Oncofetal Gene SALL4 in AggressiveHepatocellular Carcinoma

1. ONCOFETAL GENE SALL4 IN
AGGRESSIVE
HEPATOCELLULAR CARCINOMA
Sebastián Naranjo Castaño
Ana Montúfar Pantoja
III semestre Medicina
UPB
Kol Jia Yong, B.Sc., Chong Gao, M.D., Ph.D., Joline S.J. Lim, M.B., B.S.,
Benedict Yan, M.B., B.S., Henry Yang, Ph.D., Todor Dimitrov, Ph.D.,
Akira Kawasaki, M.D., Ph.D., Chee Wee Ong, M.Sc., Kwong-Fai Wong, Ph.D.,
Sanghoon Lee, Ph.D., Sharada Ravikumar, M.D., Ph.D., Supriya Srivastava, M.D.,
Xi Tian, B.S., Ronnie T. Poon, M.B., B.S., Ph.D., Sheung Tat Fan, M.D., D.Sc.,
John M. Luk, D.Med.Sc., Yock Young Dan, M.B., B.S., Ph.D.,
Manuel Salto-Tellez, M.D., Li Chai, M.D., and Daniel G. Tenen, M.D.

2.  Gen SALL4
INTRODUCTION
Is part of a group of genes called the SALL
family.
These genes provide instructions for
making proteins that are involved in the
formation of tissues and organs during
embryonic development.
SALL proteins are transcription factors,
which means they attach (bind) to specific
regions of DNA and help control the activity
of particular genes.
Location: 20q13.2

3.  Carcinoma, is a form of cancer originating from epithelial or
glandular cells.
 Hepatocellular carcinoma, develops when there is a mutation
to the cellular machinery that causes the cell to replicate at a
higher rate and/or results in the cell avoiding apoptosis.
 A constant cycle of damage followed by repair can lead to
mistakes during repair which in turn lead to carcinogenesis.
INTRODUCTION

4.  Hepatocellular carcinoma
Is a primary malignancy of the liver. Most
cases of HCC are secondary to either a viral
hepatitide infection (hepatitis B or C) or
cirrhosis (alcoholism being the most common
cause of hepatic cirrhosis).
INTRODUCTION

5. Gen SALL4 and HCC
In healthy humans, SALL4 is expressed in fetal liver but
silenced in mature adult liver. In a subgroup of HCC livers,
SALL4 is re-activated and plays a functional role in
hepatocarcinogenesis by silencing the tumor suppressor
PTEN through the recruitment of the NuRD complex.
INTRODUCTION

6. Understand and describe the molecular
pathogenesis of hepatocellular carcinoma and
develop more effective targeted therapies.
GENERAL OBJECTIVE

7.  PACIENTES
MATERIALES Y METODOS
Muestra: carcinoma hepatocelular,
tejido extraído quirúrgicamente.
Pacientes en el Hospital de la
Universidad Nacional de Singapur.
79/179.
Pacientes en el Hospital Queen
Mary de Hong Kong. N=228

8. Demographic and Clinicopathological Characteristics of the
Patients (Singapore Cohort) and Association between SALL4
Expression With Clinicopathological Parameters
SALL4neg: IHC score 0; SALL4pos: IHC score +1 to +4
N=79 (unless otherwise noted in brackets).
Fisher’s exact test

9. Stage
Tumor
Characteristics
Associated Liver
Features
Stage A (early HCC)
A1 PST 0 Single tumor
No PH and normal
bilirubin level
A2 PST 0 Single tumor
PH and normal
bilirubin level
A3 PST 0 Single tumor
PH and abnormal
bilirubin level
A4 PST 0
3 Tumors, all <3
cm
Child-Pugh A–B
Stage B (intermediate HCC)
PST 0 Large multinodular Child-Pugh A–B
Stage C (advanced HCC)
PST 1-2
Vascular invasion
or extrahepatic
spread
Child-Pugh A–B
Stage D (end-stage HCC)
PST 3-4 Any Child-Pugh C
Puntos Clase
Supervivencia
al cabo de 1
año
Supervivencia al
cabo de 2 años
5-6 A 100% 85%
7-9 B 81% 57%
10-15 C 45% 35%
Barcelona-Clínic Liver Cancer Child-Pugh
Grado del tumor.
• GX El grado no puede evaluarse (calidad indeterminada)
• G1 Bien diferenciado (calidad baja)
• G2 Moderadamente bien diferenciado (calidad intermedia)
• G3 Precariamente diferenciado (calidad alta)
• G4 no diferenciado (calidad alta)

10. Se clasifico la expresión de
SALL4 de acuerdo con el
porcentaje de células tumorales
que resultaron positivas para
SALL4.
 0: ausencia de
células tumorales teñidas
positivo
 1: 1%- 30% de las células
tumorales positivas.
 2 : 31%- 50% de las células
tumorales positivas.
 3: 51% -80% de las células
tumorales positivas.
 4: > 80% de
células tumorales positivas.
SALL4 expression status of primary HCC tissues from
the Singapore cohort

11. Demographic and Clinicopathological Characteristics of the Patients
(HK Cohort) and Association between SALL4 Expression with
Clinicopathological Parameters
N=228 (unless otherwise noted in brackets).
Chi-square test
P < 0,05
 Alfa feto-proteína.
Grado del tumor.
• GX El grado no puede evaluarse (calidad indeterminada)
• G1 Bien diferenciado (calidad baja)
• G2 Moderadamente bien diferenciado (calidad intermedia)
• G3 Precariamente diferenciado (calidad alta)
• G4 no diferenciado (calidad alta)

12. MICROARREGLOS
• Consiste en miles de secuencias específicas de genes individuales
estrechamente comprimidas adheridas a la superficie de un portaobjetos de
vidrio para microscopio.
• El monitoreo simultáneo de la expresión de miles de genes.
• Analizar los patrones globales de la expresión génica de un organismo
durante respuestas fisiológicas específicas o de procesos del desarrollo.

13. Generación de
oligonucleótido
Hibridación
y
Lavado
Patrones
Deposit
o
fotolitografí
a
DNA
AmplificadoMarcado F.
MICROARREGLOS, ELABORACIÓN

14. PCR
 PCR (reacción en cadena de la
polimerasa). Técnica para amplificar
un segmento específico de DNA en
una mezcla compleja mediante
múltiples ciclos de síntesis de DNA a
partir de oligonucleótidos cebadores
cortos, seguidos por un breve
tratamiento con calor para separar las
hebras complementarias.
Se analizo la expresión endógena de
SALL4 en 10 líneas celulares de HCC
humano. Por medio de un ensayo de
PCR se cuantifico la expresión de
SALL4 en varios niveles. Se determino
un patrón.

15. Hibridación con
Oligonucleótido
Síntesis
Replicación x DNA
pol.
Oligo, cebador
Desnaturalización
del DND
Hebras Sencillas
Alineación
PCR, ETAPAS

16.  Inmunotinción
 Rx Ag-Ac (marcado).
 Coloración, presencia de
molécula de interés.
 identificación de diferenciación
y de marcadores pronósticos
de neoplasias.
 expresión diferencial de SALL4.
INMUNOHISTOQUÍMICA

17. WESTERN BLOT
 Detecta una proteína particular en una mezcla compleja, combina la
electroforesis en gel, la especificidad de los anticuerpos y la
sensibilidad de las pruebas enzimáticas.
 Suele utilizarse para separar proteínas y luego Identificar una
proteína específica de interés.
 en este método se utilizan dos anticuerpos diferentes, uno específico
para la proteína buscada y el otro unido a una enzima informadora.

18.  Para confirmar la participación del
PTEN en la reducción de células de
carcinoma hepatocelular inducida por
el péptido SALL4.
 Expresión de PTEN

19. RESULTADOS
• Probar hipótesis de reexpresión de SALL4
en subtipo de carcinoma hepatocelular.
•Análisis inmunohistoquímica: detectar
expresión de SALL4 en muestras de hígado
fetales, no en hígado adulto
•Nivel de expresión de SALL4 en pacientes
con carcinoma hepatocelular.

20. SALL4 se expresó en el tejido de hígado fetal,
silenciados en el tejido normal del hígado
adulto, y reexpresado en muchas de las
muestras de tejido de los adultos con
carcinoma hepatocelular
•Mayor expresión de SALL4 en células del
carcinoma hepatocelular que en las no
neoplásicas (P <0,001) (Fig. 1B).
•Microarrays: Confirma el aumento de SALL4
en varios grupos independientes de
carcinoma primario hepatocelular.
•Expresión diferencial de SALL4 en las
muestras de hígado de tejido de carcinoma
hepatocelular-y no neoplásicas, de bases de
datos públicas (P = 0,003).
•Expresión endógena SALL4 en varios niveles
a través de 10 líneas de células de carcinoma
hepatocelular. Ausencia de expresión en
THLE-2 y THLE-3.

21. •Pacientes con un alto nivel de
expresión SALL4, tienen un peor
pronóstico que los de bajo nivel de
SALL4 expresión.
•Carcinomas hepatocelulares con
alta SALL4 se agrupan fuertemente
con hígados fetales: Agresivos, y se
asocia con un mal pronóstico.
•Carcinomas hepatocelulares con
bajo SALL4 agrupados con
hepatocitos normales.
•Células SNU-398 tratadas con
shRNA 1 se agrupan estrechamente
con el tejido de hígado fetal humano:
↑SALL4.
•Células SNU-398 con shSALL4 1 se
agrupan con hepatocitos humanos,
•Baja regulación de SALL4 puede
hacer carcinoma hepatocelular

23. •Péptido 12-AA SALL4, un
inhibidor competitivo de SALL4,
disminuyendo de la viabilidad de
las células de carcinoma
hepatocelular.
•Péptido SALL4, mantiene de la
viabilidad celular
•Péptido SALL4 no tuvo ningún
efecto sobre las células SNU-387
con la expresión endógena
SALL4 indetectable
•SALL4 indujo un aumento en los
niveles de proteína PTEN en las
células SNU-398
•SALL4 tiene un efecto
insignificante sobre la expresión
de PTEN en las células SNU-387
•Péptidos TAT-mutantes reducen
la tumorigenicidad de SNU-398
células

24. DISCUSSION
REFERENCE WHAT THE Y SAID AGREE/ DESAGREE
Elling U, Klasen C,
Eisenberger T, Anlag
K, Treier M.
“SALL4 is one of the
key factors for
maintenance of
pluripotency and self-
renewal of embryonic
stem cells.”
AGREE

25. 1. The main conclusion obtained after
reviewing this article is the role of the
SALL4’s reexpression in a subtype of
hepatocellular carcinoma.
2. SALL4 expression occurs in hepatocellular
carcinoma cells but not in normal adult
hepatocytes, thus SALL4 peptide treatment
may have less tissue toxicity
CONCLUSIONS

26. 3. The identification of SALL4 can be a
prognostic factor and biomarker for
Hepatocellular Carcinoma.
4. According to the above, SALL4 is an
important target for the treatment of
hepatocellular carcinoma and their
regulation can reduce the
aggressiveness of the cancer.
CONCLUSIONS

27. MAPAS

28. MAPAS
Sebastián Naranjo C.

29. Gracias.