1. Journal Reading Divisi Penyakit Infeksi Evaluation of the LightCycler® SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis J.P. Casalta. F. Gouriet. V. Roux. F. Thuny. G. Habib. D. Raoult Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2009) 28:569-573 Ime. F. A/ JusakNugraha Senin, 25Oktober 2010 1
2.
3. PENDAHULUANINFEKSI ENDOKARDITIS (IE) 3 3 Bakteremia Diagnosis: kultur darah Kultur darah gagal mengisolasi 2,5 – 31 % kasus 3
4. Penggunaan antibiotika sebelumnya, kuman patogen intraselular, kuman fastidious yang tidak terdeteksi dengan kultur standar kultur negatif PENDAHULUAN Perlu metode diagnostik laboratorium alternatif, termasuk pemeriksaan patologi sampel katup jantung, Immunochemistry, serologi, molekuler 4
5. PENDAHULUAN Teknik molekular komersial baru untuk mendeteksi bakteremia SeptiFast (Roche Diagnostik) Deteksi, identifikasi bakteri, jamur yg sering sebabkan infeksi dalam aliran darah selama 6 jam 5
9. Tujuan penelitian Membandingkan hasil uji real-time PCR dengan kultur darah standar untuk mendeteksi bakteri dan jamur dalam darah pasien dgn IE 9
10. BAHAN DAN METODE PERIODE POPULASI TEMPAT 1 oktober 2005 - 30 oktober 2006 63 pasien dengan diagnosis IE dites sesuai prosedur (informed consent) Penelitiandilakukan DiRS Universitas Marseilles 10
11. BAHAN DAN METODE Protokol terdiri dari 3 unit spesimen : Unit pertama: - 2 botol kultur darah (aerob, anaerob) (Bactec, BD) - 1 tabung (serum) untuk mendeteksi faktor rheumatoid (RF Rapitex, Dade Behring), penentuan antibodi spesifik Coxiellaburnetii, Bartonellaspp, Brucella spp., Chlamydia spp., Mycoplasmapneumoniae, Legionellapneumophila,Aspergillusspp., - 1 tabung (darah EDTA) untuk pemeriksaan real- time PCR (SeptiFast test) 11
12. BAHAN DAN METODE - Unit kedua dan ketiga: masing-masing tdd 2 botol kultur darah digunakan berturut turut pada jam ke 2 dan ke 4 setelah tabung pertama Spesimen: 1.5 mL darah EDTA (real-time PCR) Dilisiskan dengan SeptiFast Lys. DNA diekstraksi dengan SeptiFast Prep Digunakan hybridization probe 12 Internal Control (IC) dilakukan pd masing-masing sampel.
13. BAHAN DAN METODE InternalTranscribedSpacer (ITS): target spesifik untukmendeteksipatogenbakteridanjamur. Kontrol positif: Reagen kontrol. Kontrol negatif disediakan oleh produsen dalam setiap seri ekstraksi. Fluoresensidiukur pada panjang gelombang 610, 640, 670, dan 705 nm. 13
14. BAHAN DAN METODE BAHAN DAN METODE Identifikasi spesies dan pelaporan digunakan SeptiFast Identification Software (SIS).. Perhitunganstatistikdenganmenggunakan softwareEpi Info Proporsidibandingkandenganmenggunakan Yates’ corrected Chi-square testatau Fisher’s exact test 14
18. hasil........ 19 Positif pada saat masuk Kultur darah 41 22 Negatif saat masuk RS Positif sebelum Masuk RS 18
19. hasil........ hasil........ SeptiFast 41 11 Positif pada saat masuk 8 Positif, pada pasien dengan kultur darah positif saat masuk 3 Positif, pada pasien dengan kultur darah positif sebelum masuk (11/41 dibanding 19/41, P=0.1) 19
21. hasil........ Diantara19 pasiendengan kultur darahnyapositif, ujiSeptiFast mempunyaisensitivitas yang rendah,hanya 8 yang terdeksi (42,1%) (Tabel 3) Di antara 22pasiendgnkulturdarahnegatifsaat masuk rumahsakit, ujiSeptiFastmendeteksi3 bakteri (S. gallolyticus, S. aureus, danEnterococcusfaecalis). 21
26. Diskusi....... Wilayah yang ditargetkandenganujiSeptiFastterletakantaraurutan 16S dan 23S rDNAbakteridanantaraurutan18S dan 5.8S rDNAjamur (ITS). Tahun 2002, Rothman et al.uji pada 51 penderita demam, penggunanarkobasuntikan. Hasilpenelitianmenunjukkanbahwa, dibandingkandengan kulturdarah, PCR yang menggunakan universal 16S rRNA primers mempunyaisensitivitasdanspesifisitas secara berturut-turut 86,7% dan 86,9%. 26
27. Diskusi....... Sensitivitas yang lebihtinggidiperoleh jika dibandingkandengan gen-gen single-copy, karenabeberaparibosomal operons paling sering ditemukan dalamgenomesbakteridanjamur. Spesifisitas yang lebihtinggidiperoleh jika dibandingkandenganrRNA,karena ITS lebihspecies-specific. 27
28. Diskusi SensitivitasanalitikdariSeptiFastdiuji dengan menggunakanbakteriyang diencerkan 100, 30, dan 3 CFU / ml dalamdarah EDTA. Sensitivitas minimal dari 30 CFU / mLdiperolehpadasemuaspesieskecualiStaphylococcus epidermidis, Staphylococcushaemolyticus Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, dan Candida glabrata (100 CFU / mL). 28
30. Diskusi UjiSeptiFast tidak dapat mendeteksibakterifastidious groupHACEK (Haemophilusspp, Actinobacillusactinomycetemcomitans, Capnocytophaga spp., Cardiobacteriumhominis, Eikenellacorrodens, Kingellakingae) yang dianggapsebagaiagenetiologi prevalensi IE. 30
31. Diskusi Bakteremiaterkaitdengan IE biasanya kontinu, jumlahnya sedikit,cutoffSeptiFast dibuat agak tinggi terutama untuk streptokokusdan staphylococcus koagulase-negatifuntukmenghindarifalse positif karena kontaminasiflora normal kulitnilai cutoff inimungkintelahmenghambatdeteksinya 31
32. Diskusi Interpretasihasil PCR komplekskarenaDNA yang dideteksi bukan dari patogenhidup,risiko terkontaminasi, adanya DNAbackgrounddalamdarah. UjiSeptiFastbaikuntukS. aureus, Streptococcus, danenterococci, burukuntuk Staphylococcus koagulase-negatif (0/15 dibanding 3/15 pada infeksipace makers, P= 0.2) danorganismeatipikallainnya (0/6 dibandingkan 4/6, P=0.03). 32
33. Diskusi Tiga Staphylococci koagulase-negatifdantigaenterobacteriaditemukandengan kultur danbukan denganujiSeptiFast. IE yang sebelumnyadiobatidenganantibiotik, dengan kulturdarahnyanegatifpadasaat masuk RS, uji SeptiFast memberikanetiologidalam tiga kasus. 33
34.
35. simpulan Kultur darahadalahkuncidiagnostik IE, tetapimemilikibeberapaketerbatasan:hasilnegatifakibatpengobatanantibiotik. Dalampenelitianini, uji SeptiFast mendeteksi bateri pada 3 pasien IE yang telah diobatidenganantibiotik,dengankultur darahnegatifpadasaat masukRS. UjiSeptiFast PCR adalahteknikkomersialbaruuntukmendeteksibakteremia yang dapatbergunadalam IE yang telah diobatidenganantibiotiksebelummasuk. 35
37. Prinsip dasar PCR: pelipatgandaan segmen DNA target (template) dalam tabung reaksi dengan bantuan enzim DNA Polimerase Pelipatgandaan DNA in vitro dilakukan dengan menambahkan primer – sepotong DNA pendek yang berpasangan dengan DNA target pada kedua ujung target dan kemudian memperpanjang rantai seukuran dengan DNA target, secara berulang, dengan bantuan DNA polimerase. 37
38. Metode PCR adalah paten teknologi yang dapat membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target Metode PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifisitas yang tinggi. Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985 38
39. Di dalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi 39
40. TAHAPAN PROSES PCR PRE-PCR : - preparasi reagensia - preparasi spesimen: isolasi/purifikasi DNA/RNA PCR : proses amplifikasi: - denaturasi (pemisahan rantai DNA) - annealing (penempelan primer) - extension (pemanjangan oleh enzim) POST-PCR: - deteksi/ analisa hasil PCR 40
41. PRE-PCRPreparasi spesimen:Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/ RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekuler biologi Ekstraksi DNA/RNA dai organisme eukariotik manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses: - penghancuran dinding sel - penghilangan komponen seluler seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel - pengendapan DNA/RNA - pemanenan 41
42. PROSES PCR: Aplifikasi Denaturasi oleh panas Penempelan pasangan primer berlabel biotin di kedua ujung sekuen target Taq DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer sebagai Komplemen Nukleotida Akhir siklus PCR ke-1 hasil 2 tiruan dari sekuen target Target amplifikasi: siklus PCR diulang 42
43. PROSES REVERSE TRANSKRIPTASE-PCR (RT-PCR) Master Mix + Target RNA Primer berlabel biotin menempel pada sekuen target RNA rTth DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer dengan nukleotida komplemennya Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA) terhadap sekuen target 43
44. PCR step 1 – denaturasi oleh panas PCR step 2 – penempelan primer pada cDNA PCR step 3 – rTth DNA Polymerase mengkalisa pemanjangan primer Akhir siklus ke- 1 PCR: hasil tiruan untai ganda DNA (amplikon) dari sekuen target 44
45. Deteksi/ analisa hasil PCR Elektroforesis gel agarosa (horizontal) Elektroforesis gel poliakrilamid (vertikal) Enzym labelling oligonucleotide Biotin-labelled oligonucleotide Digoxigenin-labelled oligonucleotide Selanjutnya RFLP, Sequencing dll. 45
46. Real-Time PCR Real-time PCR berarti amplifikasi dan analisa terjadi bersamaan Dikenal sebagai ‘Rapid Cycle PCR’ dengan siklus temperaturantara 20-60 detik Produk PCR dpt dianalisa selama proses amplifikasi Menggunakan pewarna DNA dan Probe fluoresensi Data dikoleksi dari tabung yang sama di dalam instrumen yang sama Tidak ada transfer sampel, penambahan reagensia atau gel separasi 46
47. Real-Time PCR Format deteksi: - SYBR Green I - Hybridization Probe (HybProbe Probes) - Hydrolisis probes/ Taqman Probes - SimpleProbe Probes Dapat melakukan real time quantitative PCR Real time PCR adalah metode yang powerful. Sederhana, dan cepat 47
48. Reaksi PCR berlangsung sangat cepat dengan bantuan alat DNA Thermal Cycler dan ditemukannya enzim tahan panas Taq DNA Polimerase oleh Dr. Gelfand tahun 1988. Proses reaksi PCR perlu kelengkapan komponen-komponen dasar, yaitu enzim DNA target, primer, monomer DNA (dNTPs), dan bufer reaksi. Segmen spesifik DNA hasil amplifikasi dapat dilihat langsung melalui reaksi gabungan PCR-Elisa yang menghasilkan spektrum warna tertentu. Pendeteksian Elisa sekarang banyak dikembangkan. 48
49. FLUORESCENCE SPECTROSCOPY Senyawa fluorescent menyerap cahaya pd panjang gelombang tertentu (absorbance spectrum) Cahaya yang diserap diemisikan (fluorescence spectrum) Sumber cahaya putih melalui filter untuk memilih warna spesifik yang mengoptimasi absorpsi fluorescent (excitation filter) Warna spesifik pada spektrum fluorescen dibaca dengan detektor 49
59. Sebuah probe terdiridari 2 label, fluorecence reporter danfluorecence quencher, yang sangatdekatsatusama lain. Ketika probe masihutuh, quencher menahansinyalfluoresensi reporter
![PENDAHULUAN KULTUR DARAH Gold standard Deteksi bakteremia dan fungemia Keterbatasa: - Positif palsu ,[object Object],2](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP///yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7)