Validacion

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  • NCCLS (The National Committee for Clinical Laboratory Standards) recomienda un mínimo de 4 y preferentemente 5 diferentes niveles de concentración. Se recomienda realizar 4 medidas o replicados de cada muestra o pool.
  • Interferencias   Def: el efecto de una sustancia presente en un sistema analítico que causa una desviación del valor medido del valor real , usualmente expresada como concentración o actividad. Puede ser: dependiente del analito o independiente del mismo y puede aumentar o disminuir la medida realizada
  • EXPERIMENTO DE INTERFERENCIA   ·          Se realiza para estimar el error sistemático causado por otros materiales que pueden estar presentes en la muestra a ser analizada. ·          Se preparan un par de muestras para testear por el método en estudio. ·          La primera se prepara agregando una solución del material que se sospecha interferente a una muestra de un paciente que contiene el analito. ·          La segunda se prepara diluyendo otra alícuota de la misma muestra con solvente puro que no contiene el interferente. ·          Se analizan ambas muestras por el método en estudio para ver si hay diferencia en los valores debida al agregado del interferente. Realizar duplicados. ·          Solución del analito: pueden usarse sol. estándar, muestras de pacientes o pooles pero se recomienda duplicar lo más posible la matriz.
  • EXPERIMENTOS DE REPLICACIÓN  Se realiza para estimar la imprecisión o error aleatorio del método. El propósito es observar la variación esperada en el resultado de un test bajo las condiciones de operación normal de un laboratorio.  Estima el error causado por factores como el pipeteo, condiciones de reacción (Tº, mezclado). Suele ser mayor en sistemas no automatizados.  Se emplean los resultados de 20 alícuotas de cada material y se calcula la media, el desvío estándar y el coeficiente de variación.
  • Número de muestras a usar   Mínimo de 40 para los dos test. Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de trabajo del método y debe representar el espectro de enfermedades esperadas en la aplicación de rutina del método. Si el nuevo método tiene como base un principio diferente es conveniente aumentar el nº a 100 o 150 para establecer la especificidad del método. Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado (a partir de dos alícuotas diferentes) en diferentes corridas o por lo menos en diferente orden.  
  • Análisis de datos:   Existe mucha discusión sobre cual es la mejor forma de analizar los datos. Graficar los resultados y hacer una inspección visual de los mismos Cualquier muestra con resultados discrepantes debe ser reanalizada para confirmar que la diferencia es real y no se debe a errores en el registro de valores o transposición de muestras. Para los métodos que se espera coincidan hacer primero un gráfico de “diferencias”. Las mismas deberán oscilar alrededor de la línea del cero. Ver el punto sospechoso en el gráfico del ejemplo. Además los puntos tienden a a estar encima de la línea del cero a bajas concentraciones y por debajo a altas sugiriendo que existen errores sistemáticos constantes o proporcionales.
  • Validacion

    1. 1. 2.11 Validación de parámetrosVALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS 1
    2. 2. ¿Qué características tengo que considerar cuando selecciono un método para incorporarlo a la rutina del laboratorio? 2
    3. 3. Se debe considerar:1. Uso que se le dará (rutina, confirmatorio)2. Nº de tests a realizar3. Instrumentación requerida4. Sensibilidad, especificidad, exactitud y precisión5. Costo6. Tipo de muestra7. Tipo de analito8. Seguridad9. Aceptación internacional y científica10. Que no sea obsoleto 3
    4. 4. Fases que debe pasar un método analítico antes de poder ser comercializado o empleado en el laboratorio DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYO VALIDACIÓN ANALÍTICA VALIDACIÓN CLÍNICA 4
    5. 5. ¿Cuándo es necesario validar? Cuando se está desarrollando una técnica nueva. Antes de incorporar una nueva técnica a la rutina del laboratorio. Cuando se desea comparar el desempeño de dos técnicas. 5
    6. 6. VALIDACIÓN “La validación de un método analítico es unproceso de evaluación sistemático para demostrar que el método cumple con los requisitos necesarios para el uso que se le va a dar”. 6
    7. 7. ¿QUÉ ES LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO?1. Validación es la confirmación mediante examen y aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso específico previsto (ISO 8402, ISO 17025).2. La validación debe ser tan exhaustiva como sea necesario para responder a las necesidades de la aplicación en cuestión.3. La validación puede incluir procedimientos para el muestreo, manejo y transporte de muestras. 7
    8. 8. VALIDACIÓN ANALÍTICAEstudia los parámetros de desempeño analíticodel método: Precisión Exactitud Especificidad Límite de detección Límite de cuantificación Linealidad e intervalo de linealidad Robustez 8
    9. 9. Validación Metodológica 1. Espectro de absorción 2. Estabilidad de la reacción de color 3. LinealidadVALIDACIÓN 4. Límite de dilución ANALÍTICA 5. Recuperabilidad 6. Sensibilidad 7. Límite de detección Validación Estadística 1. Precisión 2. Exactitud 9
    10. 10. VALIDACIÓN METODOLÓGICA 10
    11. 11. LINEALIDAD1. Es la capacidad de producir resultados proporcionales a la concentración del analito en las muestras dentro de un rango determinado de concentración ya sea directamente o por medio de una transformación matemática bien conocida.2. Se analizan muestras de concentraciones conocidas o series de muestras diluidas en al menos 5 niveles de concentración.3. Repetir 3 veces en forma independiente4. Se grafican los datos resultantes en el eje y y los valores conocidos o esperados en el x. calcular coeficiente de correlación, pendiente e intercepto 11
    12. 12. INTERVALO DE LINEALIDAD Y LÍMITE DE DILUCIÓN Absorbancia (A) Rango de linealidad Rango de Linealidad: 0 – 10 g/dL ∆A Límite de Dilución: ∆C 10 g/dL 2 4 6 8 10 12 g/dL Concentración (C)Rango de linealidad: intervalo entre las concentraciones más baja y más alta deanalito determinadas, para las cuales se cumple la ley de Beer. 12
    13. 13. Curvas de calibración 13
    14. 14. Errores de una calibración inadecuada 14
    15. 15. DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER RADIACIÓN POLICROMÁTICA 15
    16. 16. RECUPERACIONCapacidad de un método de determinar todo el analitopresente en la muestra, según el alcance del método(algunos solo determinan algunas especies del analito).La mejor manera de determinar la eficacia de extraccióndel método es adicionar diferentes concentraciones delanalito a las muestras y procesarlas por el métodocompleto. 16
    17. 17. Aunque es la manera más común de cuantificar larecuperación, el analito adicionado puede no enlazarse tanfuertemente a la matriz como el presente de manera naturaly dar como resultado la impresión de una elevada eficacia deextracción.La alternativa es efectuar el proceso con MR en la matrizdeseada, si existen; si estos MR han sido generadosmediante caracterización de muestras naturales el estudiode recuperación representará con mayor precisión laextracción de muestras reales. 17
    18. 18. ENSAYO DE RECUPERACIÓN• También llamado de adición estándar.• Se puede llevar a cabo de dos maneras: con placebo o con muestra, que se enriquece con estándar.• Realizar las medidas por triplicado. Criterio de Aceptación % de recuperación obtenido entre 85 - 115 % 18
    19. 19. SENSIBILIDAD La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito. También se indica mediante dos factores analíticos: 1. El Límite de Detección (LOD). 2. El Límite de Cuantificación (LOQ). 19
    20. 20. LÍMITE DE DETECCIÓN (LOD) Es la concentración más baja del analito que se puede detectar pero no necesariamente cuantificar. En general, es el punto al que la señal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida. Para algunos espectrofotómetros se puede establecer que el LOD es, aproximadamente, tres veces la desviación estándar. 20
    21. 21. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOQ) El LOQ es la concentración más baja del analitoque se puede determinar con una precisión yexactitud aceptables. Para calcular el LOQ se deben de definir por tantolos límites aceptables de precisión y exactitud. Se puede aproximar a la relación entre la precisiónde la medida analítica y la sensibilidad del método. 21
    22. 22. ROBUSTEZ Es una medida de la capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee información de su comportamiento en la rutina. Parámetros estudiados: 1. Efectos del congelado- descongelado 2. Tiempos de incubación 3. Temperaturas de incubación 4. Longevidad de los reactivos 5. Preparación de la muestra 6. Conservación de la muestra 22
    23. 23. ESPECIFICIDADHabilidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que se puedeesperar que estén presentes. 23
    24. 24. INTERFERENCIAS Efecto de una sustancia presente en una muestra que causa que el resultado de un test sea erróneo. Puede ser dependiente del analito o independiente del mismo y puede aumentar o disminuir la medida realizada. Son difíciles de detectar. 24
    25. 25. COMO DETECTAR Y CHEQUEAR INTERFERENCIAS Son difíciles de detectar pues se desconoce el resultado verdadero. Se saca de los datos del fabricante o de literatura. Incongruencias con respecto a resultados esperados. Inspeccionar las muestras visualmente buscando: algún tipo de descomposición o alteración en las propiedades organolépticas que haga pensar en la degradación de sus compuestos. 25
    26. 26. FORMAS DE ESTUDIAR LAS INTERFERENCIAS1 Test de dilución lineal (las interferencias no se comportan linealmente con la dilución).2 Analizar la muestra por otro método (se comportan diferentes).3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir sustancias potencialmente interferentes.4 Análisis de muestras enriquecidas con el interferente. 26
    27. 27. Análisis de muestras enriquecidas Se prepara una muestra agregando el material interferente a una muestra real que contenga el analito. Una segunda alícuota de la muestra original se diluye con un solvente y ambas se analizan determinándose la diferencia entre ambas. 27
    28. 28. VALIDACIÓN ESTADÍSTICA 28
    29. 29. PRECISIÓNExpresa el grado de acuerdo entre valores cuandose analiza la misma muestra estable repetidamente.Se habla de Imprecisión.Puede considerarse a tres niveles: 1. Repetibilidad 2. Precisión intermedia 3. Reproducibilidad 29
    30. 30.  REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y en el mismo equipo. PRECISION INTERMEDIA: Precisión obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, días distintos con la misma muestra homogénea. REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisión entre laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología. 30
    31. 31. 1. Se estudia mediante experimentos de replicación.2. El propósito es observar la variación esperada en el resultado de un test bajo las condiciones de operación normal de un laboratorio.3. Estima el error causado por factores como el pipeteo, condiciones de reacción (Tº, mezclado).4. Suele ser mayor en sistemas no automatizados. 31
    32. 32. • Las muestras de ensayo comúnmente usadas son:soluciones estándar, muestras de control, materiales dereferencia o materiales de referencia certificados.• Se emplean los resultados de 10 replicas de por lomenos tres niveles de concentración, de cada material y secalcula la media, el desvío estándar y el coeficiente devariación.• Período de tiempo que abarca el experimento: Tiempoideal 10 días. 32
    33. 33. CÁLCULOS:Promedio: Desvío standard :Coeficiente de variación: CV = (s/x)100 33
    34. 34. EXACTITUDExpresa la cercanía entre el valor que es aceptado, seacomo un valor convencional verdadero (material dereferencia interno), sea como un valor de referencia(material de referencia certificado o estándar) y el valorpromedio obtenido al aplicar el procedimiento de análisisun cierto número de veces. “Un test exacto es implicitamente específico y preciso” 34
    35. 35. ¿Cómo la determino?A) Comparación con métodos de referencia.B) Análisis de muestras de referencia certificadas.C) Ensayos de recuperación.D) Ensayos interlaboratorios. 35
    36. 36. Comparación con métodos de referencia Se analizan muestras por el método en estudio y otro método de comparación, luego se estima el error sistemático basándose en las diferencias observadas para ambos métodos. El método de comparación debe en lo posible ser el de referencia (“gold standard”). Es una técnica cuyos resultados se han comparado con métodos definitivos y/o trazables a materiales estándar de referencia. 36
    37. 37. Número de muestras a usar Mínimo de 10 replicas. De ser posible se debe cubrir todo el rango de trabajo delmétodo y representar la matriz analítica que se desea validar Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado (apartir de dos alícuotas diferentes) en diferentes corridas o por lomenos en diferente orden. 37
    38. 38. Análisis de datos:Existe mucha discusión sobre cual es la mejor formade analizar los datos: A) Graficar los resultados y hacer una inspecciónvisual de los mismos.Cualquier muestra con resultados discrepantes debeser reanalizada.Para los métodos que se espera coincidan hacerprimero un gráfico de “diferencias”. Las mismasdeberán oscilar alrededor de la línea del cero. 38
    39. 39. B) Análisis de muestras de referencia certificadas • Se analiza un mínimo de 3 concentraciones y 5 determinaciones por el método a validar y se compara el resultado obtenido con el valor verdadero declarado. Criterio de aceptación: • El valor medio debe estar dentro del 15% del valor nominal excepto en el Límite de cuantificación (LDC) que puede ser el 20%. 39
    40. 40. Gracias 40

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