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DEL CÁNCER 
APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA 
TUMORAL 
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Xátiva (Valencia) 
DIAGNÓSTICO 
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LINFOMAS 
1832 
Acuarela 
Robert Carswell
Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a 
tool for disease discovery. 
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DIAGNÓSTICO 
• Datos Clínicos 
• Estudio Morfológico 
• Estudio Inmunohistoquímico 
• Estudio Molecular
Características moleculares de 
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• Diagnóstico 
• Pronóstico 
• Terapéutica
Técnicas moleculares en el 
diagnóstico de linfomas 
• ¿Es realmente esencial para el diagnóstico? 
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Técnicas moleculares y diagnóstico 
de linfomas 
• ¿Qué cuestiones puede resolver? 
– Benignidad vs Malignidad (clonalidad...
Técnicas moleculares en linfomas 
• Estudios de clonalidad: reordenamientos de 
genes codificantes de receptores de 
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Reordenamiento de genes codificantes 
de receptores de antígenos 
• Proceso inmunológico 
• Generación de variabilidad gen...
Reordenamiento específico de 
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• Policlonal • Monoclonal
Estudios de clonalidad: Métodos 
• Southern blot: “gold standard” 
– Necesita buena calidad de ADN (Tejido 
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TCR1 
Reordenamiento monoclonal 
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Reordenamiento policlonal 
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Recidiva vs. Segundo tumor 
Linfoma de la zona marginal 
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Tres años después 
Adenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC
¿Transformación o segundo linfoma? 
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Limitaciones 
• Resultados falso negativos 
– Degradación del ADN 
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Estudios de clonalidad por PCR: 
Limitaciones 
• Resultados falso positivos 
– Exceso de sensibilidad 
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genes Ig o TCR no es equivalente a...
¡Monoclonalidad no es 
sinónimo de malignidad! 
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• Aplicaciones en el diagnóstico de los 
linfomas
Ventajas del FISH 
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Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63
Sondas “Dual-fusion” 
Patrón normal 
Núcleo en 
interfase 
Cromosomas en metafase
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Patrón normal 
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Sondas “Dual-fusion” 
Translocación recíproca 
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Cromosomas en metafase
Sondas “Dual-fusion” 
Translocación recíproca 
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Patrón normal 
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Cromosomas en metafase
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Ventajas del FISH “split” 
• Genes implicados en translocaciones con 
diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6) 
• No hay fal...
Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)
Linfoma folicular Bcl2 positivo
Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’
Linfoma folicular Bcl2 negativo
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• 90 % de los 
linfomas 
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• 30% de los 
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Crom 18 ...
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MBR+MCR 
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100% 
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Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)
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• Pronóstico (Linfoma MALT gástrico) 
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Isaacson and Spencer Histopathology 1987 
“Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm” 
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Marshall BJ y Warren JR 
(Premios Nobel de Medicina en 2005) 
Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)
Reordenamientos de BCL6 
• Gen en 3q27 
• Sonda ‘Split’ 
• Utilidad: 
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(¿pronóstico?)
Linfoma B de células grandes Bcl6 positivo
Reordenamientos de MYC 
• Característico del Linfoma de Burkitt 
• Más frecuente: t(8;14) 
• ‘Breakpoints’: alta variabili...
MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT 
CD20 
HE 
CD10 BCL6 
EBER MIB1
FISH – Reordenamiento en MYC 
• También útil: 
– Como marcador de progresión (Aberración 
secundaria) 
– Para la detección...
FISH 
BCL-2 MYC
Linfoma B Difuso de Células Grandes con 
reordenamiento de BCL-2 y MYC 
(Linfoma de la zona gris)
Translocación en ALK 
• Usualmente los linfomas anaplásicos portan 
ALK split probe 
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• Posibilidad de...
Técnicas moleculares en el 
diagnóstico de linfomas no Hodgkin 
• Estudios de clonalidad: PCR 
• Translocaciones caracterí...
Dave SS et al. Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma. 
N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442
DIAGNÓSTICO 
• Datos Clínicos 
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Plasmocitoma (HE)
Linfoma de Burkitt
Gracias por vuestra atención 
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  1. 1. BASES MOLECULARES DEL CÁNCER APLICACIÓN A LA PATOLOGÍA TUMORAL 12 de Enero de 2009 Xátiva (Valencia) DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN Jerónimo Forteza Vila Jefe de Servicio y Catedrático de Anatomía Patológica Hospital Clínico Universitario de Santiago
  2. 2. LINFOMAS 1832 Acuarela Robert Carswell
  3. 3. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG. Blood (2008) 112: 4384-4499 Elaine Jaffe Nancy Harris Harald Stein Peter G. Isaacson
  4. 4. DIAGNÓSTICO • Datos Clínicos • Estudio Morfológico • Estudio Inmunohistoquímico • Estudio Molecular
  5. 5. Características moleculares de los linfomas • Diagnóstico • Pronóstico • Terapéutica
  6. 6. Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas • ¿Es realmente esencial para el diagnóstico? – En el 90-95% de los casos, la morfología y el fenotipo son suficientes HE Bcl2 Linfoma folicular – Es esencial para el diagnóstico en el 5-10% de los casos
  7. 7. Técnicas moleculares y diagnóstico de linfomas • ¿Qué cuestiones puede resolver? – Benignidad vs Malignidad (clonalidad) • Proliferaciones de células B ambiguas • Linfomas de células T • Síndromes linfoproliferativos en pacientes inmunocomprometidos – Recaídas vs segundo linfoma (identidad clonal) – Tipos específicos de linfomas (translocaciones)
  8. 8. Técnicas moleculares en linfomas • Estudios de clonalidad: reordenamientos de genes codificantes de receptores de antígenos • Translocaciones (“clonality markers”)
  9. 9. Reordenamiento de genes codificantes de receptores de antígenos • Proceso inmunológico • Generación de variabilidad genética para obtener receptores diversos y específicos • Proceso similar en células B y en T (Ig y TCR)
  10. 10. Reordenamiento específico de V(D)J para cada clon • Policlonal • Monoclonal
  11. 11. Estudios de clonalidad: Métodos • Southern blot: “gold standard” – Necesita buena calidad de ADN (Tejido congelado) – Muy laborioso – Necesidad de material reactivo • PCR: más práctico – Permite el uso de material fijado en formol e incluido en parafina – Resultados en dos días – Más sensible
  12. 12. Electroforesis en gel de poliacrilamida FR3 P M C- mw
  13. 13. Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar) Monoclonal Policlonal FR3
  14. 14. Análisis de fragmentos (Electroforesis por capilar) Monoclonal Policlonal “Patrón de puercoespín” FR3
  15. 15. Reordenamiento en TCR por PCR • Cadena TCR gamma • Cadena TCR beta Electroforesis en gel de poliacrilamida P M C (-) PM
  16. 16. TCR1 Reordenamiento monoclonal TCR2 Reordenamiento policlonal Reordenamiento policlonal Reordenamiento monoclonal Análisis de fragmentos
  17. 17. Recidiva vs. Segundo tumor Linfoma de la zona marginal esplénico
  18. 18. Tres años después Adenopatía cervical: LBCG con translocación en MYC
  19. 19. ¿Transformación o segundo linfoma? 1ª biopsia (bazo) 2ª biopsia (ganglio)
  20. 20. Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones • Resultados falso negativos – Degradación del ADN • Incluir un gen de control interno – Hipermutación somática del gen IgH • Linfoma folicular, células plasmáticas neoplásicas – Abundante población acompañante policlonal – Reordenamientos inusuales, interferencia con segmentos translocados,…
  21. 21. Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones • Resultados falso positivos – Exceso de sensibilidad – “Pseudo-clones”: Pobreza de células diana – Baja resolución en electroforesis (gel de agarosa) • Usar poliacrilamida o electroforesis capilar
  22. 22. Estudios de clonalidad por PCR: Limitaciones • Reordenamientos clonales tanto de los genes Ig o TCR no es equivalente a línea B o T. • Infidelidad de linaje (Linfoma linfoblástico) • Explansión clonal de células B en linfomas T (LAI) o viceversa
  23. 23. ¡Monoclonalidad no es sinónimo de malignidad! - Inmunodepresión - Reacciones hiperinmunes (infecciones virales) - Enfermedades autoinmunes - Enfermedad de Castleman
  24. 24. Estudios de clonalidad por PCR: Estandarización • BIOMED-2 – PCR Multiplex (estudio de varias regiones en la misma reacción de PCR) – Realizable y reproducible – Linfomas B: 99% monoclonales – Linfomas T: 94% monoclonales – Lesiones reactivas: policlonalidad en la gran mayoría van Krieken et al. Leukemia (2007) 21: 201-206
  25. 25. Técnicas inmunohistoquímicas características de alteraciones citogenéticas Inmunohistoquímica como técnica molecular diagnóstica Cyclin D1 ALK1
  26. 26. Técnicas moleculares en linfomas Características de las alteraciones citogenéticas
  27. 27. Anormalidades citogenéticas por FISH • ¿Porqué es mejor el FISH? • Aplicaciones en el diagnóstico de los linfomas
  28. 28. Ventajas del FISH • No necesita células en cultivo • Puede aplicarse a extensiones citológicas y tejido fijado en formol e incluido en parafina
  29. 29. Diagn Mol Pathol (2008) 17:59-63
  30. 30. Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  31. 31. Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  32. 32. Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  33. 33. Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  34. 34. Sondas “Break-appart” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  35. 35. Sondas “Break-appart” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase
  36. 36. Ventajas del FISH “split” • Genes implicados en translocaciones con diferentes ‘partners’ (MYC, ALK, BCL6) • No hay falsos positivos virtualmente – En contraste, señales de fusión falsas son posibles debido a solapamiento nuclear • Fácil evaluación
  37. 37. Linfoma folicular con translocación en BCL2 (sonda ‘break-apart’)
  38. 38. Linfoma folicular Bcl2 positivo
  39. 39. Ausencia de translocación en Bcl2 – Sonda ‘break-apart’
  40. 40. Linfoma folicular Bcl2 negativo
  41. 41. Translocación en BCL2 • 90 % de los linfomas foliculares • 30% de los linfomas B difusos de célula grande Crom 18 bcl-2 Crom 14 Major Breakpoint Region 1 2 C+ C-PCR IgH 5’ MBR 3’
  42. 42. t(14;18) implicando al gen BCL2 PCR MBR PCR MBR+MCR FISH 100% 50% 30-40%
  43. 43. FISH - BCL2: utilidad • Hiperplasia folicular vs. Linfoma • Linfoma folicular vs. Otros linfomas de patrón nodular • Linfoma B de células grandes: pronóstico (?)
  44. 44. t(11;14) • Linfoma del manto • Cr. 11: gen Ciclina D1 • Cr. 14: gen IgH PCR en región MTC (“Major Translocation Cluster”) Sólo 50%! 1 2 3 C-C+
  45. 45. Linfoma del manto: Sonda ‘dual-fusion’ para t(11;14)
  46. 46. Linfoma del manto Ciclina D1 positivo
  47. 47. FISH – CCND1: utilidad • Linfoma del manto – Cuando hay problemas con la inmunotinción de la Ciclina D1 (no debería de haberlos) • Tricoleucemia – Recordar que la Ciclina D1 puede ser positiva por inmunohistoquímica pero negativa por FISH (clinicopatológicamente es una enfermedad muy distinta)
  48. 48. TRICOLEUCEMIA CD22 - Pancitopenia - Aspirado seco - Marcada esplenomegalia - No hay adenopatías Sangre periférica B. Fallini (2007)
  49. 49. FISH – Translocaciones en MALT1 • Pronóstico (Linfoma MALT gástrico) – No respuesta a los antibióticos – Probable diseminación • Detección: algunos RT-PCR; FISH (biopsias endoscópicas) • Diagnóstico diferencial – Infiltrados reactivos – Otros LNH
  50. 50. Linfoma MALT Isaacson and Spencer Histopathology 1987 “Discovery diseases. MALT lymphoma as a paradigm” Jaffe ES, et al. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Blood (2008) 112:4384-4399
  51. 51. Marshall BJ y Warren JR (Premios Nobel de Medicina en 2005) Helicobacter Pilory (Warthin-Starry)
  52. 52. Reordenamientos de BCL6 • Gen en 3q27 • Sonda ‘Split’ • Utilidad: – Linfoma B de células grandes (¿pronóstico?)
  53. 53. Linfoma B de células grandes Bcl6 positivo
  54. 54. Reordenamientos de MYC • Característico del Linfoma de Burkitt • Más frecuente: t(8;14) • ‘Breakpoints’: alta variabilidad (PCR) • FISH split: lo más útil
  55. 55. MORFOLOGÍA Y PATRÓN INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL LINFOMA DE BURKITT CD20 HE CD10 BCL6 EBER MIB1
  56. 56. FISH – Reordenamiento en MYC • También útil: – Como marcador de progresión (Aberración secundaria) – Para la detección de LBCG con doble translocación (“double hit”): BCL2 + MYC
  57. 57. FISH BCL-2 MYC
  58. 58. Linfoma B Difuso de Células Grandes con reordenamiento de BCL-2 y MYC (Linfoma de la zona gris)
  59. 59. Translocación en ALK • Usualmente los linfomas anaplásicos portan ALK split probe la t(2;5) – ALK/NPM • Posibilidad de diversos patrones ALK1 “INMUNOFISH”
  60. 60. Técnicas moleculares en el diagnóstico de linfomas no Hodgkin • Estudios de clonalidad: PCR • Translocaciones características: FISH • Material de rutina (Fijado en formol e incluido en parafina) • Técnicas útiles, pero deben ser interpretadas en el contexto clínicopatológico
  61. 61. Dave SS et al. Molecular diagnosis in Burkitt’s lymphoma. N Engl J Med (2006) 354: 2431-2442
  62. 62. DIAGNÓSTICO • Datos Clínicos • Estudio Morfológico • Estudio Inmunohistoquímico • Estudio Molecular
  63. 63. Plasmocitoma (HE)
  64. 64. Linfoma de Burkitt
  65. 65. Gracias por vuestra atención Facultad de Medicina (Universidad de Santiago

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