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Métodos de
medición
analítica en
Bioquímica
Clínica
Bioquímica
 “Ciencia

que
estudia las bases
químicas de la
vida”

Pilar fundamental de la biotecnología, y se ha
consolidado como una disciplina esencial para
abordar los grandes problemas y enfermedades
actuales y del futuro
Utilidad
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Fase Analítica
Comprende:
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analíticas

Procedimientos de análisis basados en el
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Métodos+de+medición+analítica+en+bioquímica+clínica
Método químico
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Los bioelementos poseen una capacidad para
emitir y absorber luz de una determinada
longitud, siendo la longitud de onda de
emisión característica de cada elemento.

Requieren de la utilización
de alguna característica
diferencial
Métodos físicos
Compuestos bioquímicos, es
que son muy parecidos en
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polaridad
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Métodos separativos

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No todas la proteínas poseen
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mas sensibles q técnicas colorimétricas
normales.
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en suspensión sufre una serie de fenómenos:
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DISPERSIÓN de la luz depende de
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


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tiempo determinado y a una temperatura
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reacción, de tal forma que la sustancia que
buscamos debe consumirse totalmente. Si no
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midiendo menos cantidad de la que realmente
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 Métodos

cinéticos

En ellos se mide la velocidad de la reacción
mediante la medida de la variación de la
Absorbancia en el tiempo y esto se relaciona
con la concentración. Es una medición
continua, a diferencia de la del punto final, se
mide en tiempos regulares. Se puede medir la
cantidad de sustrato no transformado ó la
cantidad de producto formado
Lectura
Bicromático
Esta técnica está basada en la premisa que aunque un
compuesto puede dar una interferencia espectral, la
absorbancia máxima del interferente será diferente de
la de la reacción analítica verdadera

El uso de este procedimiento permite
también que cada muestra sea
utilizada como su propio blanco para
el color endógeno.
Esta técnica involucra la medición de la absorbancia de una mezcla
de reacción a dos longitudes de onda diferentes simultáneamente.
Estas son:

- la longitud de onda principal (1 )
- la longitud de onda cercana 2 .
1 es la longitud de onda a la cual el cromógeno tiene la máxima
absorción. En 2 hay un mínimo de absorción del cromógeno. Como
la reacción es monitoreada simultáneamente a dos longitudes de
onda, ésta es conocida como análisis bicromático.
Otro método similar para la corrección de la
interferencia de fondo es la medición de la
absorbancia a la longitud de onda primaria Amax
y a dos longitudes de onda adicional,
generalmente equidistante del pico, A1 y A2. Las
lecturas de absorbancia a estas dos últimas
longitudes de onda son promediadas para dar la
absorbancia de fondo promedio en la muestra.
Esta técnica para la corrección de la absorbancia
de fondo de las sustancias interferentes es
conocida como la corrección de Allen.
Curva de calibración
 En

relación a los equipos automatizados y
su correcto funcionamiento para realizar
una lectura hay que tener bien en claro
que no se puede procesar un método si
no ha programado previamente el
equipo analizador
Métodos+de+medición+analítica+en+bioquímica+clínica
Calibración por curva-Calibración por grafica analítica

Se preparan varias soluciones estándares que contienen concentraciones
conocidas del analito, dichas soluciones deben cubrir el intervalo de
concentraciones de interés

Así como tener una composición matricial, tan parecida como se pueda a la de las
soluciones de la muestra

Si se obtiene una grafica no lineal, como ocurre con frecuencia, puede usarse
equipo electrónico o programas computacionales para compensar la curvatura y
producir una salida que sea una función lineal de la concentración, en regiones no
lineales el numero de soluciones estándares analizadas debe aumentarse para
obtener la exactitud del análisis de las muestras problema
Calibración por el método de adiciones estándares:

Cuando es imposible
suprimir interferencias
físicas o químicas en la
matriz de la muestra

La respuesta del instrumento
debe ser función lineal de la
concentración del analito,
en el intervalo de
concentraciones y también
debe tener una ordenada al
origen en cero (señal cero
para concentración cero).

Una pequeña cantidad de solución del analito de
concentración conocida se añade a una alícuota de una
solución de muestra analizada previamente y el análisis se
repite usando reactivos, parámetros del instrumento y
procedimientos idénticos.
Métodos+de+medición+analítica+en+bioquímica+clínica
Calibración por el Método
del Estándar Interno
Se emplea un
estándar interno para
minimizar las
diferencias en las
propiedades físicas
de un conjunto de
soluciones muestra
que contiene el
mismo analito

Una cantidad fija de
una sustancia pura se
añade tanto a las
soluciones muestra
como a las soluciones
estándares, se
determinan luego las
respuestas del analito
y del estándar interno

El cociente de
respuestas ( del
analito al estándar
interno) depende
solamente de la
concentración del
analito

Si se controlan los parámetros que afectan las respuestas medidas, la respuesta de
la línea del estándar interno será constante, por supuesto que la concentración
del estándar interno no es fija, sin embargo, si varia uno o mas de los parámetros
que afectan las respuestas medidas, dichas respuestas del analito y del estándar
interno deben ser afectada por igual.
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Métodos+de+medición+analítica+en+bioquímica+clínica

  • 2. Bioquímica  “Ciencia que estudia las bases químicas de la vida” Pilar fundamental de la biotecnología, y se ha consolidado como una disciplina esencial para abordar los grandes problemas y enfermedades actuales y del futuro
  • 3. Utilidad  Diagnóstico  Valoración del pronóstico y del tratamiento  Investigación  Ensayos clínicos de fármacos.
  • 4. Fase Analítica Comprende:  Técnicas analíticas Procedimientos de análisis basados en el comportamiento de la materia.    Espectrometría  Electroforesis Cromatografía  Electroquímica Química seca  Inmunoensayos
  • 5.  Métodos Analíticos Son aplicaciones de las técnicas, con parámetros y protocolos concretos.  Características analíticas: punto final, cinético, colorimétrico, enzimático, métodos de curva de calibración.  Reactivos usados: glucosa oxidasa, verde de bromocresol
  • 6. Fase Post-analítica  Desde la obtención de resultados hasta que el clínico solicitante tiene el informe.  “Fase total”. decisiva para cumplir una calidad
  • 7.  Validación        de resultados Valoración técnica: es la aceptación de los resultados obtenidos por las distintas técnicas. Valoración clínica: los resultados deben ser coherentes con la clínica. Informe de resultados Tiempo de respuesta Teoría de los valores de referencia Variaciones analíticas Variaciones extraanalíticas
  • 9. Método químico Se emplean en la determinación de una molécula o de un elemento determinado, que se halla inmerso en una mezcla con otras moléculas o elementos Los bioelementos poseen una capacidad para emitir y absorber luz de una determinada longitud, siendo la longitud de onda de emisión característica de cada elemento. Requieren de la utilización de alguna característica diferencial
  • 10. Métodos físicos Compuestos bioquímicos, es que son muy parecidos en cuanto a propiedades químicas solubilidad polaridad Requieren de un procedimiento previo Métodos separativos punto isoeléctrico Basados en las propiedades físicas de los compuestos.
  • 11. Métodos enzimáticos La mayoría de las veces las técnicas separativas no permiten determinar la presencia de una determinada proteína en presencia de otras Las enzimas son específicas de reacción y sustrato, y los elementos que intervienen en la reacción pueden determinarse, bien porque presentan una característica que puede medirse o bien porque pueden determinarse por medios químicos.
  • 12. Métodos inmunológicos No todas la proteínas poseen actividad enzimática o una función que pudiera medirse Embargo la gran diferencia entre proteínas radica en su gran y única configuración tridimensional
  • 13. Métodos de hibridación Ácidos nucleicos son difíciles de determinar Las diferencias en tamaño de las especies de ARN o de fragmento de ADN no lo permiten + Secuencia de nucleótidos. Método para el reconocimiento de una secuencia específica.
  • 14. Este método emplea sondas que son específicas y complementarias a determinada zona de la cadena de ADN o ARN dependiendo lo que se quiera determinar. Es importante recordar que es necesario un sistema de marcaje que permita cuantificar la cantidad de ácido nucleico presente, ya que la hibridación sólo induce la especificidad del método.
  • 15. Métodos Fotométricos Espectro Electromagnético: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga.  Región Ultravioleta: = 10-380 nm  Región Visible: = 380-780 nm  Región Infrarroja: = 780-30.000 nm
  • 16. Ley de Beer:  “La Absorbancia de una solución es directamente proporcional ala concentración y a la longitud del paso de la luz”.
  • 17.  Espectrofotómetro  Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de una determinada longitud de onda.  Espectrofotómetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromático cuya longitud de onda se varía a voluntad.
  • 18.  Fluorimetría   o Fluorimetría Luminiscencia Fluorescencia Tiene una alta sensibilidad de 100 a 1000 veces mas sensibles q técnicas colorimétricas normales. FLUOROINMUNOANÁLISIS: son anticuerpos marcados con una sustancia fluorescente, específicos de la sustancia que se va a estudiar. DETERMINACIÓN de vitaminas, fármacos, algunas enzimas, etc.
  • 19.  Fotometría de llama La intensidad luminosa es directamente proporcional al número de átomos que emiten energía, que a su vez es directamente proporcional a la concentración del ión de la muestra. Se utiliza para la determinación de Sodio, Litio y Potasio (Na, Li, k) en líquidos biológicos.
  • 20.  Espectrofotometría de absorción atómica Se utiliza para la determinación de Calcio, Magnesio, Cobre, Zinc, Plomo y otros metales  Nefelometría y turbidimetría Cuando un haz de luz choca contra una partícula en suspensión sufre una serie de fenómenos: - dispersión de la luz - reflexión - absorción - transmisión
  • 21.  La DISPERSIÓN de la luz depende de varios factores, que son:     Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Distancia del detector a la cubeta Concentración de partículas
  • 22. Métodos para medir la [] de una sustancia por Espectrofotometría
  • 23.  Punto final o de equilibrio Se incuba la muestra y el reactivo durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada para que se complete totalmente la reacción, de tal forma que la sustancia que buscamos debe consumirse totalmente. Si no fuera así y quedase parte de la sustancia sin consumir, al medir el producto, estaríamos midiendo menos cantidad de la que realmente hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo fijo de incubación.
  • 24.  Métodos cinéticos En ellos se mide la velocidad de la reacción mediante la medida de la variación de la Absorbancia en el tiempo y esto se relaciona con la concentración. Es una medición continua, a diferencia de la del punto final, se mide en tiempos regulares. Se puede medir la cantidad de sustrato no transformado ó la cantidad de producto formado
  • 26. Bicromático Esta técnica está basada en la premisa que aunque un compuesto puede dar una interferencia espectral, la absorbancia máxima del interferente será diferente de la de la reacción analítica verdadera El uso de este procedimiento permite también que cada muestra sea utilizada como su propio blanco para el color endógeno.
  • 27. Esta técnica involucra la medición de la absorbancia de una mezcla de reacción a dos longitudes de onda diferentes simultáneamente. Estas son: - la longitud de onda principal (1 ) - la longitud de onda cercana 2 . 1 es la longitud de onda a la cual el cromógeno tiene la máxima absorción. En 2 hay un mínimo de absorción del cromógeno. Como la reacción es monitoreada simultáneamente a dos longitudes de onda, ésta es conocida como análisis bicromático.
  • 28. Otro método similar para la corrección de la interferencia de fondo es la medición de la absorbancia a la longitud de onda primaria Amax y a dos longitudes de onda adicional, generalmente equidistante del pico, A1 y A2. Las lecturas de absorbancia a estas dos últimas longitudes de onda son promediadas para dar la absorbancia de fondo promedio en la muestra. Esta técnica para la corrección de la absorbancia de fondo de las sustancias interferentes es conocida como la corrección de Allen.
  • 29. Curva de calibración  En relación a los equipos automatizados y su correcto funcionamiento para realizar una lectura hay que tener bien en claro que no se puede procesar un método si no ha programado previamente el equipo analizador
  • 31. Calibración por curva-Calibración por grafica analítica Se preparan varias soluciones estándares que contienen concentraciones conocidas del analito, dichas soluciones deben cubrir el intervalo de concentraciones de interés Así como tener una composición matricial, tan parecida como se pueda a la de las soluciones de la muestra Si se obtiene una grafica no lineal, como ocurre con frecuencia, puede usarse equipo electrónico o programas computacionales para compensar la curvatura y producir una salida que sea una función lineal de la concentración, en regiones no lineales el numero de soluciones estándares analizadas debe aumentarse para obtener la exactitud del análisis de las muestras problema
  • 32. Calibración por el método de adiciones estándares: Cuando es imposible suprimir interferencias físicas o químicas en la matriz de la muestra La respuesta del instrumento debe ser función lineal de la concentración del analito, en el intervalo de concentraciones y también debe tener una ordenada al origen en cero (señal cero para concentración cero). Una pequeña cantidad de solución del analito de concentración conocida se añade a una alícuota de una solución de muestra analizada previamente y el análisis se repite usando reactivos, parámetros del instrumento y procedimientos idénticos.
  • 34. Calibración por el Método del Estándar Interno Se emplea un estándar interno para minimizar las diferencias en las propiedades físicas de un conjunto de soluciones muestra que contiene el mismo analito Una cantidad fija de una sustancia pura se añade tanto a las soluciones muestra como a las soluciones estándares, se determinan luego las respuestas del analito y del estándar interno El cociente de respuestas ( del analito al estándar interno) depende solamente de la concentración del analito Si se controlan los parámetros que afectan las respuestas medidas, la respuesta de la línea del estándar interno será constante, por supuesto que la concentración del estándar interno no es fija, sin embargo, si varia uno o mas de los parámetros que afectan las respuestas medidas, dichas respuestas del analito y del estándar interno deben ser afectada por igual.