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Delicious)
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mM forpearsand 232.80 mM for apples...
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparacióndel extractoenzimático
Las frutas fueronadquiridasenmercadoscomunitariosyconservadasa4°C p...
Se determinóenprimerlugarel pHóptimopara la polifenoloxidasade perayde manzana
analizadas enel rango de pH 4-5,5 en50 mM d...
Los datoscinéticosfueronrepresentadoscomolainversade laactividadversuslainversade la
concentracióndel sustrato,de acuerdoa...
Efectode la temperaturasobre laactividadde PFO
En la figura3 se muestrael comportamientoenzimáticorespectode latemperatura...
a 50°C, la actividadde lamismadisminuye un40%, y se encuentra prácticamente inactivada
calentandodurante 10 minutosa 70°C....
Los valoresdeterminadospara KM indicanque PFOde peratiene mayorafinidadporcatecol que
PFOde manzana.Además,si tenemosen cu...
REFERENCIAS
Cash,J.N.,W.A.SistrunkyC.A Stutte,Characteristicsof Concordgrape polyphenoloxidase involved
injuice colorloss,...
Siddiq,M.,K.Sinhay J.N.Cash,Characterizationof polyphenol oxidasefromStanleyplums.Journal
of FoodScience, 57, 1177-1179 (1...
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Caracterización de polifenoloxidasa extraída de perafds

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Caracterización de polifenoloxidasa extraída de perafds

  1. 1. Caracterizaciónde PolifenoloxidasaExtraídade Pera(cv.Packam´s Triumph) yManzana (cv. Red Delicious) Characterizationof PolyphenyloxidaseExtractedfromPears(cv.Packam´sTriumph) andApples(cv . RedDelicious) EstelaGasull y DanielaBecerra Cátedrade FisicoquímicaAplicada(Ing.enAlimentos),Áreade QuímicaFísica,Facultadde Química,Bioquímicay Farmacia, UniversidadNacional de SanLuis,Ejércitode losAndes950 2° Piso,5700 San Luis-Argentina(e- mail:esgasu@unsl.edu.ar) Resumen Se estudiaronlascaracterísticasde polifenoloxidasa(PFO) extraídade perasPackam´sTriumphy manzanasRedDelicious.El pHóptimoy latemperaturaóptimafueron6,5 y 25°C para pera,7 y 30°C para manzana,utilizando50mM de catecol en bufferfosfato comosustrato.Losvalores obtenidosparaKMfueron13,24 mM (pera) y232,80 mM (manzana),mientrasque losvalores obtenidosparaVmax fueron1590 U/mL E (pera) y 5464 U/mL E (manzana),utilizando50 mMde catecol como sustrato.En este estudiose probarontresinhibidoresdel PFO,resultandoserel más efectivoel ácidoascórbico.Estudioscinéticosdemostraronque lainactivacióntérmicade PFO nactivacióntérmicade PFO(pera) fueron15309 J/Mol y -102 J/KMol -196 J/K Mol. Palabrasclave:polifenoloxidasa,cinéticaenzimática,pera,manzana,inactivacióntérmica Abstract A studywasmade of the propertiesof polyphenyloxidase (PPO) extractedfromPackam´sTriumph pearsand RedDeliciousapples.OptimumpHandtemperature were 6.5and 25°C for pears,pH 7
  2. 2. and 30°C forapples,with50 mM catechol inphosphate bufferassubstrate.KMvalueswere 13.24 mM forpearsand 232.80 mM for apples,whereasVmax valueswere 1590 U/mL E forpears,and 5464 U/mL E forapples,using50 mM catechol as a substrate.Three PPOinhibitorswere testedin thisstudywiththe most effective inhibitor beingascorbicacid.Kineticstudiesshowedthatthe thermal inactivationof PPOfollowedfirst-orderkinetics.The activationenthalpy(H #) and activationentropy(S #) forPPOheatinactivationinpearswas15309 J/Mol and -102 J/KMol respectively.In applesthe H# was 11582 while the S# was-196 J/K Mol. Keywords:polyphenyloxidase,enzymatickinetics,pears,apples,thermal inactivation INTRODUCCIÓN Las polifenoloxidasas(PFO)que se encuentranenlasplantassonlasresponsablesde las reaccionesde pardeamientoenzimático que ocurrendurante el almacenamiento,manipulacióny procesamientode frutasyvegetales.Laspolifenoloxidasas,tambiénconocidascomotirosinasas, fenoloxidasasas,monofenoloxidasasocresolasas,catalizanlahidroxilaciónde monofenolesa ortodifenoles,posteriormenteoxidadosaortoquinonas,lascualesse polimerizan dandolugara pigmentosque presentancolormarrón,rojoo negro,dependiendode loscomponentesnaturales presentesenlostejidosvegetales.Estasreaccionesmodificanlascaracterísticas organolépticasy nutricionales del alimento,depreciandosucalidad. (McEvilyetal.,1992; Friedman,1996; Matheis & Whitaker,1984; Sanchez-Ferreretal.,1995). Ocasionalmente,este cambiode coloresdeseado. La actividadde lasenzimaspolifenoloxidasaspresentesenfrutasyvegetales puede serinhibida por calentamientooporremociónde algunode sus componentesnecesarios:O2,enzima,Cu2+o sustrato(Guerrero-Beltránetal.,2005). Agentesreductores,antioxidantese inhibidores enzimáticosprevienenel pardeamientoreduciendoquímicamentelasortoquinonasadifenoles coloreados,inhibiendolaactividadde laenzimapordisminucióndel pH,oquelandoel Cu2+en el alimento. En este trabajo,se aislóy caracterizóla polifenoloxidasade pera(cv Packam´sTriumph) y de manzana(cv. RedDelicious),cosechadasenArgentina,entérminosde activaciónyestabilidad térmica,pH óptimoyestabilidad,inhibidoresyparámetroscinéticosy termodinámicos, conel objetivode ayudarapredecirel comportamientode laenzimapresente enlasmencionadas variedades.
  3. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Preparacióndel extractoenzimático Las frutas fueronadquiridasenmercadoscomunitariosyconservadasa4°C por 24 horas. La extracciónde laenzimapara peray manzana se llevóacabo siguiendoel procedimientode GauillardyRichard-Forget (1997) con algunasmodificaciones. Se homogeneizarona4°C, 100 gramos de la frutapor 5 minutosenbufferfosfato50mM, pH=6,5 conteniendoácidoascórbico20 mM, etilenglicol 2% y Tritón X-100, 1%. La mezclafue agitadaa 4°C durante 12 horas. La suspensión fue centrifugadaa4000 rpm durante 15 minutos.Luegode separarel sólido, el líquidocolectado se centrifugónuevamente (15minutos, 14000 rpm) enuna centrífuga refrigeradaBeckmanJ2-HS y el sobrenadante recolectadoconstituyóel extractode laenzima utilizadopararealizarlosensayos. Actividadde polifenoloxidasa La actividadde PFOfue determinadaaplicando el métodopropuestoporEspinetal.,(1995) utilizandounespectrofotómetroShimadzuUV 160-A,de doble haz,concontrol de temperatura, equipadoconceldasde cuarzode 1 cm de caminoóptico.Se determinóexperimentalmente la longitudde ondacorrespondiente alamáximaabsorciónparaambospigmentos,formadosporla oxidaciónde catecol por PFOde peray manzana.Estos valoresestánde acuerdocon el rangode máximaabsorción(390-480 nm) para quinonasreportadoporStauffer(1989). De estamanera,se determinólaactividadde laenzima midiendoel aumentode absorbanciaa 420 nm(pera) y a 400 nm(manzana).La velocidadinicial fue calculadaapartir de la pendiente de la curva absorbanciaversustiempo. Se definióunaunidadde actividadde PFOcomoel aumento de 0,001 unidadesde absorbanciaporminutoypor mL de enzima.Paralos distintosensayosse utilizaron3mL de soluciónbufferalosque se adicionócatecol,de maneratal que la concentracióndel mismoenlamezclafue 50 mM, y 200 mL (pera) ó 25 mL (manzana) del extractode la enzima.Se realizaronmedidasde absorbanciaalarespectivalongitudde ondade máximaabsorbancia,cada10 segundos,durante 10 minutos,a25°C. EstabilidadypH óptimo
  4. 4. Se determinóenprimerlugarel pHóptimopara la polifenoloxidasade perayde manzana analizadas enel rango de pH 4-5,5 en50 mM de bufferacetato,6,5-7,5 en 50 mMde buffer fosfatoy7,5-9,5 en 50 mMde Tris-HCl.El sustratofue 50 mM de catecol,y se utilizaron200 mL (pera) y25 mL (manzana).Latemperaturade trabajofue 25°C. Para determinarel pHde estabilidadde laenzima,se incubóel extractocrudo de la mismaen3 mL de soluciónbuffer(pHentre 4 y 9,5) durante 24 horasa 4°C. La actividadresidual de laPFOfue determinadacomoporcentaje respectode laactividadal pHóptimo,utilizando50 mMde catecol como sustrato. Actividadyestabilidadtérmica La actividadde PFOde pera y manzanafue obtenidaadistintastemperaturascomprendidasentre 14 y 48°C al pH óptimode cada una de ellas.Lamezclade bufferysustratofue incubadapor 15 minutoshastalograr latemperaturadeseada.Laactividadde PFOa la temperaturaespecíficafue determinadaespectrofotométricamente poradicióndel extractode laenzimaalamezclatan rápidamente comofue posible. A losefectosde determinarlaestabilidadtérmicade PFO,se incubóalastemperaturas30, 40, 50, 60 y 70°C la soluciónde laenzimaen50 mMde bufferfosfatoal pH óptimode lasenzimas analizadasdurante 5,10, 20 y 30 minutos.Luegolamezclafue enfriadaenbañode hielo,yuna vezalcanzadala temperaturaambiente,se agregóel sustratoyfinalmentese determinóla actividadleyendoabsorbanciaa25°C. Los datosobtenidosapartir de losperfilesde actividadtérmicase utilizaronparaanalizar parámetrostermodinámicosrelacionadosconlasreaccionesde pardeamiento.Losdatospara la inactivacióntérmicade laenzimafueroncalculadoscomparandoloscambiosenlaactividadluego del calentamientoalasdistintastemperaturasrespectode laenzimasincalentar. Cinéticaenzimática
  5. 5. Los datoscinéticosfueronrepresentadoscomolainversade laactividadversuslainversade la concentracióndel sustrato,de acuerdoal métodode LineweaveryBurk(LineweaveryBurk, 1934). Utilizandocatecol comosustrato,trabajandoa la temperaturade 25°C, y al pH óptimode cada enzima,se determinaronlosparámetroscinéticos:laconstante de Michaelis-Menten(KM) y la velocidadmáxima(Vmáx), variandolasconcentracionesdelmismoenlamezclade lareacción entre 10-90 mM para peray 21-350 mM para manzana. Efectode los inhibidores Se analizóel efectoinhibitoriode ácidoascórbico(0,03-0,17 mM para pera y 0,03-0,31 mM para manzana),ácidobenzoico(0,21-0,82 mM para peray 0.20-0.80 mM para manzana) y cloruro de sodio(0,32-10,00 mMpara pera y 0,32-2,20 mMpara manzana) sobre la actividadde PFOde peray manzana,frente a catecol como sustrato.Para tal fin,se realizaronexperienciasutilizando 3mL de buffer pH óptimo,el extractoenzimático(200mL - 25 mL) y catecol 50 mMcomo sustrato,enpresencia de lasdistintas concentracionesde cadaunode losinhibidores,a25°C. RESULTADOS Y DISCUSIÓN EstabilidadypH óptimo En la figura1 se muestrael perfil de pHversusactividad parael extractoenzimáticode las muestrasanalizadas.Lascurvas obtenidasmuestran que laactividadde PFOde peraPackam´s Triumphesmáximaa pH 6,5, mientrasque PFOde manzanaRedDelicious presentasumáxima actividada pH 7. De acuerdocon losvaloresinformadosporlaliteratura,el rangode pH mas usual para la actividadóptimade PFOde ambas frutas es entre 5 y 7 (Rochay Morais, 2001; Weemaes et al.,1998). Se observatambiénque,apH muyalcalinos,mayoresque 8,5,la actividadde la enzimapresente en ambasfrutasanalizadasesprácticamentenula. En la figura2 se presentael perfil de actividadrespectodel pHde incubaciónde laenzima.Los resultadosestánexpresadoscomoactividadresidualrespectode laactividadque poseelaenzima al pH óptimo.Comose observaen la gráfica, el pH de máximaestabilidadde laenzimaes 6,5 para PFO de peray el intervalo6,5-7,5 para PFOde manzana.
  6. 6. Efectode la temperaturasobre laactividadde PFO En la figura3 se muestrael comportamientoenzimáticorespectode latemperatura.Losdatosse representancomoactividadresidual porcentual respectode laactividada la temperatura óptimade laenzimapara ambosextractos.Comose puede apreciar,latemperaturaóptimapara la actividadde PFOde peraes 25°C, mientrasque para manzana,la enzimamuestraunaactividad máximaa 30°C, perola mismadesciendebruscamente alos35°C, y a los 40°C, permanece prácticamente inactiva.Se hanreportado temperaturasóptimasde durazno(JenyKahler,1974), uva (Cash,etal.,1976), ciruela(Siddiqetal.,1992) y níspero(Dinceret al., 2002) en20, 25, 37 y 35 °C respectivamente. Fig.1: Actividadde PFOde peray manzanaen funcióndel pH.Condicionesdel ensayo:50mM de catecol,25°C. Pera, Manzana Fig.2: Incubaciónde PFOa distintospH.Condicionesdel ensayo:50 mM de catecol,25°C. Pera Manzana Se obtuvieronademáslosparámetrosde activaciónparapera:H#= 15309 J/Mol,S#= -102 J/KMol, G#298= 45705 J/Mol,mientrasque paramanzana losvaloresobtenidosfueron:H#= 11582 J/Mol, S#= -196 J/KMol, G#298= 69990 J/Mol.En general,se considera H#como una medidadel número de enlacesnocovalentesdestruidosparaformarel estadode transiciónque conduce ala inactivaciónde laenzima,y S# está relacionadoconel cambioque acompañala formación del estadode transiciónentre laenzimanetayel desordendel solvente. La figura4 presentalaactividadde PFOde pera como funciónde latemperaturade incubación, para distintostiemposde calentamiento.Se observaque lainactivacióntérmicade laenzimasigue una cinéticade primerorden.De la gráfica se desprende que incubandolaenzimadurante 30 minutosa 30°C, la mismapermanece inalterada,peroal calentar la enzimadurante 20 minutos
  7. 7. a 50°C, la actividadde lamismadisminuye un40%, y se encuentra prácticamente inactivada calentandodurante 10 minutosa 70°C. Fig.3: Temperaturaóptimade PFOde peray manzana.Condiciones del ensayo:50 mMde buffer fosfato(pHóptimo),50 mMde catecol. Pera Manzana Fig.4: Incubaciónde PFOde pera.Condicionesdel ensayo:50mMde bufferfosfato pH6,5, 50 mM de catecol.T=30, 40, 50, 60 y 70°C. En cuanto a la PFOde manzana,enla figura5 se observaque laenzimaesestable a30°C, disminuye un40%calentandodurante 20 minutosa 50°C, pero,a diferenciade loocurridoconla PFOde pera,la inactivaciónprácticamente total se produce calentando30 minutosa70°C. CinéticaEnzimática Los parámetroscinéticosobtenidosson:KM=13.27 mM y Vmáx=1590 U/mL E para peraPakam´s Triumph;KM= 232.80 mM y Vmáx=5464 U/mL E para manzanaRed Delicious.Este últimodato coincide conel valorKM= 230 mM, informadoporRocha yMorais (2001) para otra variedadde manzana,utilizandocatecol comosustrato. Fig.5: Incubaciónde PFOde manzana.Condicionesdel ensayo:50mM de bufferfosfatopH6,5, 50 mM de catecol.T=30, 40, 50, 60 y 70°C.
  8. 8. Los valoresdeterminadospara KM indicanque PFOde peratiene mayorafinidadporcatecol que PFOde manzana.Además,si tenemosen cuentaque larelaciónVmáx/KMmide laeficienciade la enzimafrente aundeterminadosustrato, losresultadosobtenidosnospermitenafirmarque, en nuestrocaso,PFO de pera(Vmáx/KM=119,8) presentómayorcapacidadde pardeamientoque PFOde manzana(Vmáx/KM=23,5). Efectode los inhibidoressobre laactividadde PFO El análisisde losdatosobtenidosal determinarel efectoinhibitorio,muestraque el inhibidormás potente paraPFO de las frutasanalizadas es ácido ascórbico,que presenta unI50% de 0.319 mM para peray 0.500 mM para manzana,mientrasque ácidobenzoicoyClNanomostraron efectoinhibitorioenel rangode concentracionesutilizadas.El ácidoascórbicoactúa más como un antioxidanteque comouninhibidor enzimáticoporqueel mismoreduce laquinonaformada inicialmente porlaenzimaal difenoloriginal,antesque se produzcanlasreaccionessecundarias, lascualesdan lugara laformaciónde lospigmentos.El ácidoascórbicotambiénhasidoreportado como causa irreversiblede inhibiciónenzimática(Golanetal.,1984). CONCLUSIONES Las modificacionesrealizadasalatécnicade extracciónutilizadaporGauillardyRichard-Forget (1997), fundamentalmente el agregadode tritónX-100,permitieronobtenerunmejor rendimiento enlaextracciónPFOde lasfrutasanalizadas.Losparámetroscinéticos obtenidos demuestranque PFOde manzanapresentaunamenorcapacidadde pardeamientofrentea catecol que PFOde pera,mientrasque losparámetrostermodinámicosparalasreaccionesde pardeamientoresultaronserdel mismoorden. Estosdatos,al igual que losvaloresde pH óptimo y estabilidad,comoasítambiénlosde estabilidadyactividadtérmica,contribuyenapredecirel comportamientode laenzimapresente enambasfrutas. AGRADECIMIENTOS El presente trabajose realizóconlosaportesde laSecretaríade CienciayTécnicade la Universidadnacional de SanLuis,SanLuis,RepúblicaArgentina.
  9. 9. REFERENCIAS Cash,J.N.,W.A.SistrunkyC.A Stutte,Characteristicsof Concordgrape polyphenoloxidase involved injuice colorloss,Journal of FoodScience,41, 1398-1402 (1976). [ Links] Dincer,B.,A.Colak,N.Aydin,A.Kadioglu, S.Guner,Characterizationof polyphenoloxidase from medlarfruits(MespilusgermanicaL.,Rosaceae), Food Chemistry,77,1-7 (2002). [ Links] Espin,J.C.,M. Morales,R. Varon, J. Tudela,y F. García-Casanovas, A continuous spectrophotometricmethodfordeterminingthe monophenolase anddiphenolase activitiesof apple polyphenoloxidase,Analytical Biochemistry,43,2807-2812 (1995). [ Links] Friedman,M.,FoodBrowningandits prevention:anoverview.Journal of Agriculture andFood Chemistry,45,1091-1096 (1996). [ Links] Gauillard,F.y F.Richard-Forget,Polyphenoloxidase fromWilliamsPear(Pyruscommunis L.,Cv Williams):activation,purificationandsome properties,Journal of FoodScience,74,49-56 (1997). [ Links] Golan,A., A. GoldhirshyJ.R Whitaker, Effectof ascorbic acid, sodiumbisulfite and thiol compoundsonmushroompolyphenoloxidase,Journalof Agricultural FoodChemistry,32,1003- 1009 (1984). [ Links] Guerrero-Beltrán,J.A.,B.G.SwansonyG.V.Barbosa-Cánovas,Inhibition of polyphenoloxidasein mangopuree with4-hexylresorsinol,cysteineandascorbicacid,LWT, 38, 625-639 (2005). [ Links] Jen,J.J.,yK.R. Kahler, Characterizationof polyphenoloxidase inpeachesgrowninthe Southeast, Hortscience,9,590-591 (1974). [ Links] Lineweaver,H.y D. Burk,The determinationof enzyme dissociationconstant,Journal of American Chemist´sSociety,56,658-661 (1934). [ Links] Matheis,G., y J.R.Whitaker,Modificationof proteinsbypolyphenoloxidase andperoxidaseand theirproducts,Journal of FoodBiochemistry,8,137-162 (1984). [ Links] McEvily, A.,R. Iyengar,yS. Otwell,Inhibitionof EnzymaticBrowninginFoodsandBeverages. Critical ReviewinFoodScience andNutrition,32(3),253-273 (1992). [ Links] Rocha, A.M.C.N. y A.M.M.B.Morais, Characterizationof polyphenoloxidase(PPO) extracted from“Jonagored” apple,FoodControl 12, 85-90 (2001). [ Links] Sanchez-Ferrer,A.,J.N.Rodríguez-Lopez,F.García-CasanovasyF.García-Carmona, Tyrosinase:a comprensive review of itsmechanism, Biochim. Biophys. Acta,1247, 1-11 (1995). [ Links]
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