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DETERMINACIÓN DE
LA BIOMASA
MICROBIANA
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I. INTRODUCCIÓN
Biomasa es un termino general que se refiere a los
M’os presentes en un sistema.
Cantidad
células personas
masa de
seres vivos
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I. INTRODUCCIÓN
La determinación de la biomasa es una de las
variables más importantes de un bioproceso
su determinación nos
lleva a la comprensión de
la eficiencia del mismo.
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I. INTRODUCCIÓN
Es una
variable
clave para
establecer:
Consumo
de
nutrientes
Calculo de
balance de
masas de
cualquier
proceso
biológico.
Tasas de
producción
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I. INTRODUCCIÓN
• Existen 2 métodos principales de estudiar
poblaciones microbianas en la naturaleza:
MÉTODO DIRECTO
MÉTODO INDIRECTO
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Observación de los
organismos
En el microscopio
óptico
Conteo del número
de M’os
A. MÉTODO DIRECTO
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• Requiere de preparaciones puras sin ningún tipo
de partículas que puedan interferir en los
resultados y:
 Se refiere básicamente a la medida de la masa
celular.
A. MÉTODO DIRECTO
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A. MÉTODO DIRECTO
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• La cantidad total de biomasa presente en una
muestra puede medirse:
 En términos de peso seco por unidad de
volumen.
PESO SECO
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PESO SECO
Los componentes volátiles de las células pueden perderse en el
secado.
La muestra seca puede recobrar humedad durante el
pesado.
DESVENTAJAS
Se puede determinar M’os activos y no, material inerte,
materia orgánica y polímeros extracelulares.
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• Se obtiene a partir de una muestra en
suspensión que es pesada luego de la
separación de las células por filtración o
centrifugación.
PESO HÚMEDO
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PESO HÚMEDO
Técnica útil para
grandes volúmenes
de muestra
El diluyente queda
atrapado en el
espacio intercelular
y contribuye al peso
total de la masa.
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MÉTODOS
INDIRECTOS
Actividad
metabólica
Consumo de un
nutriente
característico
Métodos
turbidimétricos
Espectrofotométricos
Nefelométricos
Determinación
nitrógeno total
B. MÉTODOS INDIRECTOS
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B. MÉTODOS INDIRECTOS
Medidas de turbidez
Los métodos turbidimétricos de análisis
tienen como fundamento:
La formación de partículas de pequeño
tamaño que causan la dispersión de la luz
cuando una fuente de radiación incide
sobre dichas partículas.
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El grado de dispersión de
la luz (o turbidez de la
solución) es proporcional
al número de partículas
que se encuentran a su
paso, lo cual depende de
la cantidad de analito
presente en la muestra.
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Medidas de turbidez
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• Se trata de una serie de patrones de turbidez
previamente calibrados.
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Escala de Mc Farland
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• Se basa en la capacidad de:
1% de
Cl2Ba
Cantidades
crecientes
de SO4H2
al 1%
Precipitado
de BaSO4
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Escala de Mc Farland
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Su utilidad es la de
poder elaborar
suspensiones
bacterianas,
Ajustadas a un
patrón y valorar su
concentración
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Escala de Mc Farland
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• Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza
(contaminantes, biomoléculas, etc.) y,
 Estado de agregación (sólido, líquido, gas).
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría
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• Las principales ventajas de la
espectrofotometría son:
 Sensibilidad relativa elevada.
 Facilidad para realizar mediciones rápidas.
 Grado de especificidad relativamente elevado.
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría
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• Los espectros de absorción se miden mediante
un instrumento denominado espectrofotómetro.
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría
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• El espectrofotómetro, mide la absorbancia, A,
que se define por:
T= transmitancia
D.O. = A = -logT/100
Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.
B. MÉTODOS INDIRECTOS
Espectrofotometría
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II. OBJETIVOS
• Lograr determinar la biomasa Microbiana, a
través de diversos métodos.
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Métodos directos: determinación del peso
húmedo y peso seco
 Materiales:
Levadura de panificación “Fleishmann”
Agua destilada
Pipetas de 5ml
Tubos de ensayo
Balanza analítica
Centrifuga
Estufa
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Métodos directos: determinación del peso
húmedo y peso seco
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Peso Seco:
 Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y
colocar en 3 tubos de ensayos previamente pesados.
 Luego llevar los tubos a la centrifuga y hacerlo girar
a 4 000 rpm, por un tiempo de 10 minutos.
 Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza
analítica y anotar los pesos.
 Posteriormente, llevar los tubos a estufa, a una Tº de
105 ºC por un tiempo promedio de 3 horas.
 Pasado el tiempo anotar, los pesos y luego obtener
un promedio. (Anexo 1).
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DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA
III. MATERIALES Y MÉTODOS
 Por ultimo expresar los datos en la siguiente
formula.
Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Peso Húmedo:
 Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y
colocar en 3 tubos de ensayos previamente
pesados.
 Llevar los tubos a la centrifuga, donde se hacen
girar a 4 000 r.p.m., por un tiempo de 10
minutos.
 Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza
analítica, anotamos los pesos y luego promediar
(Anexo 1).
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DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA
III. MATERIALES Y MÉTODOS
 Por ultimo expresar los datos en la siguiente
formula.
Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla
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Figura 01: Metodología de peso seco y húmedo
Fuente: Google Imágenes
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Métodos indirectos: determinación de turbidez a través
de la Escala de McFarland y espectrofotometría
 Materiales:
cepa de E. coli
Agar Nutritivo
Solución Salina 0.85%
BaCl2 1%
H2SO4 1%
Agua destilada estéril
Tubos de ensayo
Pipetas
Espectrofotómetro
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Métodos indirectos: determinación de
turbidez a través de la Escala de McFarland
y espectrofotometría
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Nefelométria de McFarland:
 Agregar los reactivos a los tubos rotulados de
manera apropiada (1 a 10) en las cantidades que
se indican a continuación:
Estándares de sulfato de bario
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2 1%(ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
H2SO4 1%(ml) 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9
Densidad aprox. De
células (x108/ml
3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
 Sellar los tubos y rotular. El precipitado de BaSO4
suspendido corresponde aproximadamente a la
densidad de células homogéneas de
Escherichia coli por mililitro.
 Luego, se toma una alícuota de la muestra de
bacterias.
 Se inocula en un tubo contenido de solución
salina fisiológica (0,85%) y se procede a
comparar el tubo con los de la escala estándar y
obtener los resultados de la densidad.
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Figura 02: Escala de Mc Farland
Fuente: Google Imágenes
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
• Espectrofotometría:
 En el espectrofotómetro establecer la
absorbancia a 546 nm de longitud de onda, de
cada uno de los tubos de la escala de
MacFarland.
 Con estos datos, teniendo en cuenta las
concentraciones celulares correspondientes a
cada tubo y mediante el uso de un papel
milimetrado semilogarítmico establezca una
curva patrón de número de bacterias con relación
a la absorbancia.
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
 Prepare diluciones seriadas de la muestra
biológica en SSF. Para ello, utilice los tubos de
15x125mm y las pipetas estériles. Realice las
siguientes diluciones: 10-1, 10-2,10-3,10-4,y 10-5.
 Establezca la absorbancia de las diluciones y a
través de la curva patrón determine el número de
bacterias presentes en cada dilución y teniendo
en cuenta el factor de dilución del tubo trabajado,
establezca el número de bacterias por mililitro.
 Promediando estos datos, determine el número
de bacterias presente en la muestra.
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Figura 03: Espectrofótometro
Fuente: Google Imágenes
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
 Adicional a esto realice una siembra
incorporación de las muestras en una placa con
agar nutritivo, incubarlas a 37ºC por horas;
realice un recuento y compare si los resultados
obtenidos concuerdan con lo esperado.
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Figura 04: siembra por incorporación
Fuente: propia
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Escuela De Bioanalisis-Carrera De Microbiología
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Gracias por su
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