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Celulas NKT en cáncer gastrico
- 1. Universidad de Chile Facultad de Medicina Instituto de Ciencias Biomédicas Programa Disciplinario de Inmunología Estudio de células NKT en cáncer gástrico humano Gustavo González Valenzuela Sebastián Merino Núñez Unidad de Investigación, 2º año Tecnología Médica Tutora: Dra. Carolina Hager Ribeiro Laboratorio de Inmunovigilancia y Evasión Inmune Programa Disciplinario de Inmunología Facultad de Medicina Universidad de Chile
- 2. Cáncer Gástrico • Segunda causa de muerte por cáncer en el mundo 800.000 muertes/año • Principal causa de muerte por cáncer en Chile 3.000 muertes/año • Tasa de sobrevida a los 5 años: 20% • Metástasis ocurre en 80-90% de los individuos RadioGraphics 26 (4), 2006 Guía Clínica del Cáncer Gástrico, MINSAL, 2009
- 3. Respuesta Inmune contra el Cáncer Gástrico Modificado de Smyth, Nature Immunology, 2001
- 4. Células NKT • • Subclase de linfocitos T (LT). • Expresan en su membrana moléculas tanto de células NK como de LT. TCR (Vα24β11), CD56, CD3, entre otras • Poseen RNAm almacenados para diversas citoquinas, quimioquinas y enzimas. • Reconocen, a través del TCR, glicolípidos asociados a CD1d, presentados por células presentadoras de antígenos (APC). Frecuencia: • 0,2% del total de linfocitos T en sangre periferica (similar en médula ósea y bazo). • 0,01% del total de linfocitos T del timo 1% en hígado.
- 5. Activación y función de las células NKT Cerundolo et al., Nat Rev Immunol, 2009 Taniguchi et al., Nat Immunol, 2003
- 6. Racional En algunos tipos de cáncer: • La frecuencia de células NKT se encuentra disminuida. • Las células NKT presentan una capacidad reducida para producir IFN-γ. Por lo tanto, ¿la regulación inmune mediada por estas células estaría comprometida en cáncer? ¿Cuál es el rol de estas células en cáncer gástrico? • Frecuencia en sangre y tejido tumoral. • Función citotóxica y producción de citoquinas.
- 7. Hipótesis La frecuencia de células NKT en la sangre periférica de pacientes con cáncer gástrico se encuentra disminuida con respecto a la de individuos sanos.
- 8. Objetivos específicos Medir la frecuencia de células NKT en la sangre de individuos sanos. Medir la frecuencia de células NKT en la sangre de pacientes con cáncer gástrico. Medir la frecuencia de células NKT en mucosa gástrica y tejido tumoral de pacientes con cáncer gástrico.
- 9. Métodos Muestra sanguínea de pacientes con cáncer Preparación de batería de tubos Lisis de eritrocitos por gástrico e individuos normales en tubos con 100 μL de sangre total cada uno medio de Buffer ACK (1X) heparinizados Lavado de muestras con PBS-SFB y posterior centrifugado
- 10. Métodos Maceración del tejido tumoral Obtención de células en suspención (y de mucosa gástrica adyacente al tumor) Células tumorales que se someterán a análisis
- 11. Proceso común de tinción con anticuerpos y citometría de flujo Muestras tisulares y sanguíneas marcadas con Incubación por 30 min a 4º C anticuerpos específicos (conjugados a fluorocromos) para diversos marcadores de células NKT Citómetro FACScalibur y datos obtenidos por medio del software CellQuest Una vez marcadas, las muestras se transfieren a tubos de citometría
- 12. Citometría de flujo • Emisor de rayo láser. • Flujo de solución + buffer. • Detector de dispersión frontal. • Barra de oscurecimiento. • Detector de dispersión lateral. • Filtros de fluorescencia. • Computador + Software. http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC
- 13. Resultados NKTs de sangre periférica – Individuos sanos (n=2) TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC Tinción: anti-CD3 - APC anti-CD56 - PE anti-TCR (Vα24β11) - FITC CD56 - PE CD56 - PE TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC Tinción: anti-CD3 - APC anti-CD56 - PE anti-TCR (Vα24β11) - FITC CD56 - PE CD56 - PE
- 14. Resultados NKTs de sangre periférica – Paciente CG25 TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC CD56 - PE CD56 - PE Tinción: anti-CD3 - APC anti-CD56 - PE anti-TCR (Vα24β11) - FITC
- 15. Resultados NKTs de sangre periférica – Paciente CG26 TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC CD56 - PE CD56 - PE Tinción: anti-CD3 - APC anti-CD56 - PE anti-TCR (Vα24β11) - FITC
- 16. Resultados Frecuencia de células NKT e n la sangre periferica de pacientes con cáncer gástrico % células Vα24β11+ de linfocitos totales 0.250 n pacientes = 2 n controles = 2 0.125 0.000 controles sanos pacientes CG Individuos
- 17. Resultados NKTs de mucosa gástrica “normal” – Paciente CG25 TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC CD56 - PE CD56 - PE Tinción: anti-CD3 - APC anti-CD56 - PE anti-TCR (Vα24β11) - FITC
- 18. Resultados NKTs de tejido tumoral – Paciente CG25 TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC CD56 - PE CD56 - PE Tinción: anti-CD3 - APC anti-CD56 - PE anti-TCR (Vα24β11) - FITC
- 19. Resultados NKTs de mucosa gástrica “normal” – Paciente CG26 TCR (Vα24β11) - FITC CD3 - APC CD56 - PE CD56 - PE Tinción: anti-CD3 - APC anti-CD56 - PE anti-TCR (Vα24β11) - FITC
- 20. Resultados Frecuencia de células NKT en la mucosa gástrica y te jido tumoral de pacientes con cáncer gástrico % células Vα24β11+ de linfocitos totales 1.8 n pacientes = 2 1.2 n controles = 2 0.6 0.0 mucosa tumor Individuos
- 21. Resultados Frecuencia de células NKT en pacientes con cáncer gástrico % células Vα24β11+ de linfocitos totales 1.8 n pacientes = 2 1.2 n controles = 2 0.6 0.0 sangre mucosa tumor Muestra
- 22. Conclusiones En pacientes con cáncer gástrico, el porcentaje de células NKT en sangre periférica son menores que en individuos sanos. El porcentaje de células NKT en tejido tumoral y mucosa gástrica de pacientes con cáncer gástrico son mayores que en la sangre del mismo paciente. Las células NKT podrían estar migrando desde la sangre periférica hacia el tejido tumoral y mucosa gástrica. Por lo tanto, las células NKT podrían estar cumpliendo un rol activo en la respuesta inmune contra el adenocarcinoma gástrico.
- 23. Proyecciones Correlacionar la frecuencia de células NKT con el estadío del tumor. Estudiar el perfil de citoquinas producidas por las células NKT presentes tanto en la sangre como en el tumor. Determinar el efecto del microambiente tumoral en la respuesta inmune y, más específicamente, sobre la acción de las células NKT en dicha respuesta.
Notas del editor
- Frente al cáncer el sistema inmune responde a través de reconocimiento antigénico por parte de las células dendríticas (CDs) de DAMPs expresados por las células tumorales. Estas a su vez presentan dichos antígenos a Linfocitos vírgenes en los linfonodos iniciando la diferenciación de los distintos tipos celulares linfocitarios, como también a células NK, y más relevantemente en este proyecto, a células NKT. One of the earliest steps toward mounting an adaptive response to TAAs is the capture and presentation of these molecules by professional APCs such as DCs. Additionally, to present costimulatory molecules, such as B7, to T lymphocytes, APCs must be activated by danger signals. In conjunction with costimulation (for example, B7-CD28 interaction), activated APCs carry TAAs to the lymph nodes where the TAA-derived peptides are presented via MHC class II molecules to CD4+ and MHC class I molecules to CD8+ T lymphocytes. Stimulated CD4+ T cells subsequently express CD40L, which, in turn, further stimulates CD40-expressing APCs. B lymphocytes (not shown) are also likely to be involved in this immune response.TAA-specific lymphocytes develop into activated effector cells—CD8+ CTLs and CD4+ T helper cells—with the ability to migrate into the tissue to mount an attack against the developing melanoma.This is likely to involve both CD4+, CD8+ T cells and local APCs (possibly B cells, macrophages and DCs). (APC, antigen-presenting cell; CTL, cytotoxic T lymphocyte; DC, dendritic cell; HSP, heat shock protein;TH,T helper lymphocyte.)
- Chicos, cambié algunas cosas en esa diapo, que quedó muy bien.
- The fact that some types of cancer iNKT cells present deffective capacity to produce IFN-γ, a TH1 cytokine important for tumor elimination, provides the basis for a compromised immune regulation of these cells in cancer. Likewise, it is possible that, in GC, iNKT cell cytokine production can also be skewed to a suppressive and tolerogenic phenotype characterized by higher IL-10 and/or TGF-β production by these cells, which could favor the development of an immune suppressive response mediated by Tr1 and/or Th3 cells in detriment of a TH1 response. So far, there is no evidence for the frequency of tumor-derived and peripheral blood iNKT cells in GC; moreover, their functional activity and cytokine profile have not been addressed either. Therefore, a correlation of these iNKT cells features with patient characteristics, the stage and the type of the tumor could help define the contributory role of iNKT cells in the development and prognosis of gastric cancer. Based on what has been previously discussed, we propose here that a population of T lymphocytes that infíltrate the gastric adenocarcinoma tissue and that are also present in the peripheral blood of GC patients is composed of increased numbers of iNKT cells that secrete immunosuppressive cytokines, such as TGF-β and/or IL-10. Concomitantly, these cells present decreased capacity to produce IFN-γ and/or TNF-α, which, along with increased secretion of IL-10 and/or TGF-β, would create a tolerogenic microenvironment that would favor Tregs development, especially Tr1 and Th3-type cell subsets, thus contributing to tumor immune escape and tumor progression.
- Doidinhos!!! La foto es del freezer -80!!! Mejor poner una del refri, mismo… ;-))