1. CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN
1. Định nghĩa
Protein là những đại phân tử được tạo thành từ các đơn phân axít amin, chúng kết hợp với
nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptit (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể
xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của
protein. Protein có thể gồm l hay nhiều chuỗi polypeptit cùng loại hay khác loại. Tính đặc thù và
đa dạng của protein được thể hiện ở số lượng axit amin, thành phần và trình tự sắp xếp các axit
amin trong chuỗi polypeptit và cấu trúc không gian của protein.
Protein đơn bào là thuật ngữ gọi theo quy ước dùng để chỉ nguồn protein thu được từ vi
sinh vật. Phân biệt với protein đa bào thu được từ động vật và thực vật.
2. Cấu trúc của protein
Cấu trúc bậc một: Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi
polypepetit. Đầu mạch polypeptit là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm
cacboxyl của axit amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của
các axit amin trên chuỗi polypeptit. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì
trình tự các axit amin trên chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi
polypeptit, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như
vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biến
đổi cấu trúc và tính chất của protein.
Cấu trúc bậc 1
Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptit trong không gian. Chuỗi
polypeptit thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp
β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau. Các protein sợi như
Trang 1

2. keratin, colagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu
có nhiều nếp gấp β hơn.
Cấu trúc bậc 2
Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi
có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết
định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính
chất của gốc -R trong các mạch polypeptit. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu
disunphua (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ
xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị
nước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị
có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu.
Cấu trúc bậc 3
Trang 2

3. Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptit phối hợp với nhau thì tạo nên
cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptit liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như
liên kết hyđro. Chi khi hình thành cấu trúc bậc 4 thì protein mới có hoạt tính sinh học.
Cấu trúc bậc 4
3. Chức năng của protein
Loại protein Chức năng Ví dụ
Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền, mềm dẻo của
Protein cấu mô liên kết, dây chằng, gân, mô xương. Keratin tạo nên cấu
trúc thường Cấu trúc, nâng đỡ trúc chắc của da, lông, móng. Fibroin của tơ nhện, tơ tằm tạo
có dạng sợi nên độ bền vững của tơ nhện, vỏ kén. Sclerotin tạo sự bền vững
cho lớp vỏ ngoài của sâu bọ.
Xúc tác sinh học: Xúc tác hầu hết các phản ứng sinh học từ đơn giản đến phức
Protein tăng vận tốc phản tạp. Các enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức ăn,
Enzyme ứng, chọn lọc các amylase trong nước bọt phân giải tinh bột chín, protease phân
phản ứng sinh hóa giải protein, lipase phân giải lipid
Protein điều Điều hòa quá trình Insulin và Glucagon do tuyến tụy tiết ra có tác dụng điều hòa
hòa truyền thông tin di hàm lượng đường glucose trong máu động vật có xương sống.
truyền, quá trình Thyroglobulin từ tuyến giáp điều hòa các quá trình chuyển hóa
Trang 3

4. nói chung. Calcithonin có tác dụng hạ thấp nồng độ canxi trong
trao đổi chất
máu.
Hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống),
Protein vận Vận chuyển các
hemoxianin (ở động vật ko xương sống) có vai trò vận chuyển
tải chất trong cơ thể
oxy từ phổi theo máu tới khắp các mô và cơ quan trong cơ thể.
Tham gia vào chức
Protein vận Actin và myosin có vai trò vận động cơ ở tế bào nhân thật.
năng vận động của
động Tubulin có vai trò vận động lông, roi của các sinh vật đơn bào
tế bào và cơ thể
Cảm nhận, đáp Một số protein có vai trò trung gian cho phản ứng trả lời của tế
Protein thụ
ứng các kích thích bào thần kinh với các kích thích đặc hiệu. VD. Vai trò của sắc
quan
của môi trường tố thị giác rodopxin ở màng lưới mắt.
Albumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấp axit amin cho phôi
Protein dự Dự trữ chất dinh phát triển. Casein trong sữa mẹ là nguồn cung cấp acid amin
trữ dưỡng cho con. Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ cần cho
hạt nảy mầm như gliadin trong lúa mì, zein trong ngô.
Các kháng thể (antibodies) còn được gọi là immunoglobulin tạo
Bảo vệ cơ thể khỏi
Protein bảo ra hàng ngàn protein khác nhau để phản ứng lại các kháng
sự tấn công của
vệ nguyên (antigens), bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các
những vật thể lạ
vật thể lạ.
4. Cơ chế sinh tổng hợp protein trong tế bào
Sao mã: Là quá trình tổng hợp mARN. mARN sau khi được tổng hợp sẽ rời khỏi nhân
đến tế bào chất để tham gia giai đoạn giải mã.
Giải mã: gồm 2 bước
- Bước 1: Hoạt hóa axit amin
Axit amin + ATP Enzym Axit amin hoạt hóa
Axit amin hoạt hóa + tARN Enzym Phức axit amin – tARN
Trang 4

5. - Bước 2: Tổng hợp chuỗi poly peptit: Tại mã mở đầu AUG, riboxom tiếp xúc với
mARN, aa mở đầu-tARN tiến vào riboxom khớp bổ sung đối mã với mã mở đầu, sau đó aa1-
tARN tiếp tục tiến vào riboxom khớp bổ sung đối mã với mã sau 1. Sau đó liên kết peptit được
thành lập giữa aa mở đầu với aa1. Riboxom dịch chuyển 1 bộ 3 trên mARN, tARN mở đầu rời
riboxom. Cứ như vậy khi riboxom dịch chuyển đến mã kết thúc, không giải mã mà rời khỏi
mARN, đồng thời chuỗi polypeptit được giải phóng. Sau đó aa mở đầu được tách khỏi mạch
polypeptit nhờ enzym đặc hiệu. Chuỗi polypeptit tại thành những cấu trúc bậc cao hơn để tạo
thành protein hoàn chỉnh. Một mARN có thể liên kết nhiều riboxom cùng lúc để tổng hợp nhiều
protein cùng loại.
5. Tại sao phải sản xuất protein đơn bào
5.1. Vai trò của protein trong cuộc sống
Cơ thể người và động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp các chất dinh dưỡng có trong
thức ăn để tiến hành trao đổi chất, duy trì sự sống, tăng cường sinh trưởng và phát triển. Thức ăn
ngoài nước còn bao gồm các nhóm chất: protein, lipit, gluxit, vitamin, muối khoáng,... trong đó
protein là quan trọng nhất.
Protein là nguồn nitơ duy nhất cung cấp cho con người và động vật, nó không phải là
nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu (sau glucid và lipid) mà trong quá trình cơ thể đồng hóa
protein được phân giải thành 20 acid amine cần thiết cho cơ thể. Trong đó có các acid amine
không thay thế rất cần thiết cho con người và động vật là Isoleucine, leucine, lysine, methionine,
phenylalanine, treonine, tryptophan và valin. Nếu không nhận được các aa này cơ thể sẽ bị bệnh
tật và chết.
5.2. Tính cấp thiết của CNSX protein đơn bào
Trang 5

6. Hiện nay nhân loại đang đứng trước vấn đề bùng nổ dân số, mỗi năm tăng khoảng gần
100 triệu người. Năm 1996 có 5,7 tỉ người, năm 2000 lên đến trên 6 tỉ người, Dự kiến đến năm
2020 là 8,5 tỉ và nếu không có sự kiểm soát chặt chẽ của mỗi quốc gia thì đến năm 2050 có thể
lên tới con số 10 tỉ dân. Trong đó gần 50 % là trẻ em, đòi hỏi trong khẩu phần ăn hàm lượng
protein cao nhưng lại chưa có khả năng lao động. Hiện nay lượng lương thực, thực phẩm trên
thế giới chỉ đủ cung cấp gần 2/3 nhu cầu protein cho con người. Ở Việt Nam, tính trung bình
hiện nay chỉ cung cấp được khoảng 40g Pr/ ngày/người, thậm trí có các quốc gia hiện nay có
hàm lượng protein trung bình là 3 – 20 g/người/ngày.
Vì vậy, công nghệ sản xuất protein đơn bào giải quyết vấn đề thiếu hụt protein trên thế
giới. Cơ sở khoa học của giải pháp này là lợi dụng sự phát triển nhanh chóng của vi sinh vật và
sự phong phú về protein, axit amin trong tế bào vi sinh vật làm nguồn thức ăn cho người và gia
súc.
Hiệu suất sinh tổng hợp protein ở các đối tượng khác nhau
Các loài (1000 kg) Sản lượng protein/ngày (kg) Hiệu suất/ngày (%)
Bò 1 0,1
Đậu tương 10 1
Nấm men 105 104
Vi khuẩn 1011 1010
5.3. Giá trị dinh dưỡng của protein vi sinh vật
Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật (% khối lượng khô)
Thành phần Nấm sợi Tảo Nấm men Vi khuẩn
Nitơ 5-8 7,5-10 7,5-8,5 11,5-12,5
Lipit 2-8 7-20 2-6 1,5-3
Chất tro 9-14 8-10 5-9,5 3-7
Axit nucleic - 3-8 6-12 8-16
Trong thành phần nitơ của vi sinh vật có mặt các axit amin không thay thế mà hàm lượng
có thể so sánh với protein của trứng và thịt bò.
Hàm lượng axit amin không thay thế của một số nguồn protein (mg/100g chất khô)
Trang 6

7. Axit amin Lúa mỳ Trứng Spirulina S. cerevisiae Candida Pseudomonas
maxima lipolytica
Lysine 2,8 6,5 4,6 7,7 7,8 5,3
Threonin 1,9 5,1 4,6 4,8 5,4 4,5
Methionin 1,5 3,2 1,4 1,7 1,6 1,8
Cystein 2,5 2,4 0,4 - 0,9 0,3
Tryptophan 1,1 1,6 1,4 1,0 1,3 -
Izolơxin 3,3 6,7 6,0 4,6 5,3 3,9
Lơxin 6,7 8,9 8,0 7,0 7,8 7,0
Valin 4,4 7,3 6,5 5,3 5,8 5,9
Phenylalanin 4,5 5,8 5,0 4,1 4,8 4,2
Tế bào vi sinh vật chứa nhiều loại vitamin. Nấm men giàu vitamin nhóm B, vi khuẩn
chiếm ưu thế về VTM B12, tảo chứa nhiều β-caroten (tiền VTM A) và tocopherol, nấm mốc chứa
ít VTM nhất.
Hàm lượng vitamin (mg/100g chất khô)
Vitamin Candida utilis S. cerevisiae Pseudomonas
methanica
Thiamine (B1) 0,53 5-36 1,81
Riboflavin (B2) 4,50 3,6-4,2 4,82
Niacin (B3) 41,73 32-100 15,9
Pyridocyn (B6) 3,34 2,5-10 14,3
Axit pantothenic (B5) 3,72 10 2,42
Choline (hỗn hợp VTMB) - - 968
Axit folic (dạng hòa tan của B9) 2,15 1,5-8 -
Inositol (Bh) - - -
Biotin (VTM H) 0,23 0,5-1,8 -
VTM B12 0 0 0,96
Axit p-amineobenzoic (BX) 1,7 0,9-10 -
Do cơ thể không tự tổng hợp đựợc các axit amin không thay thế nên phải bổ sung qua
thức ăn. Nếu bị thiếu một trong số các axit amin này hoặc không đủ về lượng thì không thể đồng
Trang 7

8. hóa hết lượng protein có trong thức ăn. Hầu hết các loại thức ăn đều thiếu 1 hay nhiều loại axit
amin nên thông thường trong bữa ăn hàng ngày nên ăn nhiều loại thức ăn khác nhau để cung cấp
đầy đủ axit amin không thay thế cho cơ thể.
Các loại aa không thay thế thiếu hụt trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau
Thực phẩm Loại axit amin thiếu hụt Phần trăm thiếu
Trứng Không 0
Thịt bò Cystein, Methionin 29
Sữa bò Cystein, Methionin 32
Gạo, lúa mì, ngô Lyzin 61-72
Nấm men bánh mì Cystein, Methionin 55
Vì vậy nguồn protein vi sinh vật là vô cùng quan trọng bổ sung đầy đủ các thiếu hụt về
protein nói chung và axit amin không thay thế nói riêng cho con người và động vật.
6. Các nguồn thu protein
• Protein động vật:
Protein động vật là nguồn protein phổ biến nhất bao gồm hệ thống protein của thịt, cá,
trứng, sữa... Protein cá thường ít tan trong nước nếu chưa được khử lipit tốt. Trong công nghệ
protein thường Protein sữa bao gồm cazein, cazeinat và lactoserum. Cazein là một protein có
tính chất tạo nhũ được sử dụng nhiều trong thực phẩm. Protein của máu và nội tạng động vật là
nguồn protein có thể thu hồi cho sản phẩm giá trị cao như globin, chất tạo nhũ sử dụng trong
công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác.
• Protein thực vật
Do đặc trưng cấu tạo loài, thực vật được xem là nguồn protein ít phổ biến nhất ngoại trừ
một số nguồn protein kinh điển như đậu tương. Gần đây protein từ các nguồn đậu khác như đậu
Hà Lan, đậu đỏ, các loại hạt như hạt hướng dương, hạt cải cũng được khai thác và sử dụng. Các
loại lá thực vật là một nguồn protein phong phú, tuy nhiên do cấu trúc và thành phần phức tạp,
protein thường nằm trong hỗn hợp các thành phần khác nhau của lá thực vật, liên kết với các
thành phần không có giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học, vì thế nguồn protein lá thực vật được
khai thác rất ít. Gần đây một số protein lá thực vật được khai thác chủ yếu để thu hồi các enzym
có hoạt tính sinh học.
• Protein vi sinh vật
Trang 8

9. Protein vi sinh vật được xem là nguồn protein hấp dẫn do chứa khá đầy đủ và cân đối
thành phần các axit amin cũng như hàm lượng protein của tế bào vi sinh vật. Nguồn protein vi
sinh vật có lợi thế như tốc độ sinh trưởng nhanh, thức ăn rẻ, nâng cấp sản xuất dễ dàng, chủ
động thiết kế và xây dựng dây chuyền công nghệ tổng hợp protein, không phụ thuộc vào thời
tiết hay khí hậu, có khả năng kiểm soát quá trình chặt chẽ.
• Protein tái tổ hợp
Bên cạch các protein khai thác từ các nguồn tự nhiên, một nguồn protein rất quan trọng là
protein thu được từ các vi sinh vật cải biến gen. Tiến bộ trong kỹ thuật gen trong vài thập kỷ gần
đây cho phép tạo ra các protein mới dựa vào việc tạo ra các gen tái tổ hợp. Hiện nay các protein
tái tổ hợp có đặc tính quý được biểu hiện trong các vật chủ là động vật, thực vật hoặc vi sinh vật
càng làm phong phú thêm nguồn protein và khả năng sử dụng chúng.
CHƯƠNG II: NGUỒN DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT
1. Dinh dưỡng cacbon
Nguồn cacbon trong tự nhiên rất phong phú. Tất cả các hợp chất cacbon nào (trừ kim
cương và than chì) đều được VSV sử dụng. Đây là nguồn dinh dưỡng chủ yếu có trong môi
trường có giá thành tương đối rẻ như CO 2, hydratcacbon (rỉ đường, bã mía, bã bia, dịch kiềm
sunfit...), cacbua hydro (n-parafin, khí metal...). Dinh dưỡng cacbon xảy ra ở cả ngoại bào và nội
bào.
- Ngoại bào: Tinh bột α-amilase Dextrin β-amilase maltose và saccharose
Maltose Maltase 2 glucose (mono saccharid)
Saccharose Saccharase và investase glucose + fructose (mono saccharid)
- Nội bào:
Maltase glucose Có oxy Protein, aa, a.acetic, các sán phẩm LM hiếu khí
Không oxy
Các sản phẩm LM yếm khí CO2, H2O, rượu, acid lactic ...
Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào:
- Thành phần và cấu tạo hóa học, đặc biệt là mức độ ôxi hóa của nguyên tử cacbon.
Trang 9

10. - Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật
+ Với các chất có phân tử lượng thấp thì VSV có thể đồng hóa trực tiếp
+ Với các hợp chất hữu có cao phân tử sẽ được phân hủy nhờ các enzym để tạo thành các
hợp chất thấp phân tử hơn mà VSV có thể đồng hóa được.
+ Với các hợp chất không tan trong nước (xenluloza, parafin...) thì vi sinh vật hấp thụ
quanh bề mặt của chúng và phân giải dần dần.
Các nguồn cacbon thường được sử dụng là các loại đường sacaroza, maltoza, glucoza,
hexoza và các loại bột ngũ cốc như bột gạo, bột ngô, bột đại mạch... chứa chủ yếu là tinh bột. Để
đồng hóa được tinh bột VSV phải tiết ra môi trường enzym amilaza như α-amilaza, β-amilaza
và α-glucosidaza. Hệ enzym này được sinh ra trong tế bào rồi được tiết ra môi trường để phân
hủy tinh bột.
2. Dinh dưỡng nitơ
Vi sinh vật cũng như các cơ thể sống khác cần nitơ để xây dựng tế bào, tất cả các thành
phần quan trọng của tế bào đều chứa nitơ.
Nguồn nitơ
- Nitơ trong không khí: lượng nitơ này rất phong phú nhưng nó rất bền vững về mặt hóa
học, rất khó bị ôxi hóa hoặc khử. Chỉ có một số VSV có khả năng cố định nitơ mới có khả năng
đồng hóa nitơ không khí.
- Nitơ hữu cơ: cấu trúc chủ yếu là aa. Các aa có mặt trong môi trường thường không được
VSV sử dụng trực tiếp mà phải tiến hành 2 loại phản ứng khử amin và khử cacboxyl. Nitơ hữu
cơ thường sử dụng: cao ngô, khô đậu tương, khô lạc, pepton, cao thịt, cao nấm men ... Muốn
đồng hóa được các chất này VSV phải tiết vào môi trường hệ enzym protease để thủy phân
protein thành aa.
- Nitơ vô cơ: thường sử dụng các muối amon: (NH 4)2SO4, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4,
NH4H2PO4, NH4NO3 là nguồn nitơ mà tất cả các VSV đều có khả năng đồng hóa.
Ure được dùng bổ sung nguồn nitơ và điều chỉnh pH môi trường, dưới tác dụng của
urease, ure phân huỷ thành CO2 và NH3.
(NH2)2CO + H2 Urease 2NH3 + CO2
Trang 10

11. Nguồn nitrat VSV cũng không thể đồng hóa được mà phải trải qua quá trình biến đổi
dưới tác dụng của enzym nitratreductase để tạo thành sản phẩm cuối cùng là NH 3.
3. Dinh dưỡng khoáng
- Các hợp chất phospho: có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào
VSV. Liên kết cao năng là nguồn cung cấp năng lượng sống khá lớn cho tế bào VSV (dạng
ADP, ATP). Ngoài ra phospho trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzym
đồng hóa nguồn cacbon.
Nguồn phospho thường là các hợp chất phospho hữu cơ trong bột đậu, cao ngô, bã rượu,
khô dầu... và các hợp chất phospho vô cơ, các muối phospho... Nhu cầu phospho của vi sinh vật
phụ thuộc vào từng chủng VSV, vào tỉ lệ thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Thông
thường tỉ lệ C : N : P trong môi trường phải cân đối thường = 100 : 10 : 1.
- Các chất khoáng khác: Trong tế bào vi sinh vật có hàng loạt các chất khoáng khác
nhau như magie, natri, sắt, nhôm, kali, liti, rumidi, mangan, chì... Vi sinh vật lấy chất khoáng từ
môi trường dinh dưỡng, những chất khoáng này có thể có sẵn trong nước, trong các hợp chất có
chứa cacbon, nitơ nhưng cũng có khi phải bổ sung thêm vào môi trường.
4. Các chất kích thích sinh trưởng
Biotin, penicilin, acid béo và các chất hoạt động bề mặt, các aa như cystein, xistin,
histidin, leuxin, VTM B1, các loại axit hưu cơ như acid citric, oxalic, tri hoặc tetra-polyphosphat
để ức chế sự phát triển của thực khuẩn thể. ..
5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của VSV
- Nước là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến tế bào VSV. Nó hòa tan các nguồn
dinh dưỡng để đưa vào cơ thể VSV. Nước chiếm 80-85% trọng lượng cơ thể.
- Chất khô: Cao trên 60% hầu hết VSV không sinh trưởng và sinh sản được
- Nhiệt độ: Các VSV thích nghi ở các điều kiện nhiệt độ tương đối đa dạng. Có chủng thì
thích hợp ở nhiệt độ thấp 0 – 15oC, đại đa số nhiệt độ tối thích ở khoảng trung bình 25-37 OC còn
lại thích nghi ở nhiệt độ cao 50-75OC.
Bảng nhiệt độ tối thích, tối thiểu, tối đa của VSV (oC)
VSV Nhiệt độ tối thiểu Nhiệt độ tối thích Nhiệt độ tối đa
Vi khuẩn 8-10 30-35 40-45
Trang 11

12. Nấm mốc 7-10 33-37 40-43
Nấm men 0,5-5 20-30 40-50
- pH: có ảnh hưởng rất lớn đến VSV
Bảng pH tối thích, tối thiểu, tối đa của VSV
VSV pH tối thiểu pH tối thích pH tối đa
Vi khuẩn 4,0-4,7 6,0-6,5 7,9-8,5
Nấm mốc 1,5 4,0-6,0 9,0-11,0
Nấm men 3,0-3,5 4,5-6,0 8,5
- Oxy: là nguyên tố không thể thiếu đối với hoạt động sống. Trong công nghệ vi sinh
chúng ta quan tâm đến nồng độ oxy tới hạn. Trong điều kiện sinh trưởng lượng oxy cần nhiều
hơn nồng độ oxy tới hạn. Khi nhiệt độ tăng hàm lượng oxy hòa tan giảm.
Bảng qua hệ giữa nhiệt độ và nồng độ oxy hòa tan
Nhiệt độ (OC) [O2] mg/l H2O
0 14,6
6 12,5
10 11,3
16 10
20 9,2
26 8,2
30 7,6
Nhu cầu về oxi của VSV và ảnh hưởng của nó đến quá trình lên men:
- Oxi là một trong những yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất. Oxi hòa
tan trong nước được 9-10mg/l. Vì tế bào cần oxi để hô hấp nên cần cung cấp đều đặn,
nếu thiếu oxi nhất thời hoặc ở khu vực nào đó sẽ phá vỡ sự trao đổi chất trong tế bào
và phải cung cấp oxi sao cho tốc độ hòa tan oxi bằng tốc độ sử dụng oxi. Việc sục khí
đảm bảo cung cấp oxi cho môi trường và cân bằng nhiệt độ lên men
Trang 12

13. - Khi sử dụng cánh khuấy, oxi tiếp xúc với màng tế bào do đó cần sục khí sao cho áp
suất bên ngoài lớn hơn áp suất bên trong tế bào.
- Trong quá trình nuôi cấy không khí được nén vào thùng lên men, tốc độ cánh khuấy
tăng dần làm thay đổi tốc độ hòa tan và có thể trộn đều các chất giúp VSV đồng hóa
tốt hơn, có thể tách nhanh các sản phẩm trao đổi chất của tế bào vào môi trường
- Tuy nhiên nếu khuấy quá mạnh sẽ phá vỡ tế bào. Thông thường phải tính toán chiều
cao của cánh khuấy phù hợp với thùng lên men
- Trong thời kỳ sinh trưởng, VSV cần oxi, cường độ bão hòa oxi trong môi trường phụ
thuộc vào áp suất và nhiệt độ. Áp suất tăng đến 50KPa thì độ hòa tan của oxi tăng 10-
15%, khi nhiệt độ tăng thì độ hòa tan của oxi giảm. Độ hòa tan của oxi giảm khi trong
môi trường có các chất dạng huyền phù. Trong môi trường có xác tế bào sẽ làm giảm
độ hòa tan của oxi 85-90%. Nếu trong môi trường có những chất có khả năng khuếch
tán bọt thì độ hòa tan oxi tăng. Nước biển (3-4% NaCl) hòa tan oxi kém nước ngọt
20%.
CHƯƠNG III. CÁC VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG CNSX
PROTEIN, AXIT AMIN
1. Tảo
Trong tự nhiên có nhiều loại tảo có hàm lượng protein cao nhưng ko sử dụng được cho
người và gia súc vì chúng có độc tố. Ở Châu Phi người ta vớt tảo lam Spirulina maxima ở các ao
hồ giàu muối canxi làm thức ăn bồi bổ và dùng làm thuốc chữa một số bệnh như phù chân, đau
răng và các bệnh về đường tiêu hóa. Cho đến nay có 3 loại tảo đơn bào đuợc sản xuất trên quy
mô lớn và có hiệu quả kinh tế cao là: Chlorella, Spirulina và Scenedesmus.
Ưu điểm của tảo đơn bào:
- Giá trị dinh dưỡng cao và có khả năng ứng dụng rộng rãi
+ Tảo đơn bào có hàm lượng protein rất cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô), riêng tảo
Spirulina chiếm tới 70% chất khô.
Trang 13

14. + Protein của tảo thuộc loại protein hoàn hảo. Hàm lượng protein trong tảo gần với quy
định protein tiêu chuẩn. Lượng aa không thay thế rất cao, có thể chiếm tới 42% tổng số
aa.
+ Tảo chứa nhiều VTM như VTM A, B, C, K (đặc biệt là VTM A, B12 và VTM C) và
chất lượng các VTM này rất tốt. Ngoài ra còn có axit aconitic, axit pantotenic, biotin,
lecophorin.
- Cho đến nay chưa tìm thấy độc tố nào nguy hiểm trong các loại tảo trên.
- Tảo có diệp lục nên chúng là loài tự dưỡng do chúng có khả năng quang hợp khác với
các loài vi sinh vật khác.
- Tảo có kích thước tế bào lớn, thuận lợi cho quá trình thu nhận cũng như số lượng sinh
khối.
- Không bị virus tấn công, môi trường nuôi cấy đơn giản.
- Tảo có khả năng làm sạch các nguồn nước bẩn, giữ vệ sinh môi trường. Tảo lam còn
tham gia quá trình cố định nitơ của không khí nhờ những tính chất đặc biệt của mình.
3. Mấm men
Trong các nguồn protein sản xuất bằng VSV, nấm men được nghiên cứu sớm nhất và
được ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Con người đã sử dụng nấm men hoặc các sản phẩm của
chúng từ hàng ngàn năm nay.
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản bằng cách nảy chồi.
Nấm men không có diệp lục nên không có khả năng tự dưỡng mà phải sử dụng các nguồn dinh
dưỡng từ môi trường.
Trong tế bào nấm men có chứa hầu hết các chất cần thiết cho sự sống (protein, gluxit,
lipit, các enzym, các VTM, axit nucleic và các chất khoáng).
Nấm men được chú ý nhiều không chỉ vì giá trị dinh dưỡng mà còn vì khả năng tăng sinh
khối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp.
Giá trị dinh dưỡng của nấm men:
- Giàu protein và VTM đặc biệt là VTM nhóm B.
Trang 14

15. - Sinh khối nấm men chứa khoảng 20-25% chất khô, trong đó cacbon chiếm 45-50%, nitơ
7-10%, hydro 5-7%, oxy 25-30%, các nguyên tố vô cơ 5-10%, ngoài ra còn một số
nguyên tố vi lượng khác.
- Hàm lượng protein tùy thuộc vào từng chủng nấm men và thành phần, điều kiện nuôi
cấy dao động trong khoảng 40 - 60%.
- Protein của nấm men gần giống protein của động vật, chứa khoảng 20aa cần thiết, thành
phần aa của nấm men cân đối hơn so với lúa mì và các hạt ngũ cốc khác, kém chute ít so
với sữa và bột cá, bột xương thịt và các sản phẩm động vật nói chung.
- Các chủng nấm men thường được sử dụng cho người và gia súc là: Endomyces vernalis,
Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Turolopsis utilis, Monilia candia…
- Các chủng nấm men dùng để sản xuất protein từ các nguồn hydrat cacbon cần có các
tiêu chuẩn sau:
+ Có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khac nhau
+ Có thể phát triển tốt trên môi trường có nồng độ chất khử cao
+ Có khả năng phát triển nhanh, có sức đề khàng cao đối với nồng độ CO2
+ Sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao, có nhiều aa
không thay thế, có nhiều VTM quý…)
+ Kích thước tế bào tương đối lớn để dễ dàng tách bằng ly tâm
+ Chịu được nhiệt độ cao, ít làm biến đổi pH môi trường.
+ Trong sản xuất công nghiệp các giống nấm men thường được sử dụng là
Saccharomyces, Candida, và Turolopsis vì khả năng chuyển hóa của 3 chủng này rất cao
và đa dạng, quy trình công nghệ tương đối đơn giản.
3. Vi khuẩn
Vi khuẩn để sản xuất protein thường được nuôi trên cacbua hydro. Các giống thường
được sử dụng là: Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium và Nocardia.
Các giống vi khuẩn này có khả năng đồng hóa các ankal (C6 – C18), cacbua hydro béo
và thơn khác.
Đối với nguyên liệu là metan, sử dụng giống Methylamonas, Methyllococens capsulatus.
Đặc điểm của các chủng vi khuẩn này:
Trang 15

16. - Tốc độ sinh trưởng nhanh
- Sử dụng được nhiều loại cơ chất
- pH luôn giữ ở 5-7 để tránh nguy cơ nhiễm các vi khuẩn gây bệnh
- Thành phần các aa cân đối
- Khi dùng các vi khuẩn Gram âm để sản xuất protein cần lưu ý khả năng sinh độc tố của
chúng.
4. Nấm mốc và xạ khuẩn
Nói chung nấm mốc và xạ khuẩn ít được dùng để sản xuất protein. Về mặt dinh dưỡng
protein của các VSV này kém hơn của tảo, nấm men và vi khuẩn. Về mặt kỹ thuật do hệ sợi phát
triển thành từng búi nên rất khó khăn cho quá trình khuấy trộn và sục khí.
Nấm mốc là những cơ thể đa bào giàu VTM nhóm B, chứa khoảng 30-60% protein, hàm
lượng methionin và tryptophan thấp, có các aa khác tương tự tiêu chuẩn của FAO. Các giống
nấm mốc có hàm lượng protein cao là: Fusarium, Rhizopus, Penicillium, Apspegillus.
Cho đến nay xạ khuẩn chưa được dùng trong sản xuất protein. Tuy vậy người ta vẫn
thường thu hệ sợi của xạ khuẩn và nấm mốc trong quá trình sản xuất thuốc kháng sinh
(Penicillium), các enzym và axit xitric… dưới dạng sản phẩm phụ của nhà máy nhằm sử dụng
protein, VTM, enzym trong đó vào các mục đích khác nhau. Nhược điểm của sinh khối xạ
khuẩn và nấm mốc thu theo phương pháp này là nhanh bị hư hỏng. Vì vậy phải chú ý khâu sấy
ngay sau khi tách sinh khối ra khỏi dây chuyền công nghệ. Trong công nghiệp kháng sinh người
ta có thể thu được từ sinh khối hệ sợi gần 17% các chất chứa nitơ trong số đó các chất chứa nitơ
đồng hóa khoảng 14%, gần 10% protein tiêu hóa, 2% chất béo, 2,5% chất xơ… để sử dụng trong
chăn nuôi.
CHƯƠNG IV: CÁC GIAI ĐOẠN CHÍNH CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN
SX PROTEIN, AXIT AMIN
1. Giống sản xuất
1.1. Tuyển chọn chủng
Trang 16

17. - Phân lập: Để chọn được giồng VSV thuần chủng bước đầu phải tiến hành phân lập từ tự
nhiên như đất, nước, không khí, các mô động, thực vật, các vật liệu vô cơ, hữu cơ đã bị phân
hủy ít nhiều.
- Tuyển chọn: Các chủng phân lập được gọi là chủng nguyên thủy, thường những chủng
này chưa đáp ứng được các yêu cầu cho sản xuất công nghiệp mà nó phải được tuyển chọn để
xác định các tính chất sinh lý, sinh hóa và các điều kiện lên men thích hợp để nó có hoạt tính cao
và thực hiện được một quá trình lên men có ý nghĩa kinh tế Mục đích cuối cùng của quá trình
phân lập và tuyển chọn là tìm được chủng giống tốt mang đi sản xuất trên quy mô công nghiệp
gọi là giống VSV công nghiệp. VSV công nghiệp phải đạt được các yêu cầu sau:
+ Có khả năng tạo thành sản phẩm với năng suất cao trong quá trình lên men.
+ Khả năng sử dụng nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền tức là trên những cơ chất này VSV vẫn
phát triển nhanh, sản sinh một lượng lớn sinh khối một cách ổn định.
+ Cùng với thời gian chủng sản xuất phải bảo toàn được các đặc tính sinh hóa ban đầu.
+ Không độc với người, động vật, thực vật, môi trường (nếu có thì phải rất thấp và mất
nhanh ở môi trường ngoài)
+ Chủng phải thuần khiết
+ Dễ tách khỏi môi trường khi xử lý, thu sản phẩm
+ Có khả năng tạo biến chủng với hoạt lực cao hơn
1.2. Bảo quản giống
1.2.1. Phương pháp cấy truyền định kỳ (giữ giống VSV trên môi trường thạch)
- Nguyên lý: Nuôi VSV trên môi trường thạch dinh dưỡng sau đó một thời gian lại cấy
truyền sang môi trường mới để đảm bảo luôn cung cấp dinh dưỡng cho VSV.
- Phương pháp này phải định kỳ cấy truyền trên môi trường mới, mất nhiều công sức,
thời gian và rất dễ dẫn đến thoái hóa giống hoặc mất hẳn tính chất ban đầu. Chất lượng môi
trường thạch dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng phát triển của VSV.
- Trong quá trình cấy truyền trên các môi trường giàu dinh dưỡng rất dễ bị nhiễm tạp vào
chủng giống làm giống bị giảm hoặc mất hẳn hoạt lực, khả năng sinh trưởng kém hoặc có thể bị
tiêu diệt hoàn toàn gây ra tình trang mất giống.
1.2.2. Giữ giống trên môi trường thách dưới lớp dầu khoáng
Trang 17

18. Giống được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng ở điều kiện tối ưu để thu được VSV
đang ở giai đoạn phát triển logarit hoặc thu được nhiều bào tử đã đạt tới thời kỳ chín (đối với
loại có bào tử). Những ống nghiệm đó được phủ một lớp dầu parafin dày khoảng 10mm. Lớp
dầu này làm cho nước không bị bay hơi nên nồng độ các chất hòa tan không thay đổi dẫn đến áp
lực thẩm thấu cũng không thay đổi, không gây ảnh hưởng đến đời sống của VSV. Mặt khác lớp
dầu chỉ cho phép oxy xủa không khí thấm rất chậm vào môi trường nên VSV trong môi trường
phát triển rất chậm nên khi cấy truyền chủng giống không kéo theo sự phá hủy chủng nguyên
thủy. Sau khi xử lý như trên chủng được giữ ở 5oC có thể bảo quản được nhiều năm.
1.2.3. Giữ giống trên môi trường đất, cát
Đây là phương pháp bảo quản bào tử trong cát khô. Cát sông, rử sạch, sấy khô, sàng qua
rây lỗ nhỏ ssể loại bỏ đất và rác bẩn. Có thể dùng HCl đặc để loại bảo các chất hữu cơ. Đổ axit
ngập cát, đun nóng ở 100oC rồi rửa bằng nước. Nếu chưa sạch axit thì phải trung hòa bằng kiềm
hoặc Na2CO3. Sau khi trung hòa rửa lại bằng nước. Sấy khô ở 120 oC trong 3 – 4 giờ. Chia cát
vào các ống nghiệm thủy tình đã sấy tiệt trùng ở 160 – 180 oC trong 2 – 3 giờ. Dùng que cấy cào
bào tử vào cát, lắc đều. Chỉ bảo quản các ống cáct chứa bào tử khô, không bị ướt, không bị vón
cục. Tiếp tục sấy khô trong các bình CaCl2 hoặc silicagen khoảng 1 tuần hoặc sấy ở 37oC trong 2
ngày. Đậy các ống giống này bằng nút bông tráng parafin và giữ ở nhiệt độ phòng hoặc 4 – 6 oC.
Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống cấy vào các ống thạch nghiêng sau đó
chọn lại và cấy truyền tiếp.
1.2.4. Phương pháp lạnh đông
Tiến hành làm lạnh các môi trường có giống phát triển và giữ ở nhiệt độ lạnh sâu (-15
đến -20oC), (-20 đến -30oC), (-30 ddeens -40oC) ... Trong qúa trình làm lạnh sâu tế bào VSV có
thể bị chết. Để khắc phục trạng thái này người ta phải tiến hànhnhũ hóa môi trường và chú ý tốc
độ làm lạnh. Trong quá trình lạnh đông cần chú ý các điểm sau:
- Trước khi làm lạnh cần nhũ hóa VSV
- Cho 1 – 2 % nhũ dịch VSV vào mỗi ống nghiệm để đảm bảo làmlạnh đều
- Khi làm lạnh tới -20oC hoặc thấp hơn phải giữ tốc độ làm lạnh không lớn hơn 1 –
2oC/phút.
Trang 18

19. - Giữ các chủng lạnh đông phải quy định thời gian cấy truyền. Ở -15 đến -20 oC: 6 tháng,
ở -30oC: 6 – 9 tháng, ở -40oC: 1 năm, ở -50 đến -60oC: 3 năm.
- Khi làm tan băng để phục hồi giống cần phải rất nhanh bằng cách đặt ống giống trong
nồi cách thủy 37oC. Không nên làm đông lạnh hoặc làm tan băng quá nhiều lần vì nó làm giảm
khả năng sống của chủng đã bảo quản. Để tăng khả năng sông sót của chunge bảo quản, trong
quá trình thao tác người ta thêm những keo bảo vệ và các hỗn dịch như sữa, huyết thanh, lòng
trắng trứng, pepton, muxin hay các loại đường.
1.2.5. Phương pháp đông khô
Bảo quản đông khô: làm mất hơi nước của môi trường nuôi cấy. Thường VSV được nuôi
trên môi trường lỏng, sau đó đưa vào thiết bị đông khô làm mất dần hơi nước của môi trường.
Quá trình diễn ra cho đến khi toàn bộ môi trường chứa VSV tạo thành rạng bột khô thì mang đi
bảo quản trong tủ lạnh từ -20 đến -80oC. Đây là phương pháp tốt nhất bảo quản được rất lâu mà
không làm chết VSV.
1.2.6. Bảo quản siêu lạnh
Giữ giống trong hydro lỏng, nitơ lỏng (hay sử dụng bảo quản tế bào động, thực vật)
1.3. Nhân giống
Mục đích của quá trình này là đủ giống cho sản xuất (cả về lượng và chất), giống phải có
hoạt tính, khỏ mạnh, thuần khiết và có đúng thời điểm ta cần.
Các bước nhân giống thường qua 3 giai đoạn:
- Giống bảo quản được mang nhân trong ống nghiệm. Đây là giai đoạn phục hồi lại
giống, yêu cầu môi trường thuần khiết để giống có thể hoạt động trao đổi chất tốt nhất.
- Nhân giống cấp 2: đây là giai đoạn trung gian, giống làm quen dần với môi trường sản
xuất và đạt được mức độ nhân nhanh.
- Nhân giống sản xuất: giống quen với môi trường sản xuất, số lượng và chất lượng giống
đảm bảo để khi đưa vào sản xuất rút ngắn tối đa làm quen mà đi ngay vào pha phát triển để rút
ngắn thời gian lên men đảm bảo chất lượng sản phẩm cũng như hiệu quả kinh tế.
Thường sử dụng tỉ lệ cấp giống 5 – 10%.
2. Chuẩn bị môi trường và thiết bị lên men
2.1. Môi trường
Trang 19

20. 2.1.1. Chuẩn bị môi trường
- Phải phù hợp với sự phát triển và yêu cầu sinh lý của chủng VSV. Môi trường phải có
đầy đủ các nguồn thức ăn: C, N, K, S, P, các nguyên tố vi lượng, các chất kích thích sinh
trưởng ...
- Phải đảm bảo các chỉ tiêu về kinh tế
- Đảm bảo cho sự phát triển ổn định của chủng (vô khuẩn)
- Tùy thuộc môi trường lên men rắn hay lỏng, thành phần môi trường lên men mà tiến
hành pha chế môi trường sao cho phù hợp với từng loại VSV.
2.1.2. Thanh trùng môi trường
Có một số phương pháp thanh trùng môi trường như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụng
tia năng lượng (cực tím) khả năng đâm xuyên kém nên khi gặp môi trường huyền phù khả năng
bị hạn chế, sử dụng nhiệt độ cao và phương pháp lọc. Thông thường người ta hay sử dụng 2
phương pháp cuối.
- Phương pháp nhiệt độ cao:
+ Phương pháp gián đoạn: 110 – 121 oC (chủ yếu ở 121oC) trong 15 phút, Pa = 1 at, gia
nhiệt từng giai đoạn. Thường sử dụng cho thể tích nhỏ.
+ Phương pháp liên tục: 137 – 145oC, Pa = 5 – 6 at trong 3 – 5 phút, có ưu điểm tiết kiệm
thời gian, bảo đảm được tính chất của sản phẩm do giảm thời gian tiếp xúc với nhiệt độ cao, có
thể tự động hóa và độ thuần nhất của môi trường cao. Sử dụng cho thể tích lớn.
Khi thanh trùng ở nhiệt độ cao chất lượng môi trường bị biến đổi như: làm biến tính
protein và ức chế enzym, phá hủy một số VTM và một số tác nhân khác, trong quá trình gia
nhiệt kéo theo sự trùng hợp của một số thành phần làm môi trường có màu nâu (do caramen hóa
các loại đường, oxi hóa các fenol và VTM C, trùng hợp các aldehyt chưa no, phản ứng giữa
nhóm aldehyt của đường và nhóm amin của aa trong các peptit và protein nên người ta có xu
hướng thanh trùng riêng rẽ sau đó phối trộn lại sau.
2.2. Thiết bị lên men
Thiết bị lên men gồm thùng lên men (hoặc phòng nuôi) và các thiết bị phụ trợ. Trước khi
lên men tất cả đều phải được khử khuẩn với tiêu chuẩn phụ thuộc vào yêu cầu sản xuất và yêu
cầu công nghệ.
Trang 20

21. * Phòng nuôi: Sử dụng hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn mạnh như CaCl 2, ... đặc biệt các
phương pháp có khả năng bay hơi như phương pháp xông hơi (ethylen dioxit), đối với những
phòng nuôi hẹp có thể xử lý bằng tia tử ngoại (trong điều kiện công nghiệp không thể sử dung
phương pháp này).
* Các thiết bị lên men:
- Các quá trình lên men đòi hỏi rất nghiêm ngặt độ vô khuẩn, số VK < 10 -3 đến 10-4
TB/ml. Thường sử dụng hơi quá nhiệt 3 – 4 at, 2- 3 giờ.
- Các quá trình lên men không đòi hỏi quá nghiêm ngặt người ta có thể sử dụng 2 phương
pháp:
+ Các chất có khả năng oxi hóa + các chất sát khuẩn (CIP-Thanh trùng tại chỗ) tiến hành
như sau: Rửa nước, khô, rửa bằng axit hoặc bazơ 2,5 – 4%, 70 oC, 25 – 30 phút, khô 5 phút, rử
lại bằng axit 2 – 4%, khô tự nhiên, tráng lại bằng nước để chảy tự nhiên, rử bằng chất sát khuẩn,
để khô, sử dụng
+ Phương pháp xông hơi: đốt lưu huỳnh tạo ra hơi SO2
* Thiết bị phụ trợ: Khi thanh trùng các thiết bị phụ trợ cũng phải đạt chất lượng tương
ứng với thiết bị lên men. Vô khuẩn các thiết bị này khó hơn thùng lên men vì vậy người ta
thường sử dung kết hợp phương pháp xông hơi và hơi quá nhiệt.
2.3. Khử khuẩn không khí
Do hàm lượng oxi trong không khí và nước rất thấp mà hàm lượng oxi cần cung cấp cho
VSV rất nhiều nên cần sục một lượng không khí rất lớn cho quá trình lên men. Vì vậy phải tiến
hành khử khuẩn không khí để sử dụng. Người ta thường dùng phương pháp nén cao áp bằng nén
2 cấp đoạn nhiệt với áp suất 8 – 9 at/210 – 230 oC/2-3 giây. Với phương pháp này hầu như tất cả
VSV bị tiêu diệt nhưng sau đó chứa vào thùng chứa nên khi sử dụng phải kết hợp lọc bằng các
vật liệu lọc tạo ra những khe hẹp (mao quản) chịu rất nhiều tác đọng khác nhau nếu giữ được
VSV gọi là cơ chế chắn cản. Trong công nghiệp thường dùng bông thủy tinh (đường kính sợi 5
– 10 µm) hoặc sứ xốp (đường kính sợi > 10 µm). Nếu quãng đường đi đủ lớn (700 – 1000 mm)
và vận tốc nhỏ (<200 m/s) có khả năng chắn cản hầu hết VSV. Ngoài ra người ta còn có thể sử
dụng đồng xốp hoặc vật liệu siêu lọc (giá thành đắt) nên chỉ sử dụng được cho thiết bị lên men
nhỏ. Điều cần chú ý là các vật liệu lọc phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nên không được phép
Trang 21

22. để phên lọc bị ẩm, nếu ẩm sẽ bị bết khối lọc dẫn đến phá hỏng phên lọc tạo ra những dòng chảy.
Vì vậy nếu xảy ra hiện tượng giảm áp đột ngột phải thay toàn bộ thiết bị lọc.
3. Quá trình lên men
Là giai đoạn nuôi VSV tạo sinh khối, đây là giai đoạn quyết định hiệu quả của cả quá
trình sản xuất.
3.1. Lên men bề mặt
- Phương pháp lên men bề mặt: là phương pháp nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường
lỏng hoặc rắn
+ Thiết bị lên men là những khay dày 2-5 cm (tăng diện tích bề mặt)
+ Vi sinh vật hiếu khí (môi trường lỏng), VSV hiếu khí hoặc kỵ khí (MT rắn)
+ Môi trường lỏng là những nguồn dinh dưỡng khác nhau phù hợp với từng loài VSV
(dịch đường hóa, nước bã rượu, dịch kiềm sunfit, bổ sung các muối khoáng...). Môi trường rắn
thường là các loại hạt như gạo, đậu tương, mảnh sắn, ngô, bã mía, bã rượu, trấu, rơm... Đối với
môi trường rắn yêu cầu độ ẩm 55-70%, chiều dày môi trường 2-3cm, có hệ thống quạt thổi khí
vô trùng. Buồng lên men cần điều hòa không khí, làm ẩm và loại CO2.
+ Ưu điểm: Đơn giản, dễ loại bỏ phần nhiễm cục bộ, ít tốn kém đầu tư thiết bị
+ Nhược điểm: Tốn diện tích nhà xưởng, tốn nhân công, khó cơ giới hóa, tự động hóa,
hiệu suất thấp.
3.2. Lên men chìm
- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trên môi trường dịch thể, chúng phát triển
theo chiều sâu môi trường.
+ Sử dụng cho VSV hiếu khí và kỵ khí
+ Trong quá trình lên men phải khuấy đảo và sục khí (đối với VSV hiếu khí) nhằm tăng
cường diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng, ngăn cản sự kết lắng của tế bào.
+ Trong quá trình lên men phải theo dõi sự tạo bọt khi tiến hành khuấy và sục khí mạnh
sẽ tạo nhiều bọt có khuynh hướng trào ra ngoài gây hỏng thiết bị và nhiễm VSV ko mong muốn
cho quá trình lên men. Bọt còn cản trở sự tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng.
Thường sử dụng các loại dầu thực vật để phá bọt. Trong quá trình lên men luôn phải theo dõi và
điều chỉnh pH, nhiệt độ của thùng lên men.
Trang 22

23. + Ưu điểm: Hiệu suất cao, ít tốn diện tích, dễ cơ giới hóa, ít tốn nhân công.
+ Nhược điểm: Đòi hỏi đầu tư thiết bị chất lượng cao, dễ bị nhiễm hàng loạt, đòi hỏi đảm
bảo vo trùng nghiêm ngặt, cần sục khí liên tục nên tốn năng lượng, tốn nhiều hơi vô trùng thiết
bị, cần nguồn nhân lực có trình độ cao.
4. Quá trình lên men chìm
4.1. Lên men gián đoạn
- Ưu điểm: Thông dụng, dễ vận hành và duy trì, giá thành lắp đặt thấp, sử dụng một môi
trường, khả năng nhiễm thấp.
- Nhược điểm: Thời gian làm quen lớn, hiệu suất thấp, giá thành cao, sản phẩm phụ ức chế
sản phẩm tạo thành, khó đáp ứng cấp oxy 1 cách tuyệt đối
2.2. Lên men liên tục
- Ưu điểm: Hiệu suất cao do bỏ qua được giai đoạn làm quen, giảm nhiều công vận hành,
môi trường duy trì ở tốc độ phát triển ổn định, phát triển cân bằng: thành phần môi trường
không đổi, hiệu suất ổn định.
- Nhược điểm: Khả năng bị nhiểm cao, đòi hỏi các thiết bị xác định nồng độ oxy, pH nhậy,
điều khiển quá trình khó.
2.3. Lên men bán liên tục (lên men 2 pha)
- Pha 1: Sinh trưởng và phát triển
+ Giai đoạn 1: Tiềm ẩn
+ Giai đoạn 2: Thích ứng
+ Giai đoạn 3: Phát triển lũy tiến
Pha 2: Tích tụ sản phẩm trao đổi chất
+ Giai đoạn 4: Phát triển chậm dần
+ Giai đoạn 5: Cân bằng
+ Giai đoạn 6: Suy thoái (ở giai đoạn này VSV tự phân (chết) ảnh hưởng đến kết quả quá
trình thu sản phẩm
Để quá trình lên men xảy ra nhanh cần làm tăng vận tốc giai đoạn 1 và 2 bằng cách đảm
bảo khả năng sẵn sàng sinh trưởng, sinh sản, phát triển và đảm bảo điều kiện môi trường dinh
Trang 23

24. dưỡng pH, nhiệt độ, nồng độ chất tan. VSV đưa vào lên men phải ở giai đoạn lũy tiến của pha
nhân giống. Đồng thời kéo dài gian đoạn 3 bằng cách bổ sung thường xuyên chất dinh dưỡng
(lên men liên tục).
5. Khuấy trộn, sục khí
Trong quá trình lên men hiếu khí nhất thiết phải có khuấy trộn và sục khí giúp trao đổi
nhiệt, cấp oxi và tạo sự tiếp xúc tốt giữa VSV và nguồn thức ăn. Khi khuấy tạo đối lưu cưỡng
bức giúp quá trình trao đổi nhiệt tốt hơn
Khi dùng cách khuấy nghiêng ngoài dòng tiếp tuyến còn có dòng hướng trục cắt nhau tạo
chảy rối nên tăng cường tiếp xúc pha và trao đổi nhiệt. Thời gian trao đổi nhiệt ngắn dẫn đến
năng suất và hiệu suất sử dụng thiết bị tăng, tăng cường tiếp xúc pha tức là các enzym α, β, γ –
amilase hòa tan trong nước tiếp xúc với cơ chất mạnh, đồng thời VSV cũng tiếp xúc rất tốt với
nguồn thức ăn.
Đối với sinh khối người ta lại dùng khuấy tuốc bin, dòng chính là dòng hướng tâm, dòng
phụ là dòng hướng trục, lưu lượng của 2 dòng bằng nhau. Do sinh khối luôn cần một lượng oxi
mà khuấy cánh khả năng khuếch tán oxi kém trong khi khuấy tuốc bin khi chất lỏng văng ra áp
suất bên trong thấp, khí đi vào rất dễ hòa tan với nhau. Chiều cao của thiết bị sinh khối rất cao
nên dễ bị hỏng trục. Khuấy tuốc bin rất mạnh và dễ dàng làm nhiều tầng khuấy. Ngoài ra, chất
khí có xu hướng đi từ dưới lên nếu khuấy cánh khí sẽ đi thẳng lên trên nhưng nếu dùng khuấy
tuốc bin nhiều tầng thì tầng này sẽ hút khí của tầng dưới nó. Tuy nhiên khuấy tuốc bin có nhược
điểm là nếu khuấy quá mạnh dịch lên men sẽ trào ra ngoài hết nên phải tính toán tốc độ khuấy
sao cho phù hợp với từng thiết bị lên men khác nhau.
Trong quá trình lên men tạo sinh khối luôn cần sục khí do khi VSV phát triển thì thức ăn
xung quanh nó giảm mà dinh dưỡng phải khuếch tán vào tự nhiên rất chậm nên phải tạo chảy rối
để tế bào VSv di chuyển để tiếp xúc pha. Bọt khí chỉ chảy từ dưới lên trên tạo chảy rối, tạo
đường đi rích rắc nên tiếp xúc tốt hơn, các chất dinh dưỡng hòa tan nhanh hơn.
5. Kiểm tra và giám sát quá trình lên men
Trong quá trình lên men cần kiểm tra, giám sát các chỉ tiêu sau:
- Cường độ khuấy
- Cấp khí:nồng độ oxi, nhiệt lượng Q của quá trình cấp khí
Trang 24

25. - Giám sát quá trình tạo bọt: Nếu lượng bọt tăng thể tích hiệu dụng của thiết bị giảm gây
tràn làm tổn hao và bịt kín hệ thống làm tắc đường ống và tạo cầu nối từ bên ngoài vào bên
trong nên rất dễ bị nhiễm. Giải pháp khống chế là dùng dầu phá bọt (thường sử dụng các loại
dầu thực vật), có thể giảm cường độ khuấy hoặc chọn chủng không phụ thuộc nghiêm ngặt vào
nồng độ oxi. Chất phá bọt là chất không tham gia quá trình lên men, không đưavào lượng dư vì
sẽ ức chế chủng và làm thay đổi quá trình lên men. Đồng thời nếu đưa dư lượng dầu phá bọt thì
quá trình tinh chế sẽ vô cùng phức tạp.
- Thể tích lên men (phụ thuộc vào nồng độ thông khí)
- Thành phần dịch vào gồm tất cả các cấu tử, kiểm tra nồng độ vf sự biến thiên nồng độ
oxi, CO2, pH, thế oxi hóa khử.
- Kiểm tra đầu ra: sản phẩm, thành phần của khí thải ...
6. Chiết tách, tinh chế các sản phẩm lên men
Hòa tan protein trong dung dịch:
Khả năng hòa tan protein trong dung dịch có thể được hỗ trợ bằng cách thay đổi các yếu
tố hóa học hoặc sử dụng enzym. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của enzym bao
gồm: lực ion, pH, nhiệt độ và nồng độ ion Ca 2+. Tại pI, protein trung hòa về điện tích nên độ hòa
tan của chúng nhỏ nhất. Để hòa tan thông thường giá trị pH được chọn là kiềm nhẹ do tại đó độ
hòa tan của protein lớn nhất và môi trường gần trung tính nên nguy cơ biến tính protein nhỏ
nhất. Lực ion thông thường được thay đổi tại pH trung tính hoặc xung quanh pI nhờ việc sử
dụng các muối tan. Tại các lực ion quá cao hoặc quá thấp độ tan của protein giảm. Việc hòa tan
protein nên thực hiện ở nhiệt độ thấp để giảm nguy cơ biến tính protein và nguy cơ mẫu bị phá
hủy bởi VSV. Tuy nhiên nếu protein cần tách có khả năng chịu nhiệt tốt thì nên chiết chúng ở
nhiệt độ cao để hạn chế các chất không mong muốn hòa tan trong dung dịch và nâng cao hiệu
quả thu nhận protein. Việc lựa chọn các yếu tố này luôn gắn liền với phương pháp thu nhận
protein tương ứng. Việc sử dụng các enzym trong quá trình hòa tan protein khá hạn chế do
enzym phá vỡ các liên kết ngoại phân tử của protein tạo ra sự hòa tan khá dễ của protein và
thường kèm theo việc hòa tan trong dung dịch nhiều hợp chất khác gây khó khăn cho quá trình
chiết tách sau này.
6.1. Tách protein:
Trang 25

26. - Kết tủa protein trong pha lỏng và tách kết tủa khỏi pha lỏng
+ Kết tủa nhờ muối: là phương pháp thông thường nhất trong các phương pháp kết tủa.
Thông thường nồng độ muối thấp làm tăng mức độ hòa tan protein do protein được bao bọc bởi
lớp vỏ ion trái dấu với muối, năng lượng tĩnh điện tự do của protein giảm, hoạt tính dung môi
tăng. Ngược lại khi tăng nồng độ muối làm giảm lực hydrat hóa các ion làm giảm độ hòa tan của
protein dẫn tới kết tủa protein. Ở cùng một nồng độ muối các protein khác nhau có độ hòa tan
khác nhau vì vậy với mỗi một protein phải sử dụng nồng độ muối khác nhau để kết tủa (phương
pháp kết tủa phân đoạn).
+ Kết tủa nhờ dung môi: Dung môi hữu cơ trung tính khi trộn lẫn với dung dịch enzym
làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, vì vậy làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử
protein làm các phân tử protein kết hợp lại tạo thành kết tủa. Cần chú ý dung môi là tác nhân
gây biến tính protein do chúng có ái lực với bề mặt kỵ nước của protein vì vậy cần giữ nồng độ
dung môi thấp. Các dung môi thường sử dụng là ethanol, aceton.
+ Kết tủa đẳng điện: Protein bị biến tính bởi các tác nhân như acid, nhiệt độ, ethanol... có
thể kết tủa hoàn toàn tại giá trị pI của chúng. Việc lựa chọn tác nhân biến tính protein cần tính
đến khả năng biến tính thuận nghịch hay không của protein cần thu nhận. Đặc biệt trong trường
hợp protein cần thu nhận là protein có hoạt tính sinh học, không áp dụng được các tác nhân biến
tính không thuận nghịch như nhiệt độ do sự biến tính làm mất hoạt tính của chúng.
+ Kết tủa bằng enzym: Các enzym có thể sử dụng kết tủa protein có khả năng tạo cầu
ngoại phân tử giữa chúng làm kết tụ các khối protein. (Ví dụ như enzym đông tụ sữa)
6.2. Tinh sạch protein
Dựa vào các tính chất của protein như tính phân ly đẳng điện, tính chất bề mặt (protein có
thể hấp thụ, hấp phụ trên các chất mang khác nhau nhờ đó protein có thể được phân tách nhờ sắc
ký ái lực), kích thước phân tử . Thông thường sử dụng các kỹ thuật sau:
6.3.1. Kỹ thuật lọc:
Protein là cao phân tử, do vậy các phương pháp phân tách protein sử dụng màng lọc phân
tử khá hữu hiệu. Tuy nhiên các phương pháp này chỉ sử dụng được đối với các nguồn protein
động vật trong dung dịch sinh lý như sữa, máu, huyết thanh mà không áp dụng được với các
protein thực vật do chúng thường nằm trong phức hợp polyme khác. Kỹ thuật này được thực
Trang 26

27. hiện nhờ một màng bán thấm hoặc màng lọc phân tử. Dung dịch protein được phân làm 2 pha,
một pha không đi qua màng lọc chứa các cao phân tử trong đó có protein, pha còn lại đi qua
màng lọc chứa các phân tử có kích thước nhỏ hơn như glucid đơn giản, peptid, muối...
6.3.2. Kỹ thuật sắc ký
Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích
hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định
lượng và định danh. Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là
sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi
ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của
phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích
thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid
chromagraphy).
- Sắc ký lọc gel: Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước
phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan
nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay
polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có
sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả
bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì
vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có
kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa;
còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng.
- Sắc ký trao đổi ion: Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có
mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm
pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký
trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định,
những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể,
nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là
sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại,
Trang 27

28. nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là
sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng
dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích
những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein
tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri
clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các
protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra
ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.
- Sắc ký ái lực: Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong
việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa
học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho
qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi
vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có
thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong
dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.
Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những
protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự ADN. Hỗn hợp
protein thấm qua cột có chứa những trình tự ADN đặc hiệu được gắn vào thể mang; những
protein có ái lực cao với trình tự ADN sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này,
yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài
ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng
nguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có
khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của
nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại
bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X
với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp
tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có
độ chuyên biệt cao.
Trang 28

29. - Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc
ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có
sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được
tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên
cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.
6.3. Đánh giá quá trình tinh sạch protein
Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt
tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các
protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di.
Một phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường. Hiện tượng này, được đặt
tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân tách protein và các đại phân tử khác
như ADN và ARN. Vận tốc di chuyển (v) của một protein (hay bất kỳ phân tử nào) trong điện
trường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực của protein (z) và hệ số ma sát (f)
Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi lực kéo của độ
nhớt fv tăng lên do sự ma sát giữa phân tử đang chuyển động với môi trường. Lực ma sát phụ
thuộc vào cả khối lượng, hình dạng của phân tử đang di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi trường.
Với một khối cầu có bán kính là r, ta có
Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel giống như
một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể
di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di
chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác
nhau. điện di được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòng
điện từ trên xuống
CHƯƠNG V: CNSX MỘT SỐ PROTEIN ĐƠN BÀO
1. CNSX protein nấm men từ rỉ đường
1.1. Giống nấm men
Nấm men bánh mì là một trong những sản phẩm lâu đời nhất của ngành công nghệ lên
men. Cho đến nay nấm men bánh mì vẫn là sản phẩm quan trọng của ngành công nghệ sinh học
Trang 29

30. cả về số lượng và chất lượng. Nấm men bánh mì thuộc họ Endomycetaceae, giống
Sacharomyces, loài cereviciae.
Sacharomyces cerevisiae là loài nấm men có hình cầu hay hình trứng, kích thước nhỏ từ
5 – 14 µm. Thành phần tế bào nấm men thường chứa 70 – 75% nước, còn lại là chất khô. Đây là
loài chủ yếu sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, trong quá trình sinh sản chồi mới phát triển từ
man mẹ khi có các điều kiện thích hợp, khi chồi đạt kích thước của men trưởng thành thì nó tách
ra khỏi nem mẹ để tạo thành một tế bào mới hoàn chỉnh.
Ngoài nấm men Sacharomyces cerevisiae thì hiện nay trên thế giới còn sử dụng phổ biến
2 loài nấm men nữa để sản xuất protein từ rỉ đường là Turolopsis utilis và Candida tropicalis.
Đặc điểm của nấm men dùng trong sản xuất:
- Tế bào lớn, có dạng hình cầu hay hình trứng
- Hoạt lực maltase: biểu thị thời gian 1g nấm men ép phóng thích ra 10 ml CO 2 khi lên
men 20 ml dung dịch đường maltose 5%: ≤ 70 phút.
- Hoạt lực làm dậy bột: biểu thị thời gian 5g nấm mrn ép làm nở khối bột 280g đến chiều
cao 1,5 cm theo khuôn có kích thước xác định: ≤ 45 phút.
- Bền vững với rỉ đường: chủng nấm men được đánh giá là bền vững với rỉ đường nếu
chúng tồn tại 6 – 7 thế hệ mà không bị chết trong môi trường có nồng độ rỉ đường cao.
- Khả năng sinh sản nhanh, ít bị thay đổi trong quá trình bảo quản.
- Có khả năng lên men được đường sacharose, glucose, maltose.
Có hàm lượng zimase và maltase cao (hoạt lực maltase và hoạt lực làm dậy bột nhanh).
- Sản lượng cao, sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao,
có nhiều aa không thay thế, có nhiều VTM quý…)
- Chịu được nhiệt độ cao, ít làm biến đổi pH môi trường.
1.2. Nguyên liệu
1.2.1. Rỉ đường
Rỉ đường là phế thải của nhà máy đường, được dùng làm nguồn nguyên liệu sản xuất trên
90% số lượng nấm men. Rỉ đường là phần không thể kết tinh sau khi đường saccaroza đã được
kết tinh. Có 2 loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Rỉ đường mía là chất lỏng màu đen
Trang 30

31. có độ nhớt cao, chiếm 3,5% lượng mía, được sử dụng nhiều (90% protein từ nấm men được sản
xuất bằng nguyên liệu rỉ đường) do:
- Giá thành rẻ
- Ngoài đường saccharoza, glucoza, fructoza rỉ đường còn chứa một số chất hữu cơ, vô
cơ và VTM có giá trị.
Thành phần của rỉ đường
Thành phần Rỉ đường mía Rỉ đường củ cải
Đường tổng (%) 48-56 48-52
Đường khử (%) 25-30 0,8-1
Các hợp chất hữu cơ không 9-12 12-17
phải đường (%)
Protein (%) 2-4 6-10
Kali (%) 1,5-5 2-7
Canxi (%) 0,4-0,8 0,1-0,5
Magie (%) 0,06 0,09
Phospho (%) 0,6-2 0,02-0,7
Biotin (mg/kg) 1-3 0,02-0,15
Axit pantothenic (mg/kg) 15-55 50-110
Inositol (mg/kg) 2.500-6.000 5.000-8.000
Thiamin (mg/kg) 1,8 1,3
Vi sinh vật trong rỉ đường:
- Nguy hiểm nhất là vi khuẩn lactic, axetic: độ nhiẽm được đánh giá bằng độ chua của
rỉ đường.
- Rỉ đường tự lên men sau 24 giờ có thể làm tăng độ axit lên 0,2-0,3 độ
- Trong 1g mật rỉ có chứa 100.000 VSV không có bào tử và 15.000 VSV có bào tử.
- Nếu mật rỉ loãng VSV có thể hoạt động, cần hạn chế nhiễm khuẩn để giảm tổn thất
Xử lý rỉ đường:
Mục đích: Loại bỏ tạp chất, tạp khuẩn, nâng cao độ thuần khiết (giảm 20% các tạp chất
phi đường, giảm 40-60% chất keo) và tạo pH thích hợp.
Pha loãng sơ bộ: Có thể pha loãng đến 55-60 độ Bx (tương ứng tỉ lệ khoảng 1:1 đến 1:4).
Hệ số pha loãng càng lớn càng dễ dàng loại cặn.
Trang 31

32. Có 3 phương pháp xử lý:
Phương pháp hóa học: dùng axit H2SO4 kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ chất
keo, đồng thời H2 SO4 còn liên kết với muối có trong rỉ đường cạnh tranh với axit hữu cơ làm
giảm một số muối bằng cách điều chỉnh pH xuống 3,5-5 rồi để lắng từ 4-8 giờ. Pha loãng rỉ
đường (0,73m3 nước cho 1 tấn rỉ đường), thêm CaCl2 (0,9 kg vôi/1 tấn rỉ đường), khuấy trộn
trong 30 phút, để yên 30 phút. Thêm 6 lít H 2SO4/1 tấn rỉ đường, tiếp tục khuấy 30 phút sau đó để
lắng từ 6 – 12 giờ. Dùng bơm hút dịch trong bên trên, thêm 1% vôi tôi (tính theo nồng độ rỉ
đường), khuấy đều, đun sôi 10 phút, để lắng 7 giờ, loại bỏ lớp màu đen ở đáy bồn, bơm phần
trên vào bồn chứa khác.
Phương pháp vật lý (gia nhiệt): phương pháp này tiết kiệm được axit nhưng tốn điện
năng. Sau khi pha loãng sơ bộ tiến hành thổi hơi nước để dịch sôi từ 0,5-1 giờ. Sau đó để lắng 4-
8 giờ rồi gạn lấy dịch đường trong. Chú ý thông thường sử dụng nhiệt độ 85-90 oC trong 45 phút
vì nếu xử lý ở nhiệt độ cao 120-130oC thì dễ tạo melenoidin
Phương pháp cơ học: Dùng máy ly tâm loại chất bẩn, chất keo có ưu điểm hơn phương
pháp hóa học về phương diện kinh tế và thời gian, giảm thất thoát so với phương pháp hóa học
khoảng gần 2% (từ 2% xuống còn 0,14%). Trước khi ly tâm pha loãng rỉ đường với nước theo tỉ
lệ 1:1, 1:2, 1:4 tùy thuộc thành phần muối canxi trong rỉ đường. Nếu lượng muối canxi trong rỉ
đường < 0,5% thì pha loãng 1:1, nếu bằng 0,6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4.
Xử lý rỉ đường xấu: Đối với rỉ đường xấu tùy yếu tố ảnh hưởng mà đưa ra các phương pháp xử
lý như sau:
Yếu tố ảnh hưởng Phương pháp và thời gian xử lý
Rỉ đường chứa vi Bổ sung chlotetracylin 1-5g/m3 dung dịch rỉ đường pha loãng để
khuẩn tạo acid nitric làm trong, thời gian 1 giờ
Rỉ đường có SO2 Bổ sung clo 11g/110g SO2 trong 1 giờ
Acid bay hơi cao Dùng H3PO4 thay vì H2SO4 để làm trong rỉ đường
Độ màu cao Pha loãng ít nhất 20 lần
Canxi cao ≥ 1% Pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:3, hạ pH đến 4,5, để lắng 4 giờ,
ly tâm loại tủa.
1.2.2. Một số nguyên liệu khác
Trang 32

33. - Sunphat amon (NH4)2SO4: Là nguồn đạm cho tế bào nấm men, chứa ít nhất 21% nitơ, độ ẩm
không quá 1,5%. Vì sunphat amon thường được sản xuất từ acid sunfuric có thể còn lẫn FeS và
Fe2(SO4)3 độc đối với tế bào nấm men nên trước khi đưa vào sản xuất thì để trong không khí khô
4 giờ.
- Dung dịch amoniac: Dùng để chỉnh pH và cung cấp nguồn nitơ cho nấm men (chứa 25%
nitơ)
- Axid phosphoric: Cung cấp nguồn phospho, nồng độ không ít hơn 70%, có thể thay thế DAP
(chứa P2O5 hơn 50,5%)
- MgSO4: Loại kỹ thuật, dễ tan trong nước, lượng MgO < 16,3%
- H2SO4: Dùng để acid hóa môi trường
- Các hóa chất chống nhiễm: CaCl2, formalin, NaOH Để khử trùng thiết bị và đường ống
- Nước: Nước dùng để nuôi nấm men thường là nước mềm, sạch, trong, không màu, không mùi
hàm lượng các muối không cao hơn Cl - = 0,5, SO42- = 80, As = 0,05, Pb = 0,1, Zn = 5, Cu = 3,
FeO = 3.
- Dầu phá bọt: Có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt dung dịch. Có thể dùng acid oleic, dầu
lạc, dầu cám, dầu thầu dầu nồng độ 0,005 – 0,01%.
- Không khí: Lượng không khí dùng trong các nhà máy sản xuất nấm men rất lớn. Tuy nhiên
cần làm sạch không khí trước khi đưa vào sản xuất.
1.3. Qui trình công nghệ
Trang 33

34. Rỉ đường
Thùng tạm chứa Pha loãng
Axit hóa = H2SO4,
60oC, pH = 4,5-4,8
Thanh trùng
Các muối
vô cơ Môi trường dinh dưỡng Men giống
Oxi Nuôi thu sinh khối Nhân giống
Ly tâm Xử lý Thải bỏ
Sữa men đặc
Sấy khô
Thành phẩm
1.3.1. Nhân giống nấm men
- Giai đoạn phòng thí nghiệm: tỉ lệ 1:10, từ 4 ống nghiệm giống hòa ra 100ml môi
trường, rồi tiếp tục từ 100ml lại được nuôi trong 1 lít môi trường nước chiết malt 12%
đã khử trùng 20 phút, 0,5 at. Thời gian 18-24 giờ mỗi cấp, nhiệt độ 28-30oC.
- Giai đoạn nhân giống nhỏ trong phân xưởng: tỉ lệ 1:6 (5L đến 30L rồi đến 180L), thời
gian 14-18 giờ mỗi cấp, nhiệt độ 28-30 oC, môi trường là 50% rỉ đường 12%, 50%
mước chiết malt 12%
Trang 34

35. - Giai đoạn nhân giống sản xuất: Môi trường là rỉ đường nồng độ 12% có bổ sung muối
khoáng, thể tích các thùng lên men có thể lên tới 3-4 m 3, tỉ lệ tiếp giống là 1:10, trong
quá trình nhân giống cần thổi khí liên tục, nếu qui mô sản xuất lớn có thể chuyển tiếp
sang thùng nhân giống 12-15m3, thời gian mỗi cấp là 12-14 giờ.
Đánh giá tiêu chuẩn: trong giai đoạn nhân giống nấm men từ phòng thí nghiệm đến 180L
cần đạt:
- Không nhiễm nấm men dại, vi khuẩn
- Tế bào đồng nhất: không nhỏ, không lớn
- Lực nở bột: 45 - 50 phút
- Hoạt lực zymase: nhỏ hơn 45 phút
- Hoạt lực maltase: nhỏ hơn 60 phút
Xác định lực nở bột: xác định lực α-glucosidase (maltase) và zymase. Hoạt lực zymase
biểu thị tốc độ lên men đường glucose và saccarose còn hoạt lực maltase biểu thị tốc độ
lên men đường maltose của nấm men.
Tiêu chuẩn giai đoạn nhân giống sản xuất: nấm men cần đạt yêu cầu hình tròn, ovan đều,
hàm lượng nitơ 2,2-2,4%, phospho 0,9-1,1%, lực nở bột: 45-50 phút, hoạt lực maltase ít hơn 60
phút, hệ số sinh sản 0,11-0,14.
1.3.2. Môi trường dinh dưỡng:
- Nồng độ rỉ đường: 10-12%
- (NH4)2SO4: 0,1-0,3%
- Ure: 0,1-0,15%
- (NH4)2HPO4: 0,1%
- MgSO4: 0,05%
- pH: 4,2-5,5
Thanh trùng: Môi trường sau khi được xử lý được bổ sung các muối vô cơ để tạo môi trường
lên men rồi thanh trùng ở 121oC/1atm/phút.
1.3.3. Nuôi thu sinh khối
Trang 35

36. Thể tích môi trường lên men khoảng 100m 3, thời gian lên men từ 12-20 giờ tạo ra được
20-30 tấn nấm men tươi, nhiệt độ 28-30oC, hệ số sinh sản: 0,15-0,16, mật độ tế bào 60-100g/l,
hiệu suất 75-95%, có thể lên men liên tục hoặc gián đoạn.
1.3.4. Quá trình men lắng
Quá trình men lắng: quá trình này rất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng thương phẩm,
trong quá trình lắng không còn chất dinh dưỡng trong môi trường, hệ enzym trong nấm men
chuyển từ quá trình sinh tổng hợp sang quá trình trao đổi chất nhằm duy trì các chức năng bình
thường của tế bào. Trong quá trình này còn tế bào non đang nảy chồi, tỉ lệ giữa số tế bào non và
tế bào trưởng thành tùy thuộc vào qui trình kỹ thuật và môi trường dinh dưỡng lúc đầu. Số tế
bào trưởng thành càng cao thì nấm men thành phẩm càng giữ được chất lượng tốt. Điều kiện
lắng tốt nhất là 27oC, giảm lượng không khí 40 – 60% so với giai đoạn nuôi chính, thời gian
lắng 1,5 – 2 giờ.
1.3.5. Thu sản phẩm
- Ly tâm sau men lắng: Bơm dịch lên men vào máy ly tâm, thời gian ly tâm càng nhanh càng tốt
(không quá 2 giờ), rửa nấm men bằng nước lạnh 2oC thu được sinh khối nấm men.
- Lọc ép, quạt khô: Sau khi ly tâm, thu nấm men và đưa vào thiết bị lọc chân không hoặc lọc ép.
Nấm men được giữ lại trên tấm vải lọc có độ ẩm 75%. Nếu lọc ép hiệu quả thì không cần quá
trình quạt khô, nếu lọc ép không hiệu quá thì có thể sử dụng quạt gió để xử lý tiếp 0,5 – 1 giờ.
- Tạo hình, đóng gói men ép: Ở các nước giai đoạn này được thực hiện bằng máy và có bổ sung
dầu thực vật 0,1% và lơxitin để đảm bảo độ chắc và màu cho sản phẩm ép bằng máy. Men ép
được bảo quản ở 2-4oC. Khâu tạo hình, đóng gói men thực hiện càng nhanh càng tốt vì trong
điều kiện nhiệt độ thường tế bào nấm men đang ở trạng thái nghỉ có thể tiếp tục hoạt động ảnh
hưởng đến chất lượng nấm men hoặc sinh khối nấm men bị nhiễm khuẩn tạo những chất độc và
làm giảm hàm lượng dinh dưỡng của nấm men. Ở nước ta giai đoạn này vẫn chủ yếu được thực
hiện thủ công nên ít nhiều cũng ảnh hưởng đến chất lượng nấm men.
Quá trình sấy khô được chia làm 3 giai đoạn
Gđ1: Tách nước ở bên ngoài tế bào, quá trình diễn ra nhanh cho đến khi độ ẩm còn 52-
53%. Lực nở của nấm men không đổi, không có tế bào chết nếu nhiệt độ sấy thấp hơn 38 oC.
Trang 36

37. Gđ2: Tách nước ở bên trong tế bào, cần nhiều thời gian hơn so với giai đoạn trên. Tốc độ
sấy trong giai đoạn này giảm, độ ẩm cuối giai đoạn đạt 16-20%
Gđ3: Tách nước liên kết, khó tách nên cần nhiều thời gian, độ ẩm đạt 7-8%
Có 2 phương pháp sấy:
Sấy liên tục: thời gian 2-4 giờ, nhiệt độ không khí 42, 37, 32, 28 oC, tốc độ sấy phụ thuộc
nhiệt độ. Thường nhiệt độ đầu vào là 50oC, nhiệt độ đầu ra là 35oC.
Sấy thùng quay: thời gian 10-20 giờ, tốc độ 4 vòng/phút, vận tốc không khí 1,5-
2,5m/giây, nhiệt độ không khí 50-60oC trong 6-7 giờ, độ ẩm còn 15-22%, nhiệt độ không khí
40oC 1,5-3,0 giờ, độ ẩm còn 7-8%.
Đánh giá chất lượng men khô:
- Độ ẩm: không quá 8 %
- Lực nở bột: không quá 75 phút
- Độ axit: ngày đầu sản xuất nhỏ hơn 120mg, sau 12 ngày nhỏ hơn 360 mg
- Hoạt lực maltase: nhỏ hơn 100 phút (loại tốt), nhỏ hơn 160 phút (loại trung bình)
- Hoạt lực zymase: nhỏ hơn 60 phút (loại tốt), nhỏ hơn 80 phút (loại trung bình).
1.3.6. Yêu cầu thành phẩm
Màu sắc: xám sáng, trứng sữa cho đến nâu tối
Mùi vị: Đặc trưng của nấm men, không có mùi lạ
Có đầy đủ các VTM: B1 ≥ 10 mg/kg, B2 ≥ 30 mg/kg, B3 ≥ 300 mg/kg
Tỷ lệ tiêu hóa protein ≥ 75 – 80%
Giá trị sinh học của protein ≥ 55%
Thành phần Hàm lượng (% chất khô)
Protein 50
Lipid 6
Độ ẩm 8
Các acid amin không thay thế Hàm lượng (% protein tổng)
Lysine 8,2
Valin 5,5
Trang 37

38. Leuxin 7,9
Isoleuxin 5,5
Threonine 4,8
Methionine 2,5
Phenylalanine 4,5
Tryptophan 1,2
Histidine 4,0
Arginine 5,0
1.4. Ứng dụng
• Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
• Ứng dụng trong y học
• Ứng dụng trong mỹ phẩm
2. CNSX protein từ dịch thủy phân các nguyên liệu thực vật và dịch kiềm sunfit
2.1. Các nguồn nguyên liệu
- Các loại thực vật như rơm, rạ, bã mía, lõi ngô, trấu ... sử dụng axit H 2SO4 0,4 – 0,6%
cho đến 5% hoặc enzym cellulase để thủy phân. Trong môi trường axit có khả năng
thủy phân tốt cellulose và hemicellulose.
- Dịch kiềm sunfit thu được từ các nhà máy sản xuất giấy. Cứ 5 tấn bột cellulose dùng
để sản xuất giấy thải ra lượng dịch có chứa 180 kg đường, trong đó chủ yếu là đường
pentose là loại đường chỉ nấm men mới chuyển hóa tốt..
- Nước chiết ngô, ngước chiết lúa mì, nước chiết từ bã khoai tây thu được từ các nhà
máy sản xuất tinh bột ...
2.2. Nguồn vi sinh vật được sử dụng
Từ dịch thủy phân nguyên liệu thực vật: candida utilis, candida tropicalis, candida
scotti, candida humicola. Từ dịch kiềm sunfit: candida utilis, candida tropicalis. Đây là những
chủng nấm men có khả năng lên men được nhiều loại đường đặc biệt là có khả năng lên men tốt
đường pentose có nhiều trong dịch kiềm sunfit. Ít sử dụng nấm men S. cerevisiae vì loài này
không có khả năng lên men đường pentose như các loài Candida.
2.3. Quy trình sản xuất nấm men từ dịch thủy phân nguyên liệu thực vật và dịch kiềm
sunfit
Trang 38

39. Nguyên liệu, nghiền
Nước + H2SO4 (0,5-
Bột xenlulo
0,6%)
Fucfurol và
các chất bay Thủy phân Hơi nóng
hơi khác (179-190oC), áp
suất 9-13kg/cm3
Dịch thủy phân,
Trung hòa=Ca(OH)2
Lọc và làm sạch Tách CaSO4
Làm nguội (30-32oC)
KCl, super
phosphat,
(NH4)2SO4, Lên men sinh khối Men giống cấp III
dầu phá bọt,
chất điều
chỉnh pH Tách sinh khối Sấy
Đóng gói, thành phẩm Nghiền
• Muốn thu được dịch thủy phân cần xử lý cơ học (nghiền, xay, cắt, loại bỏ tạp chất). Thủy
phân ở nhiệt độ 179-190oC, chiều cao thùng 2-3m. Quá trình thủy phân diễn ra trong một
thời gian dài sau đó chuyển sang thiết bị khác, chuyển đường nghịch đảo (nhiệt độ 100 –
105oC) bằng enzym investasse và sacharase. Sau quá trình chuyển đường nghịch đảo,
lượng đường đơn có thể tăng 5-10%, dịch này có thành phần chủ yếu là hexose (70-80%)
và pentose (20-30%), ngoài ra còn có khoảng 5% các axit hữu cơ, fucfurol, oxymethyl
fucfurol là 2 thành phần không có lợi cho quá trình lên men nên phải loại bỏ. Sau khi
thủy phân thường có pH axit nên sử dụng nước vôi, nước amoniac để trung hòa và cung
cấp nitơ. Sau khi trung hòa nhiệt độ khoảng 80 – 85 oC có chứa nhiều thành phần lơ lửng
và tạo kết tủa. Vì vậy phải loại tủa bằng cách lắng xoáy. Thông thường sau khi loại tủa
Trang 39