
mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto
como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto,
primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin que haya
necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este
proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores. Las células microbianas así conservadas se
someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dos
etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. Sin embargo, este es un método muy
recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez
conseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es muy
cómodo.
Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilización son lógicamente los mismos que
influyen en la congelación, a los que habrá que añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación.
Sin embargo, antes de pasar a explicar éstos, tenemos que hacer unas breves consideraciones sobre los que
antes hemos mencionado para el caso de la congelación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la
primera sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden
utilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su
elevado punto de evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos.
Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación
del agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como
crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y actinomicetos,
pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el
glutámico-glutamato para las bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo hígado o chopped meat (sin
carne) para bacterias anaerobias.
Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación
son:
1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y lógicamente serán
aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos mohos filamentosos, especialmente los no
esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos.
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12. 2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de
108-109 células /ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de mohos filamentosos y
levaduras.
3. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC.
4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la concentración de solutos
puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial.
5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para
evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede
dañar a las células.
6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18ºC y sin
bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad.
B.- Métodos alternativos.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los equipos
necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos.
Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda
conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
a).- Conservación por transferencia periódica.
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin
embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas
excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celular,
por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor método para
conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones,
y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es
posible que ya no conserven algunas de sus características. Si se va a utilizar este método es aconsejable
retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias
maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inoculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes
en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el
crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando los
cultivos a 4ºC-8ºC. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con
esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser
tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy
aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados.
Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resulta
más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros
en los mismos.
b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en
agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los
anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml en
el caso de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en
suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión
se hace en agua de mar diluida.
Para demostrar la eficiencia de un método en nuestras cepas se tiene que determinar el porcentaje de viabilidad
en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica, bioquímica y la virulencia..
C.- Métodos restringidos.
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora
de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación,
como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro métodos que vamos a citar
se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células.
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13. a).- Desecación en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa de
células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que
se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido
congelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar
que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado,
ocasionando la congelación incontrolada de las células.
b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores de
esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es barato y de fácil
conservación.
Fig. 92 Deshidratación del medio para generación de esporas en mohos
Fig. 93 Conservación de esporas en aceite mineral y arena estéril
Desecación en bolitas de alginato.
Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación
del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que
se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados
herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo
contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato. Este es un método que se
está utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales.
c).- Desecación en sal para halobacterias.
Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente.
Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser
insuficiente el nivel de agua disponible.
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14. Por último, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el método empleado
en la conservación de las cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes para su
conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las células que se han estado
guardando, porque éstas vienen de una situación de estress más o menos fuerte (sobre todo cuando se han
conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de prueba. Primero habría que
revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo más
posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas en
medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad
microbiana, cada microorganismo soportará determinados métodos de conservación mejor que otros, o será
necesario tomar precauciones especiales en su conservación. Como ya dijimos al comienzo, no existe un
método general de conservación de los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable
en cada caso. La mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a largo plazo con los
métodos generales de congelación y/o liofilización, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos.
CULTIVO EN TUBO INCLINADO PARA CONSERVACIÓN DE CEPAS POR REFRIGERACIÓN
1.- Tomar un tubo con agar de soya y tripticaseína y sembrarlo por estría simple
2.- Adicionarle 3 ml de aceite mineral estéril. (El aceite se puede esterilizar en autoclave o en el horno)
3.- Cerrar el tubo con el tapón, etiquetar el tubo perfectamente, colocarlo dentro de un bote y guardarlo en el
refrigerador.
Fig. 94.- Diferentes formas de conservación de cepas
Fig. 95 Una de las formas más usuales de conservar las cepas es en congelación
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15. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Aislamiento
Una vez transcurrido el tiempo de incubación del cultivo, observamos la placa de Petri, escogeremos las colonias
que estén separadas, a estas les realizaremos la morfología colonial previamente revisada, además haremos
una tinción de Gram para determinar el grupo al que pertenece. Una vez conocido el Gram podremos realizar la
Identificación del microorganismo y para ello es necesario elegir las más adecuadas acorde a lo que tenemos y a
lo que nos sugiere la bibliografía, pues existen algunas marchas ya descritas las cuales nos son de gran valor
para la Identificación.
La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, por
medio de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunque
es posible efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo o
diferencial. Se recomienda que de una sola colonia hacer una suspensión bacteriana en 1 ml de solución salina
fisiológica 0.85 p/v para que de ahí se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioquímicas.
Los siguientes pruebas de Identificación para bacterias están agrupados por bacterias Gram (-) y +).
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,
rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)
TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas)
LIA ( Descarboxilación de la lisina)
MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol)
SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico)
Rojo de metilo
Producción de urea
Reacción de Voges Proskauer
Utilización de Malonato
Utilización del citrato
Licuefacción de la gelatina
Crecimiento en caldo nutritivo
Utilización de la esculina
Utilización del gluconato
Requerimientos de oxígeno
Catalasa
Oxidasa
Reducción de nitratos
Fermentación O/F
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina,
adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)
TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas)
LIA ( Descarboxilación de la lisina)
MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol)
SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico)
Catalasa
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16. Oxidasa
Reducción de nitratos
Hemólisis
Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %
Crecimiento en bilis al 40 %
Coagulasa
Licuefacción del a gelatina
Hidrólisis de la esculina
Voges - Proskauer
Prueba de la fosfatas
Prueba de la DNAsa
Incubación a 10 y 45 °C
Reducción con azul de metileno
Hidrólisis del hipurato
Formación de cápsula
Hidrólisis del almidón
Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura para
hacer una selección de pruebas recomendable y lograr el objetivo lo más rápido posible y sin perdida de tiempo y
de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos realizar en un momento dado y
a continuación se describirán algunas de ellas.
UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS
1.- HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN
Fundamento.
Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de almidón
en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.
a.- En una caja con agra almidón se procede a inocular por estrías simple la placa
b.- Incubar la caja a 35°C durante 24 h.
c.- Después de la incubación añadir unas gotas de lugol cubriendo la superficie de la placa.
- RESULTADOS:
+ Positivo.- Si se forma un halo claro alrededor de la estría.
- Negativo.- No se forma un halo claro alrededor de la estría.
Fig. 96 Siembra en agar almidón y realización de la prueba con lugol
2.- FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL
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17. Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendo
ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene rojo de fenol por lo
que:
Indicador de pH: rojo de fenol
pH ácido: Color amarillo
pH alcalino: Color rojo
Prueba positiva: da una coloración amarilla y con la producción de gas (aerogénica)
Prueba negativa el color se mantiene de color rosa-rojiza. El tiempo de incubación es de 24 h
a.- Al tubo con campana de Durham y caldo rojo de fenol más el carbohidrato por ejemplo sacarosa, inocular 0.1
ml de la suspensión microbiana.
b.- Incubar a 35 °C de 24 a 48 horas
c.- Observar el tubo
- RESULTADOS:
+ Positivo.- Si hay cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham
- Negativo.- Si hay no cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham
Fig. 97 Fermentación de un azúcar con campana de Durham
3.- FERMENTACIÓN DE AZUCARES EN MEDIO TSI.
Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro
(TSI).
Fundamento:
Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción de
gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al reaccionar con el
hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre
produciendo una reacción visible de color negro.
La formula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de glucosa y
lactosa (triple azúcar), el agar esta preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2 cámaras de
reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su superficie al oxígeno,
es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es relativamente anaerobia.
Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de flauta, además que estos tengan
la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, para
ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta,
para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de
flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18- 24 h.
Indicador de pH: rojo de fenol
pH ácido: Color amarillo
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18. pH alcalino: Color rojo
RESULTADOS:
Prueba positiva: La fermentación de la glucosa se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo cual la prueba se lee en
el fondo del tubo.
Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo
Glucosa negativa: Fondo alcalino, sin cambio.
Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla
Sacarosa y lactosa negativas: superficie roja
Lactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta.
Lactosa negativo: De color rojo en el pico de flauta.
Producción de H2S: Presencia de una coloración negra.
Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio del
fondo dejando un espacio libre.
a.- Inocular con el asa recta por picadura y después por estría abierta en forma de “S” sobre el pico de flauta en
un tubo con agar TSI a partir de la suspensión.
b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observar los cambios en el tubo.
Fig 98 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: Tubo sin inocular2.- A/A con producción de gas, 3 A/A sin
producción de gas, 4 K/A sin producción de gas y H2S negativo, 5 A/A y H2S positivo sin producción de gas,
6K/A con producción de H2S y sin producción de gas.
Fig 99 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: A/A sin producción de gas y H2S negativo, 2: K/K y H2S
negativo sin producción de gas, 3 K/K sin producción de gas y H2S negativo e inmóvil , 4 K/A con producción de
gas y H2S negativo, 5: K/A con producción de gas y H2S positivo y móvil y Tubo 6: A/K
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19. 4.- PRUEBA DE ROJO DE METILO
Fundamento:
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es cualitativa
para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos láctico, acético, o fórmico
a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos microorganismos que
producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos que puedan mantener este pH
bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.
La preparación de este medio se hace en tubos de 13 X 100, colocando 4 ml del medio de RM – VP y se inocula
con el cultivo puro del organismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 – 72 h (no menos de 48 h,
finalizando este período, añadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo.
Indicador de pH: Rojo de metilo
Rojo de metilo positivo: Color rojo estable en la superficie del medio que indica la producción de ácido suficiente
como para bajar el pH a 4,4.
Rojo de metilo negativo: dado que algunos microorganismos produzcan cantidades menores de ácido puede
producirse un color entre el amarillo y rojo lo que indicara que la prueba es negativa.
Controles
Prueba Control negativo Control positivo
Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes
a.- Inocular con 0.1 ml de la suspensión al caldo rojo de metilo.
b.- Incubar el tubo a 35°C durante 48 h.
c.- Después de la incubación, añadir al tubo 2 gotas de la solución de rojo de metilo y observar.
RESULTADOS:
Prueba positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.
Prueba negativa: El cultivo no cambia de color.
Fig. 100 Resultados del medio rojo de metilo
5.- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
Fundamento:
La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en diacetilo por
acción del KOH al 40 % y el oxígeno atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el α - naftol actúa como
catalizador para revelar un complejo de color rojo.
Indicador de pH: Rojo de metilo
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20. Prueba Control negativo Control positivo
Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp
a.- Inocular un tubo que contenga caldo Voges Proskauer con 0.1 ml de la suspensión
b.- Incubar el tubo a 35°C durante 24 h.
c.- Después de incubar, agregar 6 gotas de solución de alfa-naftol y 2 gotas de solución de KOH, en ese orden
estricto y agitar suavemente, dejar en reposo 10-15 minutos y observar los cambios en el medio.
RESULTADOS:
Prueba positiva: Color rojo ladrillo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetoina)
Prueba negativa: No hay cambio en el color del medio.
Fig. 101- Resultado de la prueba de VP, tubo 1 negativo, tubo 2 positivo y tubo 3 medio sin inocular
UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS
6.-CITRATO DE SIMMONS
Fundamento
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y
compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del
medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella,
Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de
amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH.
Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio
lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente
por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
Controles
Control positivo: Enterobacter aerogenes
Control negativo. Escherichia coli.
a.- Inocular por estría abierta en forma de “S” un tubo que contenga agar Citrato de Simmons a partir de la
suspensión.
b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h.
c.- Observar los resultados
RESULTADOS:
Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).
Negativa: No hay desarrollo (medio de color verde).
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21. Fig. 102 Prueba del citrato de Simmons
7.-CALDO MALONATO
Fundamento
Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono, con la
consiguiente alcalinidad.
El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido fumárico,
inhibiendo la acción catalítica de la enzima succínico deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibición
competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que la
enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona un bloqueo en la
oxidación del ácido succínico
Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la oxidación del
ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto ácido es influido
independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma otra en un proceso por
etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como el ácido fumárico, el ciclo de
Krebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, entonces, recurre al ciclo del ácido glioxílico para la
producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo continuo de esa manera poder regular
la cantidad de acetil coenzima A introducida en el ciclo.
Indicador de pH: Azul de bromotimol
Controles
Prueba Control negativo Control positivo
Caldo malonato Salmonella sp Alcaligenes faecalis
a.- Inocular con 0.1 ml de la suspensión microbiana un tubo que contenga caldo malonato
b.- Incubar el tubo a 35°C durante 24 h y observar.
RESULTADOS:
Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul intenso
Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.
Fig. 103.- Prueba negativa y prueba positiva
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22. 8. CALDO UREA
Fundamento
La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de amoníaco y
dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo puede hidrolizar a la urea que esta
presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco reaccionan en solución para
formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio.
Inocular un tubo con caldo urea con una asada de la suspensión microbiana a estudiar, si se utiliza agar urea se
estría la superficie del medio e incubar el medio a 35 ° C durante 24 h.
Indicador de pH: Rojo de fenol.
Controles
Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo
Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli
a.- Inocular 0.1 ml de la suspensión microbiana a un tubo que contenga caldo urea
b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h.
RESULTADOS
- Hidrólisis por producción de ureasa Positiva: Color rosa fucsia en el medio.
Negativa: Sin cambio de color en el medio
Fig. 104 Prueba negativa y prueba positiva
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:
9.- LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (método del tubo)
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son detectadas por la
digestión o licuefacción de la gelatina presente. Estas enzimas que son capaces de gelatinólisis, se denominan
gelatinazas.
Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser
metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños, las enzimas exocelulares de tipo
proteolítico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad
ayuda a la identificación bacteriana. El catabolismo de las proteínas por las gelatinazas se da en dos etapas la
primera origina polipéptido y posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.
Controles
Control positivo: Staphylococcus aureus
Control negativo. Listeria monocytogenes
a.- Inocular por picadura un tubo que contenga gelatina nutritiva a partir de la suspensión
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23. b.- Incubar a 35 °C durante 24 h
c.- En cada revisión de la prueba sacar de la incubadora y colocar el tubo en el refrigerador por cinco minutos
junto con el testigo para verificar el resultado
d.- Observar si hay licuefacción de la gelatina, en el caso de que la prueba sea negativa hay que volver a
incubar. Descartar la prueba negativa hasta los 14 días
Fig. 105 Tubo de arriba negativo y el de abajo positivo
10.- MEDIO SIM
a.- Inocular por picadura con el asa recta un tubo con medio SIM a partir de la suspensión
b.- Incubar a 35 °C durante 24 h.
c.- Después de incubar observar el tubo, una coloración negra indica la formación de ácido sulfhídrico y
posteriormente añadir 3 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich al tubo para observar la presencia o ausencia de
indol.
RESULTADOS:
Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo
Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.
Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.
Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente
negro.
Fig.- 106Tubo 1 SIM äcido sulhidrico positivo y movilidad (+), tubo dos Indol negativo, Tubo 3 microorganismo
inmóvil, tubo 4 tubo sin inocular, tubo 5 äcido sulfhídrico (+) e indol (-) y tubo 6 H2S (-), e indol (+)
11.- MEDIO MIO
Fundamento
Es un medio semisólido, se siembra por picadura y se incuba 24 h a 35 °C. Sirve para leer la movilidad,
producción de Indol y descarboxilación de la ornitina. Cada tubo debe de contener 4 ml del medio utilizando
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24. tubos de vidrio de 13 X 100 mm con tapón de rosca para evitar la entrada de aire y el medio se deja solidificar en
forma vertical.
La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o
inmóvil. La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de la
molécula de triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos
indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjunto
se denomina “triptofanasa ” .
Para esta prueba también se puede inocular la muestra en caldo triptosa o nutritivo incorporado con triptófano al
1 %.
La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son
capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico,
la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la cual es una enzima inducida que es
formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de
la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácido
se produce anaerobicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el
fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina
putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la
superficie del medio con parafina o vaselina.
Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.
Control
Sustancia Control positivo Control negativo
Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp
Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp
a.- Inocular por picadura un tubo con medio MIO a partir de la suspensión.
b.- Incubar a 35 ºC durante 24 h y observar si hay descarboxilación de la ornitina
c.- Después de observar adicionar 3 gotas del reactivo de Kovac´s y observar la presencia de indol.
RESULTADOS
pH ácido: vire de color a amarillo (Desaminación)
pH alcalino: vire del color a púrpura o morado (descarboxilación)
Movilidad positiva: El medio se enturbia y se ve crecimiento en todo el tubo
Movilidad negativa: El crecimiento es sólo a lo largo de la picadura.
La descarboxilación de la ornitina se lleva a cabo en condiciones anaeróbicas, por lo tanto la prueba solo se lee
en el fondo del tubo.
Descarboxilación de la Ornitina positiva: El fondo del tubo debe alcalinizarse y presentar un color púrpura o
morado.
Descarboxilación de la Ornitina negativa: Fondo del tubo amarillo.
Para llevar a cabo la prueba del indol se adiciona a el medio 5 gotas del reactivo de Ehrlich o de Kovac´s y se
deja durante unos 2 minutos.
Indol positivo: Anillo de color rojo
Indol negativo: Anillo incoloro o café.
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25. Fig. 107 Medio MIO con producción de indol + y -
12.- DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA.
Fundamento:
En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la
Desaminación de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis.
La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son
capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico,
la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa , la cual es una enzima inducida que es
formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de
la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácido
se produce anaeróbicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el
fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina cadaverina y
anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del
medio con parafina o vaselina.
Al Preparar el medio es importante que se deje solidificar en pico de flauta, que estos tengan la misma longitud
de aproximadamente 3 cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, para ello utilizar tubos
de 13 X 100 mm. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta, para esto hay que
utilizar el asa recta., primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un
movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18- 24 h.
Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.
Controles:
Aminoácido Control positivo Control negativo
Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes
a.- Inocular por picadura y estría un tubo con medio LIA a partir de la suspensión.
b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observar
RESULTADOS:
- Desaminación de aminoácidos: Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.
Negativa: La superficie no tiene cambios.
- Descarboxilación de aminoácidos: Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.
Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo
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26. Fig. 108 Prueba de LIA
DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO
13.- REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS
Fundamentos
La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada para la
identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos biotipos de
Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.
Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos y
otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo α - naftilamina y ácido
sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - α - naftilamina. El color en
caso de ser positiva aparecerá a los 30 segundos de añadir los reactivos y dado que los reactivos solo detectan
nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es necesario añadir una pequeña
cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn reducen los nitratos a nitritos, y el
desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la presencia de nitratos residuales y confirma la
reacción negativa verdadera.
Indicador de pH: No tiene indicador.
Controles:
Prueba Control positivo Control negativo
Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus
a.- Inocular 0.1 ml de la suspensión a un tubo con caldo nitrato
b.- Después de incubar, determinar la presencia de nitritos, añadiendo al tubo 3 gotas de alfa-naftilamina y 3
gotas de ácido sulfanílico. Observar si hay cambios de color en el medio: Anotar las observaciones
RESULTADOS:
- Reducción de nitratos a nitratos Positiva: Aparición de un color rojo en 30 s
Negativa: Sin cambio de color.
Fig. 109 Prueba positiva y prueba negativa
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27. 14.- DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO
DE HUGH Y LEIFSON
Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativamente u oxidativamente, los subproductos de
la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentación
convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son sumamente débiles y
para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación mas sensible, como el medio OF.
Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:
a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.
b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.
c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.
La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las
pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentración relativamente
mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido. La consistencia semisólida
del agar permite que los ácidos formados en la superficie se difundan por todo el medio, facilitando la
visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es también apto para determinar la movilidad de un
microorganismo.
La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden no
producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas pueden con el
tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación final. Para realizar esta
prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se inocula por picadura con la suspensión
microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta llegar casi al fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de
aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el otro tubo abierto al aire. Incubar ambos tubos a 35 ° C
durante 48 h o más.
Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.
Interpretación.
Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto
Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde
Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo
No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde
Controles
Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico
OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp
a.- Inocular por picadura dos tubos con medio de Hugh Leifson, a partir de la suspensión, a un tubo se le agrega
0,4 ml de aceite mineral.
b.- Incubar a 35 °C y observar a las 24 h y anotar el color del tubo después de la incubación y comparar con el
siguiente cuadro:
Color del tubo Tubo con sello Tubo sin sello Tipo de Metabolismo
de aceite de aceite
Amarillo + + Fermentativo
Amarillo - + Oxidativo
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28. Verde + + No asimila glucosa
Fig. 110’Metabolismo oxidativo y metabolismo fermentativo
15.- PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO
Fundamento:
Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio.
La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación – reducción que produce energía y por medio del
cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de
transporte de electrones, al aceptor de hidrógeno final, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido
de hidrógeno, según la especie bacteriana y su sistema enzimático.
Controles
Control positivo: Klebsiella
Control negativo. Escherichia col.
a.- Inocular por asada un tubo con caldo cianuro de potasio (KCN) a partir de la suspensión e incubar a 35 °C.
durante 24 a 48 h
b.- Después de incubar, observar si hay crecimiento o no en el medio.
RESULTADOS:
Positiva: Presencia de crecimiento (turbidez)
Negativa: Ausencia de crecimiento (medio claro)
Fig. 111 Crecimiento en KCN
16.- PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA
Fundamento
Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena
respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo
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29. oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa
es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La
prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas) y
para la identificación de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas)
Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de electrones,
sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo
oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.
La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:
1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas
que se han desarrollado en la placa.
2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,
3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.
En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se recomienda no
emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la superficie formados al
esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.
Controles:
Prueba Control positivo Control negativo
Citocromo Pseudomonas Escherichia coli
oxidasa aeruginosa
a.- Impregnar un pedazo de papel filtro con el reactivo de oxidasa (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).
b.- Tomar una asada del cultivo de TSI y frotarla en el papel y observar.
RESULTADOS:
Positiva: Color azul violeta.
Negativa: No hay cambio de color.
Fig. 112 Prueba de oxidas positiva y negativa
17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
• Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
• Bacillus (+) de Clostridium (-).
• Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y
C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:
Método del portaobjetos (recomendado):
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30. • Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un
portaobjetos limpio de vidrio.
• Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con
el cultivo.
• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
• Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
• Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse
falsos positivos.
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución
de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su
presencia dará un falso resultado positivo
Fundamento.
Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas que contienen citocromo.
La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la
catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina.
El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los
hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa
transforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
Controles
Control positivo: Staphylococcus aureus
Control negativo. Streptococcus sp
RESULTADOS:
Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno.
Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.
Fig. 113 Prueba positiva, negativa y positiva de la enzima peroxidas
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31. PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA, MANEJO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO
En el análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la toma correcta, los medios de
conservación y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y
confiables. Esto implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamaño o
el volumen, en lo posible, serán representativos del producto y del lote o partida de donde provienen.
La recolección de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminación externa, tanto ambiental como
humana para asegurar la integridad de la misma.
Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos pertinentes que pudieran
afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en consideración. Las
condiciones de conservación y transporte, tiempo comprendido entre la recolección de la muestra, su entrega al
laboratorio, así como la realización del análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la
población microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos. Esto es especialmente cierto en los
alimentos perecederos.
Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservación para los alimentos perecederos, ya que para, fines
oficiales la Ley General de Salud señala claramente que después de la notificación de los resultados del análisis
practicado, si existe alguna duda sobre la veracidad de estos, el particular puede impugnar dentro del plazo
contemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretaría de Salud analice la muestra
testigo en un laboratorio que ésta señale en presencia dé las partes interesadas y el resultado obtenido sea el
que en forma definitiva acredite si el producto en cuestión reúne o no los requisitos y especificaciones sanitarias.
Sin embargo los alimentos, aún en condiciones apropiadas de conservación, pueden sufrir cambios significativos
en sus características biológicas y/o fisicoquímicas, provocando que los resultados de las muestras testigo sean
improcedentes.
PARÁMETROS QUE PUEDEN AFECTAR EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
a.- Tiempo de transportación. Si es muy largo y no se mantiene en condiciones adecuadas el número de
microorganismos puede aumentar o disminuir.
b.- Temperatura. Si no es la adecuada el número de microorganismos se eleva o disminuye según la
temperatura a la que se transporte o almacene.
c.- pH. Si los microorganismos continúan su metabolismo y aumentan el pH el número puede disminuir
VOCABULARIO
1.- Asépticamente, forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio.
2.- Fecha de caducidad, fecha limite en que se considera que un producto, almacenado en las condiciones
sugeridas por el fabricante, conserva las características sanitarias que debe de reunir para su consumo. Después
de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.
3.- Muestra representativa, es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas en forma
aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del que procede.
4.- Muestra testigo, muestra que queda en poder del interesado y en disposición de la autoridad competente.
5.- Productos perecederos, grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y físico-química, su vida útil es de
hasta 30 días, dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad, la cual debe ostentarse en su etiqueta
o envase.
6.- Toma de muestra, es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad
del lote o partida.
7.- Vida útil o vida de anaquel, es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel de calidad
sanitaria aceptable para su consumo, bajo condiciones específicas de procesamiento, envasado y
almacenamiento.
SIGNIFICADO SANITARIO
La adecuada toma de muestra para el análisis es de primordial importancia. Si la muestra esta recolectada en
forma impropia, esto no es representativo del lote y el resultado final puede ser erróneo. Una muestra
representativa es esencial cuando se buscan microorganismos patógenos o toxinas.
98

32. MUESTREO Y ALMACENAMIENTO
En la siguiente tabla se enlistan los productos competencia del control Sanitario de Bienes y Servicios, así como
el tamaño mínimo de muestra necesario para la realización de un análisis básicos y especiales.
Para el análisis básico que comprende microbiológicos, fisicoquímicos y algunas veces biológicos, se indica el
tamaño mínimo de muestra que se debe tomar, tanto en unidades (frascos, botes, latas, cajas, etc. Según sea la
presentación comercial del producto), como en masa o volumen: gramos (g), kilogramos (kg) o litros (l).
Nivel de análisis y mínimo tamaño de la muestra para su entrega al laboratorio.
No. Producto Cantidad mínima Cantidad adicional
especial
Básico Microbiológico Fisicoquímicos Metales pesados Plaguicidas Otros
1 Agua purificada 2 Un o 2 l 1l 1l 1l
2 Hielo 2 Un o 2 g 1 kg 1 kg 1 kg
3 Leche pasteurizada, no 2 Un 2 l 1l 1l 2l
pasteurizada
4 Leche ultrapasteurizada 2 Un 2 l 1l 1l 2l
5 Leche evaporada 2 Un o 25 g 1 Un 2 Un 2 Un 2l
6 Leche condensada 3 Un o 250 g * 1 Un
azucarada
7 Leche deshidratada 2 Un o 500 g * 250 g 2 kg
8 Leche rehidratada 2 Un o 2 l * * 2 UN o 2l 1kg Radioactivo
9 Quesos 2 Un o 500 g 250 g 250 g 1 kg
10 Mantequilla 2 Un o 500 g 250 g 250 g 1 kg
11 Grasa butírica 2 Un o 500 g 1 kg
12 Sueros 2 Un o 500 g * 250 g 2 kg
13 Crema 2 Un o 500 g * 250 g 1 kg
14 Yogurt 2 Un o 500 g * 1 kg
15 Jocoque 2 Un o 500 g * 250 g
16 Cajeta 2 Un o 250 g * 500 g
17 Flan 3 Un o 500 g *
18 Helado 2 Un o 500 g * 250 g
19 Leche reconstituida 2 Un o 2 l 1l 2l 2l
20 Cremas vegetales 2 Un o 500 g * 250 g
21 Imitación de quesos 2 Un o 500 g * 250 g
22 Helado de crema vegetal 2 Un o 500 g * 250 g
23 Carne 1 kg * 1 kg Biológico
24 Productos de carne 2 Un o 250 g 250 g 250 g 500g 1 kg
25 Aves 1 Un o 250 g Pieza completa
26 Productos de la pesca 2 Un o 500 g 250 g 1 kg 1 kg Biológico
(pescados y mariscos)
27 Productos industrializados 2 Un o 500 g 250 g 500 g 1 kg
de la pesca
28 Productos derivados de la 2 Un o 500 g 2 Un ó 200 2 Un o 200 500 g 500 g
pesca g g
29 Huevo 4 Un o 200 g 1 Un o .5 l 0.5 l
30 Huevo y sus derivados 4 Un o 200 g 1 Un o .5 l 0.5 l
31 Aceite comestible 1 Un o 1 l 1 Un o .5 l 0.5 l
32 Manteca de cerdo 1 Un o 1l 1 Un o .5 l 0.5 l
33 Sebo 1 Un o 1 l 500 g 500 g
34 Manteca vegetal 1 Un o 1 l
35 Grasas compuestas 1 Un o 1 kg 500 g 2 kg 500g
36 Aditivos para alimentos 200 g 250 g 500 g
37 Frutas, hortalizas, legumbres 1 kg ó 5 Un * 500 g
frescas procesadas
38 Fórmulas para lactantes 2 Un o 500 g * 500 g
39 Alimentos envasados para 2 Un o 500 g 250 g
lactantes y niños de corta edad
99

33. 40 Alimentos a base de 2 Un o 500 g
cereales para lactantes
41 Cacao y sus derivados 250 g 500 g 2 kg
42 Cocoa 250 g 500 g 2 kg
43 Café y sus derivados 250 g 500 g 2 kg
44 Café tostado 250 g 500 g 2 kg
45 Té y sus derivados 500 g * 500 g 2 kg
46 Productos para infusiones 500 g * 500 g 2 kg
47 Bebidas no alcohólicas 5 Un * 3 Un
48 Productos para regímenes 5 Un * 3 Un
especiales
49 Productos para preparar 2 Un, 1l ó * 1 l ó 250 g
bebidas no alcohólicas y 500 g
refrescos
50 Bebidas no alcohólicas 2 Un, 1 l ó * 1 l o 250 g
congeladas 500 g
51 Cereales 2 Un ó 500 g * * 3 kg 3 kg
52 Harinas de cereales 500 g * 500 g 3 kg 3 kg
53 Harina de leguminosas 500 g * 500 g 3 kg 3 kg
secas y sus derivados
54 Productos de harina de 2 Un o 1 kg * 500 g 3 kg 3 kg
cereales
55 Productos amiláceos y 2 Un o 500 g * 250 g 500 g 500g
frituras
56 Edulcolorantes nutritivos 2 Un o 500 g 2 Un o 500g 250 g 500 g
57 Gelatinas y sustitutos 3 Un ó 750 g 250 g
58 Golosinas 4 Un o 400 g *
59 Condimentos 500 g
60 Sal 1000 g *
61 Aderezos 2 Un ó 500 g * 250 g
62 Conservas y enlatados 6 Un del *
ácidos mismo lote
63 Alimentos preparados 2 Un ó 200 g * 200 g
deshidratados
64 Conservas y enlatados de 6 Un del * 1 Un del 2 Un o 500 g
baja acidez mismo lote mismo lote
65 Alimentos preparados 1 Un o 250 g 1 Un o 250g *
refrigerados o congelados
66 Bebidas alcohólicas 2 Un o 1500 ml * 1 Uno 750 ml 1 Un o
750 ml
67 Bebidas alcohólicas 1 Un o 250 g * 1 Un o 750 ml 1 Un o
750 ml
fermentados
68 Bebidas destiladas 2 Un o 1500 ml * 1 Un o 750 ml 1 Un o
750 ml
69 Licores 2 UN o * 1 Un o 750 ml 1 Un o
750 ml
1500 ml
70 Bebidas alcohólicas 2 Un o 1500 1 Un o 750 ml 1 Un o 750
preparadas y envasadas ml ml
71 Tabaco, sus productos y 5 Un o 1 envasa( 5 Un o 1 envase
tabaco pipa)
sucedáneos (tabaco de pipa)
72 Productos para modificar el 2 Un o 50 – 2 UN 50 – 100
ml
olor del cuerpo 100 ml
73 Productos para el cabello 5 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1
ml, 3 Un ó 200 g
Un
74 Productos para el cuerpo 4 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1
ml, 3 Un ó 200 g
n
Un
75 Productos para manos y 4 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1
ml, 3 Un ó 200 g
uñas Un
100

34. n
76 Productos para el aseo de 6 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1
ml, 3 Un ó 200 g
la persona n
Un
77 Productos de aseo 200 g 2 Un o 50 – 100 Biol 1
ml, 3 Un ó 200 g
n
Un
78 Productos repelentes a 4 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1
ml, 3 Un, 2 Un o
insectos (que se aplican 50 – 100 ml,
Un
directamente sobre la piel)
79 Faciales cremas, 5 Un * 2 Un 3 Un Biol
maquillajes, rubores,
mascarillas, delineadores,
lápices, etc.)
80 Para niños (talcos, aceites, 5 Un * 2 Un 3 Un Biol
etc.)
81 Alimentos preparados listos 250 g 250 g
para servirse
Tomado de:
HERRAMIENTAS PARA EL MUESTREO
Las herramientas de que puede disponer un analista varia desde instrumentos comunes para fines de carácter
general hasta herramientas especiales, que han de utilizarse en determinadas situaciones para hacer exámenes
específicos de productos alimenticios especiales. Todo el equipo para el muestreo deberá estar limpio y seco
cuando vaya a utilizarse.
Para la toma de muestras para análisis microbiológico, es esencial disponer herramientas de muestreo,
envueltas individualmente, previamente esterilizadas, y de recipientes irrompibles esterilizados.
Las herramientas tales como los espátulas, cucharillas, etc., deberán ser lisos, sin ningún diseño en la superficie,
totalmente de acero inoxidable, envueltos individualmente y esterilizados en la autoclave antes de llevarlos al
lugar donde van a utilizarse.
Cuando sea necesario esterilizar una herramienta de muestreo en la fábrica, el analista debe seguir el siguiente
procedimiento: lavarla perfectamente en la pila de lavado del equipo de la empresa, secarla con una toalla limpia;
flamearla después con la llama de una lámpara de alcohol, y enfriarla antes de utilizarla, la herramienta puede
enfriarse con alcohol.
INSTRUMENTAL Y EQUIPO BÁSICO DE MUESTREO
- Recipientes isotérmicos: Cajas de material aislante equipados con tapas y espacios suficientes para colocar
los refrigerantes y las muestras que deberán permanecer en la temperatura deseada hasta su ingreso al
laboratorio.
- Bolsas limpias de polietileno estériles de varias medidas para submuestras.
- Pinzas, tijeras, espátulas, cucharas, cuchillos afilados, termómetro con un intervalo de 0 a 100 grados
centígrados; hielo o líquidos precongelados.
- Hielo seco para las muestras congeladas, hielo o recipientes con líquido precongelados para la refrigeración.
- Papelería: plumones marcadores de agua, etiquetas adhesivas, masking tape, diurex, plumas.
- Bata, cubrebocas, malla para pelo o cofia.
- Herramientas comunes como alicates, destornilladores y cuchillos, son útiles para abrir los envases, cortar
sacos y vaciar los productos alimenticios. Puede disponerse de una herramienta especial para abrir las cajas
de cartón que se utilizan para el transporte, ocasionándoles daños mínimos.
- Una lámpara sorda de luz brillante es muy útil cuando hay que trabajar en zonas poco iluminadas. En zonas
polvorientas como molinos harineros o elevadores de grano, deberá utilizarse una linterna a prueba de
explosiones. Se pueden utilizar unas tijeras para cortar los embalajes de tela, o unas pinzas para manipular
los cortes hechos en los sacos.
101

35. - Una taladradora seca tubular puede emplearse para la harina, la leche en polvo y los productos lácteos en
polvo. Usualmente habrá que sacar el producto de la probeta con una espátula. Esta probeta no deberá
usarse para la toma de muestras microbiológicas. Puede utilizarse también un cucharón adecuado de acero
inoxidable o aluminio.
- Sondas o probetas especiales se usan para el muestreo de la mantequilla y el queso. Se hace penetrar la
probeta en el producto, y después se la hace girar para cortar un trozo cilíndrico. Para la toma de muestras
de queso solamente, se necesitará un compuesto obturante hecho a base de parafina o cera de abejas, para
cerrar de nuevo herméticamente las zonas de las que se han tomado las muestras.
- Un manguito o probeta para harina sirve para el muestreo de las tolvas (fondos) de los elevadores de
molinos harineros u hornos de pan de grandes dimensiones. La probeta se clava en el material estático del
equipo, y después se saca para su examen.
- Se emplean cucharas y pipetas de plástico desechables esterilizadas para un muestreo aséptico destinado al
análisis microbiológico. Podrán utilizarse también guantes de cirujano de látex o PVC para poder manipular
los instrumentos de muestreo sin introducir microorganismos en la muestra.
- Un tamiz metálico o un recogedor se utilizan para controlar si los cereales a granel tienen insectos, heces de
roedores y otras materias extrañas.
- Termómetro completamente metálico, o dos si es necesario para abarcar la escala de temperatura de -35 a
100 grados centígrados, con intervalos de graduación no superiores a 2 grados centígrados. Su precisión
deberá calibrarse regularmente con los laboratorios de metrología oficiales.
- Se usará alcohol isopropilíco o etílico al 70 %, que el muestreador puede llevar en una botella de plástico,
para desinfectar las herramientas de muestreo. Podrán utilizarse indicadores de papel para determinar si
existen residuos de cloro y tomar el pH del producto, pero este ensayo no debe constituir un sustituto de
determinaciones precisas de pH.
- Papel aluminio. Papel estraza.
- Algodón.
- Cerillos o encendedor.
- Lámparas de alcohol.
- Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio para la toma de muestra
- Hielo o bolsas refrigerantes.
- Guantes estériles
EQUIPO
Autoclave equipada con termómetro de mercurio calibrada 121 ° C ±1 ° C
Horno que alcance una temperatura de 170 ± 5°C.
Termómetros metálicos (dos si es necesario) para toma de temperatura de alimentos intervalos de -40 a 100°C,
con intervalos no superiores a 1 °C.
Preparación del Material para la Toma de la Muestra.
1.- Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de muestras,
que van a estar en contado directo con el alimento, debe estar limpio, estéril y libre de substancias que pudieran
afectar la viabilidad de los microorganismos.
2.- El material para la toma de muestra que requiera esterilización, se envolverá en forma individual debidamente
identificado, con papel de Kraf antes de esterilizado.
3.- La tapa de los frascos se protegerá con papel de estraza o aluminio fijándolos adecuadamente.
4.- Colocar cinta testigo en el material a esterilizar.
5.- El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C durante 15
minutos o en homo a 170°C por dos horas, de acuerdo a su naturaleza.
6.- Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminación posterior.
102

36. 7.- De ser necesario, si se requiere mayor número de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparlos
con etanol o isopropanol al 70%, posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes estériles para evitar su
contaminación o inmediatamente utilizarlos.
PROCEDIMIENTO
El procedimiento para la toma de muestra, dependerá del tipo de producto y de la finalidad del examen:
OBTENCIÓN
1.- La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a
cabo en forma aleatoria y no aséptica, tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis,
enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.
2.- Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos y extraer la muestra en
condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana.
3.- Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente
asépticas.
4.- Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben tomarse en áreas donde las condiciones
sanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las mismas.
5.- Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo se lave las manos antes de desarrollar éste. Para
muestreo aséptico debe utilizarse bata, cofia y cubreboca. De ser necesario el contacto directo de las manos con
el producto deberán usarse guantes estériles.
6.- La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de
muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de
los envases y evitar que la tapa se contamine.
7.- Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la
que se envía para su análisis.
8.- Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los
alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea
normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en
que se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a
temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración.
9.- En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y
después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.
10.- En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios
estériles como sacabocados, cucharas y o cuchillos.
11.- En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra
representativa.
12.- Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel,
antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida
con el flujo.
PRODUCTOS PERECEDEROS
1.- Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a granel se consideran como
alimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no está definida su vida útil o de anaquel, se
determinará la fecha de caducidad, con base en productos de características similares.
2.- Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se consideran para fines de esta norma,
como no perecederos.
3.- Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria será únicamente por
duplicado, la primera se enviará al laboratorio oficial para su análisis y la segunda se quedará en poder del
interesado para su análisis particular si es necesario.
4.- En caso de impugnación presentada en los términos que señala la Ley General de Salud, en productos
perecederos, la toma de muestra subsecuente la llevará a cabo personal autorizado tomando como muestras en
forma aleatoria del lote existente o la cantidad o número estipulado en la norma correspondiente del producto, la
103

37. cual será analizada por el laboratorio acreditado para realizar tercerías y el resultado obtenido será el que
definitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. El
número de submuestras del total que determinen el cumplimiento serán tres de cinco o lo que estipule la norma
correspondiente.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
1.- En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o después
de colocar en él la muestra, mediante rótulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos:
2.- Fecha, lugar, hora del muestreo, número de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede.
3.- La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco la caja, en el nudo o cierre de la bolsa en
forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.
CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE
1.- El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteración
o contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa.
2.- Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los alimentos perecederos se
transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el
momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección.
En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C, empleando para conservarla hielo
seco. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con liquido refrigerante o hielo potable
contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases
o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.
3.- En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una
cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en
contacto con el exterior de la envoltura.
4.- En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o contaminen con otras.
5.- Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura
ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C
6.- Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias
químicas.
7.- Las muestras que se entreguen al laboratorio de preferencia deberá acompañarse de un informe y el número
de unidades y/o cantidad.
a.- Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante, representante y/o distribuidor.
b.- Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca comercial y cualquier otra información
que se considere importante.
c.-Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes
de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis
microbiológicos que sean necesarios.
d.- La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el
cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación.
Tomado de: NOM-109-SSA1–1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras
de alimentos para su análisis microbiológico
MUESTRAS PARA AGUA
1 Frasco para muestra de agua.
a.- Lavar y secar perfectamente un frasco de boca ancha de 500 ml con tapa.
b.- Si la muestra proviene de agua que no ha sido clorada esterilizar el frasco en estufa a 170º C, por una hora
o a 121º C durante 15 min.
c.- Si la muestra de agua posee cloro residual los frascos se deben esterilizar en estufa a 170º C, por una hora
o en autoclave a 120º C durante 15 min, los cuales deben contener 0.1 ml de tiosulfato de sodio al 3% por cada
125 ml de capacidad de los mismos.
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