Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques - Présentation de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Claude GIRY - Biologiste - Centre Hospitalier - Mamoudzou, Mayotte - c.giry@chmayotte.fr

1. EVALUATION
par les FACILITATEURS
Outils moléculaires disponibles
pour surveiller la résistance aux
antipaludiques
Claude GIRY
Centre Hospitalier de Mayotte
Atelier Paludisme 2007

2. Problématique
La résistance aux antimalariques repose sur 3 mécanismes :
Mutations ponctuelles
Amplification génique
Activité transcriptionnelle
A chaque mécanisme correspond un ou plusieurs gènes dont
l’altération est associée à une résistance médicamenteuse
Chaque mécanisme fait l’objet d’études réalisées au moyen d’outils
moléculaires
Applications
Surveiller le développement des souches résistantes
Discriminer un échec thérapeutique d’une réinfection
Atelier Paludisme 2007

3. Mutations ponctuelles
Antipaludique Gène Remplacement acide aminé induit par
ciblé une mutation ponctuelle
Sulfadoxine, Dapsone dhps S436A/F, A437G, K540E, A581G,
A613S/T
Pyriméthamine, Trimethoprim dhfr N51I, C59R, S108N, I164L
ou C50R, N51I, S108N, I164L
Proguanil, Chlorproguanil dhfr A16V, S108T
ou N51I, C59R, S108N, I164L
Chloroquine crt C72S, M74I, N75D/E, K76T, A220S,
Q271E
mdr 1 N86Y, Y184F, S1034C, N1042D, D1246Y
Mefloquine, Quinine, mdr 1 Codon sauvage N86
Halofanthrine, Lumefantrine Nb copies gène mdr1 > 1
Atovaquone cyt b Y268S/N
Atelier Paludisme 2007

4. Mutations ponctuelles
PCR en temps final
Principe d’une réaction de PCR SSOPDIG PCR ELISA
AS PCR RFLP PCR
NZILA-MOUNDA, A. et al. DURAISINGH, M.T. et al.
(Jan. 1998). Antimicrobial (1998).
Agents and Chemotherapy.
Exp Parasitol. 89;1-8 Alifrangis et al. (2005). Am. J. Trop.
p. 164-169
Med. Hyg. 72(2); pp. 155–162

5. Mutations ponctuelles
PCR en temps réel
Principe SYBR Green I
Sondes d’hydrolyse Taqman Sondes d’hybridation

6. Mutations ponctuelles
Séquençage
Séquençage direct Pyroséquençage
Coût
/échantillon/SNP
RFLP 6.58 USD
Séquençage
3.66 USD
direct
Pyroséquençage 2.28 USD
Zhou et al. (2006). J Clin Microbiol. 44(11);
p 3900–3910.
Pyrosequencing, a High-Throughput Method
for Detecting Single Nucleotide
Polymorphisms in the Dihydrofolate
Reductase and Dihydropteroate Synthetase
Genes of Plasmodium falciparum

7. Mutations ponctuelles
DNA Chips
BRYANT et al. (2004). Lancet Infect Dis 2004; 4: 100–111

8. Mutations ponctuelles
PCR-RFLP Pf. DHPS K540E
M
d nd
D’après Mbugi et al. (2006).
Malaria Journal, 5:94. p 1-11

9. Mutations ponctuelles
PCR temps réel Pf. DHFR S108N
Extracteur d’acides
nucléiques (MagNA Pure
Compact Roche)
Thermocycleur
temps réel
(TaqMan 48
Roche)
Laboratoire de biologie – Centre Hospitalier de Mayotte
D’après une adaptation du protocole de Alker et al. (2004).
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 2924–2929

10. Amplification génique
PCR temps réel - Pfmdr-1
SYBR Green I / Taqman
Gènes de référence présents à 1
ou plusieurs copie(s)
Souche Pf. à tester vs. souche Pf.
contrôle
Méthode du ∆∆CT
Nb de copies relatif
= 2−∆∆CT=2 −( (CTER-CTEC)-(CTBR-CTBC) )
R : gène de référence
C: gène cible
E: souche à tester
B: souche de référence
Illustration: C. GIRY – Centre Hospitalier de Mayotte
Exemple: Price et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and
increased pfmdr1 gene copy number ». Lancet. 364; p 438-47

11. Activité transcriptionnelle
PCR temps réel - Pfmdr-1
Stratégie Quantification relative
Echantillon SYBR Green I
Extraction d’ARN Gènes de référence
(housekeeping genes) dont
DNase I
l’expression n’est pas affectée par
Purification ARNm l’antipaludique.
cDNA synthesis Méthode du ∆∆CT
Random priming
Optimisation
OligodT priming
Volume d’échantillon
Sp. primer priming dNTPs, Mg2+ / Mn2+
Real time PCR Concentration en primers
Real time PCR 2-step qRT-PCR t° et temps d’annealing/extension
Efficacité de l’amplification
1-step qRT-PCR Atelier Paludisme 2007

12. Applications (I)
Surveillance de la propagation des résistances
Chloroquine Pyriméthamine Sulfadoxine
D’après Jelinek et al.(2002). Malaria Journal. I:II; p 1-7
Atelier Paludisme 2007

13. Applications (II)
Discriminer réinfection vs. recrudescence
Recrudescence témoigne d’un échec
thérapeutique précoce ou tardif
Utilisation de marqueurs polymorphiques
Msp1, Msp2, Glurp
Microsatellites
Atelier Paludisme 2007

14. Conclusions
Perspectives
Détection / Quantification
absolue de pathogènes
RFLP Séquençage
Génotypage
PCR
TEMPS
REEL
Quantification Amplification
d’ARNm génique
Délétion
Variants Translocation
d’épissage
Réarrangement
Atelier Paludisme 2007

15. Références Merci de votre attention
ALIFRANGIS, M. et al. (2005). « A Simple, High-Throughput Method to Detect Plasmodium
falciparum Single Nnucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase, Dihydropteroate
Synthase, and P. Falciparum Chloroquine Resistance Transporter Genes Using Polymerase
Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Technology ». Am. J. Trop.
Med. Hyg. 72(2); p. 155–162
BERRY, A. et al. (2006). « Prevalence of Plasmodium falciparum cytochromeb gene mutations in
isolates imported from Africa, and implications for atovaquone resistance ». Transactions of the
Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 986-988
DURAISINGH, M.T. et al. (2005). « Contribution of the pfmdr1 gene to antimalarial drug-
resistance ». Acta Tropica. 94; p 181–190
HYDE, J.E. (2002). « Mechanisms of resistance of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs ».
Microbes and Infection. 4; p165-174
HYDE, J.E. (2005). « Drug-resistant malaria ». TRENDS in Parasitology. 21(11); p 494-498
JONES, P.M. et al. (2005). « Multidrug resistance in parasites: ABC transporters, P-glycoproteins
and molecular modelling ». International Journal for Parasitology. 35 ; p 555–566
LE BRAS, J. et al. (2006). « Les résistances aux médicaments antipaludiques ». Médecine et
maladies infectieuses. 36 ; 401–405
MBUGI, E.V. et al. (2006). « Drug resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in Plasmodium
falciparum malaria in Mlimba, Tanzania”. Malaria Journal. 5(94) ; p 1-11
PLOWE, C.V. (2003). « Monitoring antimalarial drug resistance: making the most of the tools at
hand ». The Journal of Experimental Biology. 206; p 3745-3752
PRICE, R.N. et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased
pfmdr1 gene copy number ».Lancet. 364; p 438–47
RANDRIANARIVELOJOSIA M. et al. (2006). « First evidence of pfcrt mutant Plasmodium
falciparum in Madagascar ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene.
100; p 826-830
WILSON, P.E. et al. (2005). « Real-time PCR methods for monitoring antimalarial drug
resistance ». TRENDS in Parasitology. 21(6); p 278-283
WOODROW, C.J. et al.(2006). « Antimalarial drugs: recent advances in molecular determinants
of resistance and their clinical significance ». Cell. Mol. Life Sci. 63 ; p 1586–1596