Andrea Souto García Introdución a la Tecnología del ADN Recombinante
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Cómo cortar y pegar el ADN <ul><li>Tijeras moleculares: enzimas de restricción </li></ul><ul><li>En 1975  Daniel Nathans y...
METILACIONES
Como introducir ADN recombinante en bacterias <ul><li>Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. E...
Como amplificar el ADN <ul><li>Reacción en cadena de la polimerasa </li></ul><ul><li>Kary Mullis , un bioquímico americano...
Cómo encontrar el gen adecuado <ul><li>Imanes biológicos: sondas y anticuerpos </li></ul><ul><li>Hoy día podemos encontrar...
Cómo estudiar la expresión de distintos genes <ul><li>La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los...
Northern, Southern & Western <ul><li>Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como ...
 
Microarreglos <ul><li>Otra técnica que emplea la hibridación de sondas específicas marcadas es la de microarreglos ( Micro...
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Introdución a la tecnología del ADN recombinante

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Introdución a la tecnología del ADN recombinante

  1. 1. Andrea Souto García Introdución a la Tecnología del ADN Recombinante
  2. 2. Introdución a la Tecnología del ADN Recombinante <ul><li>ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña. </li></ul>
  3. 3. Cómo cortar y pegar el ADN <ul><li>Tijeras moleculares: enzimas de restricción </li></ul><ul><li>En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas –las enzimas endonucleasas o enzimas de restricción - que actúan como “tijeras moleculares”, cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética. </li></ul><ul><li>Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño. </li></ul><ul><li>A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de ciertos nucleótidos. </li></ul>
  4. 4. METILACIONES
  5. 5. Como introducir ADN recombinante en bacterias <ul><li>Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso consta de las siguientes etapas: </li></ul><ul><li>Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos. > </li></ul><ul><li>Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse. </li></ul><ul><li>Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y luego introducimos el plásmido con inserto en bacterias. </li></ul><ul><li>Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán. </li></ul>
  6. 6. Como amplificar el ADN <ul><li>Reacción en cadena de la polimerasa </li></ul><ul><li>Kary Mullis , un bioquímico americano que trabajaba sintetizando ADN, resolvió este problema con la invención de la reacción en cadena de la polimerasa . </li></ul><ul><li>Esta se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión de pequeños fragmentos (denominados primers ) y la extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción. Para llevar a cabo esta reacción se requiere de una enzima polimerasa que sea capaz de soportar la alta temperatura del proceso de desnaturalización. Esta enzima es una ADN-polimerasa especial obtenida de una bacteria termófila (la Thermus aquaticus), resistente a altas temperaturas. </li></ul>
  7. 7. Cómo encontrar el gen adecuado <ul><li>Imanes biológicos: sondas y anticuerpos </li></ul><ul><li>Hoy día podemos encontrar genes o proteínas usando, respectivamente, sondas y anticuerpos, que actúan como imanes moleculares. </li></ul><ul><li>Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna “marca” que permite revelar su unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera revela presencia de la región buscada. </li></ul>
  8. 8. Cómo estudiar la expresión de distintos genes <ul><li>La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los laboratorios para separar ácidos nucleicos o proteínas, de acuerdo con su tamaño. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva. Existen distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida. </li></ul>
  9. 9. Northern, Southern & Western <ul><li>Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión al nombre del científico inventor de la técnica basada en ADN). </li></ul>
  10. 11. Microarreglos <ul><li>Otra técnica que emplea la hibridación de sondas específicas marcadas es la de microarreglos ( Microarrays ), que consta de una membrana dividida en celdillas que poseen adheridas sondas que representan un gen en particular. En conjunto, estas celdillas contienen todos los genes conocidos de un organismo. De esta manera, cuando se coloca una muestra en estos chips se irá hibridando cada gen que se encuentre en la muestra con su sonda correspondiente en la casilla determinada. Cuando una celdilla da positivo, quiere decir que ese gen determinado está presente en la muestra. </li></ul>

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