Teknik pengukuran kadar enzim secara kuantitatif meliputi pengukuran kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim dengan menentukan menghilangnya substrat atau munculnya produk reaksi. Kadar enzim dapat diukur dengan membandingkan kecepatan reaksi yang dicapai oleh enzim yang diuji dengan enzim murni yang kadarnya telah diketahui, atau mengukur jumlah substrat yang bereaksi per satuan waktu.

1. BAB II
PEMBAHASAN
Mengukur Kadar Enzim
Enzim sebagai katalisator juga mempunyai sifat-sifat seperti katalisator pada umumnya,
seperti ikut bereaksi, tetapi padaakhir reaksi didapatkan kembali dalam bentuk semula.Hal
tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya,
sehingga tubuh kita tidak membutuhkan enzim dalam jumlah yang besar. Jumlah/kadar enzim
yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan tersendiri bagi kita untuk mengukur kadar enzim,
sehingga memerlukan teknik yang rumit. Enzim plasma nonfungsinal dapat dijadikan sebagai
petanda adanya kerusakan organ tertentu.Pengukuran kadar enzim dapat dilkaukan denga dua
cara, yaitu:
(1) Dibandingkan dengan enzim murni;
(2) Mengukur kecepatan reaksi yang dikatalisisnya.
Cara ke-1 dilakukan dengan membandingkan enzim yang ingin diukur kadarnya dengan
enzim murni yang sudah diketahui kadarnya. Kadar enzim dinyatakan dengan satuan μg. Sebagai
contoh misalnya enzim murni dengan kadar 2 μg dapat mengkatalisis substrat dengan jumlah
tertentu selama 10 detik. Jika memakai enzim yang ingin diukur kadarnya membutuhkan waktu
20 detik, maka kadar enzim yang bersangkutan adalah 1 μg.
Pengukuran dengan cara diatas, jelas membutuhkan tersedianya enzim murni.
Kenyataannya banyak enzim yang belum tersedia bentuk murninya. Untuk mengatasi hal ini
digunakanlah cara ke-2. Satuan enzim dinyatakan dalam unit.Kadar enzim diukur berdasarkan
jumlah substrat yang bereaksi atau produk yang terbentuk per satuan waktu.Satu unit
internasional disepakati sebagai jumlah enzim yang perlukan untuk mengkatalisis pembentukan
1 μmol produk per menit pada kondisi tertentu.
( sumberhttp://klinikdokterhairrudin.blogspot.com/2008/10/kinetika-enzim_14.html)
Jumlah enzim di dalam larutan atau eksrak jaringan tertentu dapat diuji secara kuantitatif
dalam hal pengaruh katalitik yang dihasilkan. Untuk tujuan ini, kita perlu mengetahui
1. Persamaan keseluruhan reaksi yang dikatalisa
2. Suatu prosedur analitik untuk menentukan menghilangnya substrat atau, munculnya
produk reaksi

2. 3. Apakah enzim memerlukan kofaktor atau koenzim
4. Ketergantungan aktivitas enzim terhadap konsentrasi substrat, yaitu KM bagi subtrat
5. pH optimum
6. daerah suhu yang membiarkan enzim dalam keadaan stabil dan memiliki aktivitas tinggi
Dengan persetujuan internasional 1,0 unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah
yang menyebabkan pengubahan1,0 mikromol (μmol = 10-6 mol) substrat per menit pada 25o
pada keaadaan pengukuran optimum. Aktivitas spesifik adalah jumlah unit enzim per milligram
protein. Aktivitas spesifik adalah suatu ukuran kemurnian enzim: nilainya meningkat selam
pemurnian suatu enzim dan menjadi maksimum dan tetap (tetap) jika enzim sudah berada pada
keadaan murni.
Bilangan putaran suatu enzim adalah jumlah molekul substrat yang terubah persatuan
waktu oleh satu molekul enzim (atau oleh sisi katalitik), jika konsentrasi enzim sendiri
merupakan factor pembatas kecepatan reaksi.(lehninger, 1982)
Aktivitas Enzim = mol substrat yang diubah per unit waktu = kecepatn × volume reaksi.
Satuan SI untuk aktivitas enzim adalah katal, 1 katal = 1 mol s−1, tapi ini merupkan unit yang
terlau besar. Nilai yang lebih praktis dan sering digunakan adalah unit enzim (U) =
1 μmol min−1. 1 U sama dengan 16.67 nanokatal .
Aktivitas enzim yang dinyatakan dalam katal biasanya menunjukkan jumlah senyawa
target dari enzim. Aktivitas enzim dapat diberikan dalam jumlah substrat tertentu yang
dikatalisis, seperti gelatin, yang kemudian disebut gelatin digesting units (GDU), atau protein
susu, yang kemudian disebut milk clotting units (MCU). Unit GDU dan MCU bergantung pada
seberapa cepat 1 gram enzim akan mendigesti gelatin atau protein susu. 1 GDU sama dengan
1.5 MCU.
Kenaikan jumlah substrat akan menaikkan aktivitas enzim. Akan tetapi pada suatu titik
kecepatan reaksi akan tetap karena jumlah sisi aktif enzim yang tetap.( sumber. Wikipedia.com)
PERSAMAAN MICHAELIS-MENTEN
Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk hiperbolik kurva
tersebut, dengan parameter pentingnya adalah ; konsentrasi substrat ( [푆]), kecepatan awal (v0),

3. Vmaks, dan KM
.. persamaan ini menjadi dasar bagi semua penelitian kinetika enzim karena
memungkinkan perhitungan kualitatif sifat-sifat enzim dan analisis penghambatan enzim.
Disini, kita akan mengembangkan logika dan tahap-tahap dasar dalam penentuan
persamaan Michaelis-Menten secara modern. Penurunan pertama-tama dimulai dengan dua
reaksi dasar yang terlibat dalam pembentukan dan penguraian kompleks enzim-substrat
(a)
(b)
Lalu, [퐸푡 ] menggambarkan konsentrasi enzim total (jumlah enzim bebas dan enzim terikat),
[퐸푆] adalah konsentrasi kompleks enzim-substrat, dan [퐸푡 ] - [퐸푆]menggambarkan konsentrasi
enzim bebas atau enzim tak terikat, [푆], konsentrasi substrat yang biasanya jauh lebih besar dari
[퐸푡 ], sehingga jumlah S yang terikat oleh E pada setiap saat dapat diabaikan dibandingkan
dengan konsentrasi S total. Penurunan rumus ini dimulai dengan memperhatikan kecepatan
pembentukan dan penguraian ES.
1. kecepatan pembentukan ES. Kecepatan pembentukan ES pada reaksi a adalah
Kecepatan pembentukan = k1([퐸푡 ] – [퐸푆])[푆] (c)
2. kecepatan penguraian ES. Kecepatan penguraian ES adalah
Kecepatan penguraian = k_1[퐸푆] + k2[퐸푆]
Dengan k_1 dan k2 merupakan tetapan kecepatan bagi reaksi kebalikan (a) dan reaksi yang
mengarah ke muk (b) berturut-turut
3. keadaan seimbang. Ketika kecepatan pembentukan ES sama dengan kecepatan
penguraiannya, konsentrasi ES dan tetap dan system reaksi berad dalam keadaan
seimbang:
Kecepatan pembentukan ES = kecepatan penguraian ES
k1([퐸푡 ] – [퐸푆])[푆]= k_1[퐸푆] + k2[퐸푆] (d)
4. pemisahan tetapan keseimbangan. Bagian kiri persamaan (d) dikalikan, sehingga
memberikan
k1([퐸푡 ][푆] – k1[퐸푆])[푆]
dan bagian kaan kita sederhanakan, sehingga dihasilkan
(k_1 + k2 )[퐸푆]

4. Lalu, kita peroleh
k1[퐸푡 ][푆] – k1[퐸푆][푆]= (k_1 + k2 )[퐸푆]
jika kita memindahkan dan mengubah tanda hasil perkalian – k1[퐸푆])[푆], kita memperoleh
k1([퐸푡 ][푆] = k1[퐸푆][푆] + (k_1 + k2 )[퐸푆]
persamaan ini dapat kita sederhanakan lebih lanjut
k1[퐸푡 ][푆] = (k1[푆] + k_1 + k2 )[퐸푆]
sekarang, persamaan ini kita bagi [퐸푆]
[퐸푆] =
푘1 [퐸푡][푆]
푘1 [푆]+ 푘1+ 푘−1
Dengan menggabungkan tetapan kecepatan reaksi menjadi satu persamaan
[퐸푆] =
푘1 [퐸푡][푆]
[푆] + (푘1+ 푘−1)
⁄
푘1
5. definisi kecepatan awal v0 dengan melibatkan [퐸푆] . Kecepatan awal, menurut teori
Michaelis-Menten, ditentukan oleh penguraian [퐸푆] dalam reaksi (b) yang tetapan
kecepatan reaksinya adalahk2. Jadi kita memiliki
V0 = k2[퐸푆]
Karena semua [퐸푆] berada di bagian kiri persamaan, (e) kita memperoleh
V0 =
푘2 [퐸푡][푆]
[푆]+ (푘1+ 푘−1 )
⁄
푘1
(f)
Sekarang, marilah kita sederhanakan lebih lanjut persamaan di atas dengan mendefinisikan KM
(tetapan Michelis-Menten) sebagai
(푘1 + 푘−1)
⁄ dan dengan mendefinisikan Vmaks sebagai
푘1
k2[퐸푡 ], kecepatan pada saat semua E yang tersedia terdapat sebagai ES. Kita lakukan substitusi
parameter ini pada persamaan (f) dan memperoleh
푉푚푎푘푠 [푆]
[푆] + 퐾푀
V0 =
Persamaan di atas adalah persamaan Michelis-Menten, oersamaan kecepatan bagi suatu reaksi
enzimatik satu substrat. Persamaan ini adalah suatu pernytaan ,mengenai hubungan kuantitatif
diantara kecepatan reaksi awal v0, kecepatan maksimum Vmaks, dan konsentrasi substrat awal,
semua dihubungkan melalui tetapan Michelis-Menten KM.

5. METODE PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM SECARA FOTOMETRIK
Ada 3 jenis metode yang digunakan
a) Pengukuan cahaya yang diabsorpsi (serap) oleh larutan
b) Pengukuran cahaya yang dipantulkan oleh suspensi
c) Pengukuran cahaya yang diemisikan zat terlarut setelah eksitasi yang disebabkan oleh
penyinaran dengan panjang gelombang yang sesuai
Prinsip dasar penentuan konsentrasi secara fotometrik
Pengukuran konsentrasi secara fotometri berdasarkan pada cahaya yang melewati suatu larutan
akan diabsorpsi (diserap) yang jumlahnya sebanding dengan konsentrasi larutan. Perbandigan
intensitas cahayayang tidak diserap dengan intensitas awal I/I0 (disebut transmitansi) meningkat
jika konsentrasi meningkat. Densitas optik (OD) menunjukkan fraksi cahaya yang diserap dan
jumlahnya bergantung ukuran yang dibuat.
OD = log
1
푡푟푎푛푠푚푖푡푎푛푠푖
= log I/I0
Cahaya yang diabsorpsi diukur dengan fotosel atau ammeter , kemudian transmitansi dari
larutan dibaca pada skala dari instrument.
( wiliiamson,1965)
PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM SECARA SPEKROSKOPI
Untuk mengukur aktivitas enzim ini dengan spektroskopi, beberapa teknik spektroskopi yang
digunakan: spektroskopi fluoresensi, Spektroskopi UV / VIS, dan Spektroskopi inframerah.
1. Spektroskopi florosensi
Dalam spektroskopi fluoresensi, senyawa ditembakkancahaya UV yang menyebabkan
molekul tereksitasit sehingga memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang lebih
panjang, yang biasanya dalam kisaran cahaya tampak. Fenomena penyerapan foton oleh
molekul pada satu panjang gelombang tertentu dan menyebabkan emisi foton lain dari
molekul yang sama pada panjang gelombang yang lebih panjang dikenal sebagai
fluoresensi. Dalam teknik spektroskopi, fluoresensi substrat diukur dan dibandingkan
dengan fluoresensi produk, dan selisihnyamenunjukkan aktivitas enzimatik diukur.

6. 2. Spektroskopi UV-vis
Spektroskopi UV menggunakan cahaya di daerah UV di mana molekul yang paling
mungkin untuk mengalami transisi elektronik. Yang dimaksud dengan transisi elektronik
adalah bahwa ketika molekul menyerap energi UV, ini menyebabkan elektron menglami
eksitasi, yang menyebabkan mereka pindah ke orbital dengan energi yang lebih tinggi l.
Instrumen yang digunakan dalam spektroskopi UV adalah UV / VIS. Perangkat ini
mengukur transmitansi cahaya melalui sampel. Persamaan yang digunakan untuk
menghitung transmitansi adalah
A = -log (% T)
di mana A adalah absorbansi dan T adalah I / Io, dimana I adalah intensitas cahaya yang
melewati sampel dan Io adalah intensitas awal cahaya sebelum dilewatkan melalui sampel.
Setelah absorbansi dihitung, dapat diplot versus panjang gelombang memberikan UV / VIS
spectrum
(wikibook)
Pengukuran aktifitas enzim menggunakan alat spektrofotometer. Sebagai contoh misalnya
aktifitas enzim dehidrogenase yang bergantung NADP+ diperiksa secara spektofotometris
dengan mengukur perubahan absorbsi nya pada 340 nm yang menyertai oksidasi atau reduksi
NADP+/NADPH. Oksidasi NADH menjadi NAD+ terjadi disertai dengan penurunan densitas
optik (OD, optical density) pada 340 nm, yang proporsional dengan jumlah NADH yang
dioksidasi. Demikian pula, kalau NAD+ direduksi, OD pada 340 nm akan meningkat seband ing
dengan jumlah NADH yang terbentuk. Perubahan OD pada 340 nm ini dapat dimanfaatkan bagi
pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim dehidrogenase yang bergantung NAD+ atau
NADP+. Bagi enzim dehidrogenase yang mengatalitis oksidasi NADH oleh substratnya yang
teroksidasi, kecepatan penurunan OD pada 340 nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi
enzim. Oleh karena itu, hasil pengukuran kecepatan penurunan OD pada 340 nm memungkinkan
kita menyimpulkan kuantitas enzim.
( sumberhttp://klinikdokterhairrudin.blogspot.com/2008/10/kinetika-enzim_14.html)
PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM SECARA MANOMETER

7. Prinsip
Manometer ditemukan oleh Barcroft dan kemudian dikembangkan oleh O. Warburg,
menghitung volume gas dengan cara membandingkan dengan volume konstan dari
manometer. Termoregulator yang efisien sangat penting dalam penentuan secara
manometer.
Jenis reaksi yang dapat ditentukan
1. Reaksi yang menghasilkan gas, contoh CO2 yang dihasilkan dari reaksi karboksilase
2. Reaksi yang menggunakan gas, contoh O2 yang digunakan dalam reaksi sitokrom
oksidase
3. Reaksi yang menghasilkan gas, produksi CO2 dari buffer bikarbonat
4. Reaksi pengikatan asam dalam bikarbonat/buffer CO2 (secara praktek tidak pernah
digunakan) contoh reaksi pospat ester, dan ester yang menghasilkan nilai pK yang besar.
Dua reaksi yang terakhir kurang berguna disebabkan karena tidak spesifik. Untuk reaksi yang
menghasilkan dua gas misalnya O2 dan CO2 dalam reaksi glikolisi secara anaerobic dapat
dieliminasi dengan mengeliminasi CO2 dengan KOH atau menggunakan dua labu
Peralatan yang mengukur perubahan jumlah gas terdiri dari sensor tekanan yang melekat
pada wadah tertutup yang memiliki ruang utama yang berisi enzim ca iran atau sejenisnya dan
disesuaikan dengan perubahan tekanan dalam bejana menjadi sinyal listrik dan output sinyal nilai
tekanan diukur; sensor fotolistrik disesuaikan dengan perubahan optik enzim cairan atau
sejenisnya dalam bejana tertutup menjadi sinyal listrik dan output sinyal nilai yang terukur optik;
elektroda disesuaikan dengan bersentuhan de

8. ngan enzim cairan atau sejenisnya dalam kapal untuk mengkonversi perubahan konduktivitas
menjadi sinyal listrik dan output sinyal konduktivitas diukur; dan sirkuit aritmatika disesuaikan
dengan masukan masing-masing mengatakan sinyal nilai tekanan diukur, sinyal nilai tekanan
terukur dan mengatakan sinyal optik nilai terukur, dan sinyal nilai tekanan diukur dan berkata
diukur sinyal
konduktivitas secara bersamaan, perhitungan efek secara bersamaan secara paralel sesuai dengan
ekspresi numerik yang telah ditetapkan disimpan di muka dan sinyal perhitungan data keluaran
masing-masing.
(google/patent)
PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM SECARA THUNBERG
TeknikThunberg secara hakikat sudah digantikan oleh manometer.Tabung Thunberg
tetap digunakan saat reaksi mememrlukan kondisi anaerobicKegiatan dehidrogenase yang
biasanya diukur dengan adanya kelebihansubstrat dengan tingkat penyerapan oksigen dihadapan
biru metilen(Warburg Teknik) atau pada saat dekolorisasi metilen biru di tidak adanya oksigen
(teknik Thunberg).Dehydrogenases larut dalam airmenderita denaturasi permukaan dan

9. dinonaktifkan selama gemetar cepat diperlukan untuk menjaga keseimbangan dengan fasa uap di
sebaliknya Teknik Warburg memuaskan.Akurasi dalam teknik Thunberg membutuhkan
penambahan jumlah konstan metilen biru dan lengkap penghapusan oksigen dari ruang
reaksi.Kelemahan ini mungkindihilangkan dengan perangkat berikut.Sebuah 14 X 125 mm.
Pyrex tabung cocok untuk digunakan di Klett-Summerson kalorimeter fotolistrik dilengkapi
dengan 14/35 luar lancip standarsendi. Sebuah lengan sisi dengan segelas stop-ayam disegel ke
tabung sedemikiancara yang tidak akan mengganggu penggunaan dalam kalorimeter. Lengan
daribatin 14/35 standar lancip sendi disegel dan melengkung ke 90 "atau lebih untuk bola
samping.1 ml. dari 5 persen substrat ditempatkan dalam bola samping dan dipanaskan sampai
mendidih selama beberapa detik.5 ml. dari 0,002 persen methylene blue (atau cukup untuk
memberikan pembacaan sekitar 500) sama-sama direbus dalam tabung utama.Keduayang eooled
37 ". 0,5 ml. ekstrak jaringan atau persiapan enzim dan 0,5ml. dari '! Kochaaft "atau persiapan
codehydrogenase kemudian ditambahkan ketabung utama. Sisi bola diletakkan di tempat dan
tabung dievakuasi keTekanan dari 40 sampai 50 mm. Hg. Hal ini tidak perlu dan tidak
diinginkan untukmenghapus semua oksigen. Halte-ayam ini kemudian ditutup dan isitabung
dicampur.Hal ini kemudian ditempatkan dalam kalorimeter, dilengkapi denganNo. 66 filter
merah.Setelah 5 sampai 15 menit oksigen yang tersisa dalam larutanmenjadi kelelahan dan
warna biru metilen menurun secara linear denganwaktu kecuali untuk periode kecil di awal dan
di akhir kurva.Tingkat penurunan membaca kalorimeter adalah ukuran dari jumlah hadir
dehidrogenase.Aparat dapat dikalibrasi dengan diketahui jumlah biru metilen dilarutkan dalam 7
ml. air, dalam hal colorim- unit eter per mol metilen biru per liter.Kehadiran merah atau
coklat.warna atau bahan halus ditangguhkan dalam penyusunan enzim tidak mengganggu
metode. Alat ini telah berhasil digunakan untuk mengukur glutamat, glukosa, suksinat, sitrat, dan
alcohol dehidrogenase dalam berbagai persiapan hati.Studi pengaruh konsentrasi substrat dapat
dibuat dengan ini

10. DAFTAR PUSTAKA
Lehninger, 1982. DASAR-DASAR BIOKIMA, Jilid 1, Jakarta : Erlangga
Williamson,1965. METHODS of ENZYMATIC ANAlYSIS. New York: McGrawHill
http://klinikdokterhairrudin.blogspot.com/2008/10/kinetika-enzim_14.html
http://wikipedia.com
http://wikipedia/patent.com