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DegradacióN De Lignina Del Bagazo De CañA (Saccharum

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DegradacióN De Lignina Del Bagazo De CañA (Saccharum

  1. 1. DEGRADACIÓN DE LIGNINA DEL BAGAZO DE CAÑA (Saccharum officinarum) UTILIZANDO HONGOS ASCOMICETOS. LIGNIN DEGRADATION OF THE CANE BAGASSE (Saccharum officinarum) USING ASCOMICETES FUNGI. Jácome, E.A. Asanza, H.F. * Carrión, F.H Centro de Biología Celular y Molecular. Universidad Técnica Particular de Loja. Loja – Ecuador. 11-01-608. fhcarrion@utpl.edu.ec Se evaluó la actividad enzimática para establecer el potencial de degradación de lignina del bagazo de caña de varias cepas de hongos colectados en el Parque Nacional Podocarpus, en la Provincia de Loja al Sur del Ecuador. De un total de 100 cultivos disponibles en el cepario micológico del Centro de Biología Celular y Molecular (CBCM), a los cuales se los sometió a un ensayo preliminar para determinar la capacidad cualitativa de degradación enzimática, se tomó las tres cepas que presentaban mejor actividad (Scopulariopsis Sp., A. coelomycetes y Ascomycetes 45ch.). Para determinar la actividad ligninolítica cualitativa de las especies en estudio se empleó ABTS como revelador a una concentración de 10 mM. Las cepas que mostraron actividad positiva fueron sometidas a fermentación sumergida en medios de cultivo alimentados con bagazo de caña de azúcar como sustrato. Los productos obtenidos se sometieron a pruebas espectrofotométricas para medir la actividad cuantitativa de la Lignina peroxidasa y Lacasa. La mayor actividad Lacasa fue de 2800 unidades enzimáticas por litro (U/L), producida por Ascomycetes 45ch a los 37 días de cultivo, a una concentración de sustrato del 1,5%. La tasa máxima de degradación de lignina en las fibras de bagazo alcanzada por la misma cepa, después de la etapa de fermentación, fue del 44% respecto a su contenido inicial. En ninguno de los casos se detectó actividad Lignina peroxidasa. Palabras Clave: Scopulariopsis, Coelomycetes, Ascomycetes, lignina peroxidasa, lacasa. Keywords: Scopulariopsis, Coelomycetes, Ascomycetes, lignin peroxidase, laccase. 1. Introducción encadenan las moléculas de celulosa (Rowell, R. 1991). Las fibras naturales contienen El impacto ambiental que causa el elevadas cantidades de celulosa la tratamiento de las fibras en las etapas misma que es un compuesto de especial de pulpaje y blanqueo es muy severo. interés en la industria para la El pulpaje Kraft es el proceso más producción de pulpa y papel, pero para empleado en el mundo, su objetivo es llegar a este valioso recurso se debe remover la lignina para liberar la fibra penetrar una gran barrera formada por de celulosa pero la utilización de hemicelulosa y lignina, que son diversos químicos genera la emisión de polímeros muy complejos que gases sulfurados denominados TRS ó azufre total reducido (Fuentes, J. 1991).
  2. 2. Por otra parte en el blanqueo se Varias especies de Ascomicetos y hongos emplean productos clorados que imperfectos causantes de la pudrición permiten la eliminación de la lignina suave de la madera están involucrados residual pero son productores directos en la degradación de lignina, lo que de diotoxinas (Fuentes, J. 1991), por tal hace que estos microorganismos motivo la aplicación de sistemas jueguen un papel importante en biológicos para la remoción de lignina diversos sistemas biológicos. es una alternativa a este problema. Se considera que la mayoría de los 2. Materiales y Métodos hongos del suelo únicamente descomponen la celulosa; sin embargo Microorganismos. Sé utilizó tres los hongos que descomponen la especies de Ascomicetos (Scopulariopsis madera, tales como los hongos de Sp, Coelomycetes y Ascomycetes 45ch), pudrición blanca Basidiomicetos y pertenecientes al cepario micológico del Ascomicetos, han sido reconocidos CBCM. Estos fueron mantenidos en como los más eficientes degradadores medio MYP a temperatura ambiente. de lignina. (Martin, J. P., and Haider, K. Ensayo cualitativo. En cajas petri se 1971). colocó 10 ml de medio MYP, medio Algunas de las cepas estudiadas, bajo basal (MgSO4. 7H2O, 0.5 g; HK2PO4, 0.6 las condiciones adecuadas, podrían ser g; H2KPO4, 0.5 g; CuSO4.5H2O, 0.4 mg; herramientas potenciales para la MnCl2.H2O, 0.09 mg; H3BO3, 0.07 mg; deslignificación de las fibras naturales, NaMoO4.2H2O, 0.02 mg; FeCl3, 1 mg; aunque aún no se conoce a ZnCl2, 2.5 mg.) y ABTS (2,2’ - azinobis profundidad cual es el conjunto de (3-etilbenzotiazoline-6-sulfonato) enzimas involucradas en la (SIGMA) como inductor y revelador a deslignificación por hongos (Broda, P. una concentración de 10mM. Se coloca et al. 1996). un disco (ø 5 mm) con cultivo crecido, Las enzimas ligninolíticas que son en el centro de la placa y se incuba a responsables de la degradación de la temperatura ambiente. lignina de los materiales Fermentación. En matraces de lignocelulósicos son fundamentalmente 125 ml, se colocó 30ml de medio GA Lignina peroxidasa (Lip), Lacasa (Lac) (GA. Glucosa, 1%; Asparagina, 0,4%; y Manganeso peroxidasa (MnP), la SIGMA) suplementado con bagazo de mismas que actúan liberando caña (fibras de ø 1mm) en moléculas de celulosa, a partir de las concentraciones de 0.5%; 1.0% y 1.5%. cuales se pueden obtener unidades de Se reguló el pH a 5,5 con HCl 0,1 N y se glucosa que son de gran interés en la esterilizó a 121 oC por 20 minutos. industria alimentaria para la En los medios estériles se inoculó un elaboración de jarabes y etanol disco de agar con micelio fúngico (ø 1 (Forchiassin et al, 1999). Así mismo el cm), se incubó a temperatura ambiente sistema ligninolítico tiene aplicaciones con agitación constante de 120 rpm. biotecnológicas muy prometedoras, Actividad enzimática. Se tomaron tanto en el desarrollo de métodos periódicamente, tres muestras alternativos de deslignificación de la semanales, de los sobrenadantes para la madera, pulpeo o blanqueo, como para cuantificación enzimática. el tratamiento de efluentes o la Lacasa: Se usó como sustrato biorrecuperación de suelos y aguas ABTS 0.5 mM en buffer acetato de subterráneas contaminadas. (Gonzales sodio 0.1 M, pH 5, a 30 ˚C. (“420 36000 et al. 2002). M-1cm-1). ii
  3. 3. Lignina Peroxidasa. Se utilizó como sustrato alcohol veratrílico 2 mM, Enzimas Ligninolíticas H2O2 0.4 mM, buffer tartrato 50 mM y 3000 la muestra de la enzima. El H2O2 inicia 2500 la reacción (“310 9333 M-1cm-1). Actividad Enzimática, U/ml 2000 Determinación de glucosa. Se 0,5% realizó con el método enzimático 1500 1% 1,5% (Randox) a 505 nm. Solución estándar: 1000 glucosa, 1 g/L; Reactivo de trabajo: 500 glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa 0 (POD), 4-aminofenazona (4- AF) y 2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 T, días 26 28 30 33 35 37 40 42 44 ácido salicílico pH: 7,4. Gráfico 2. Producción de Lacasa por Ascomycetes Cuantificación de lignina. Las 45ch a diferentes concentraciones fibras sometidas a la fermentación se separaron mediante filtración se Ascomycetes 45ch presentó una elevada lavaron con agua destilada a 90ºC, actividad Lac, alcanzando valores luego se solubilizó la celulosa y superiores a 2800 U/L, a una hemicelulosa por medio de una concentración de 1,5% de sustrato en hidrólisis con ácido sulfúrico al 72%, un periodo de 37 días (Gráfico 2). permaneciendo la lignina como resto insoluble (Papinuttti et al, 2003). El Enzimas Ligninolíticas peso de la fracción insoluble 250,00 corresponde a la lignina. 200,00 Actividad Enzimática, U/ml 3. Resultados y discusión. 150,00 0,5% 1% 1,5% Actividad Enzimática 100,00 50,00 Enzimas Ligninolíticas 25 0,00 2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 26 28 30 33 35 37 40 42 44 T, días Gráfico 3. Producción de Lacasa por Scopulariopsis 20 Sp. a diferentes concentraciones Actividad Enzimática, U/ml 15 0,5% 1% 10 1,5% Con Scapulariopsis Sp. a una concentración de 0,5% de sustrato se 5 llegó a obtener valores máximos de 213 U/L de actividad Lac en el día 37 de fermentación (Gráfico 3). 0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 T, días El ensayo cuantitativo detectó Gráfico 1. Producción de Lacasa por Coelomycetes (Ascomycetes) a diferentes concentraciones únicamente actividad Lac. Ninguna de las tres especies involucradas en esta Coelomycetes (Ascomycetes) presentó su investigación presentó actividad Lip, mayor expresión enzimática en el aunque cabe destacar que esta enzima quinto día de cultivo, alcanzando una no se ha encontrado en la mayoría de producción de actividad Lac de 17,5 y los hongos de pudrición blanca 20 Unidades/Litro (U/L) para las estudiados (Pelaez, F., et al. 1995). concentraciones de sustrato de 1% y El patrón de expresión de las 0,5% respectivamente (Gráfico 1). actividades enzimáticas depende de los iii
  4. 4. diferentes organismos, es decir, productos de degradación a los ciclos mientras unos secretan Lip y MnP (no metabólicos del organismo que como producen Lac), otros secretan MnP y producto final dan CO2 (Kirk, T. Farell, Lac (no producen Lip) (Martín, C., et al. R. 1987). 2004). Es interesante conocer esto debido a que en esta investigación solo 4. Conclusiones. se consideró el estudio de las enzimas Lip y Lac, pero al tener los organismos Las tres especies fúngicas este patrón de comportamiento es muy mostraron únicamente actividad probable que alguna de las tres especies Lacasa. La actividad Lignina investigadas haya producido peroxidasa fue nula. conjuntamente Lac y MnP. Se determinó que Ascomycetes La concentración del sustrato 45ch es la cepa más productiva, tiene una relación directamente reportando una importante actividad proporcional con la producción Lacasa (2800 U/L) a los 37 días de la enzimática del género Ascomycetes 45ch, etapa fermentativa. es decir, a mayor concentración de fibra El bagazo de caña de azúcar (1,5%), mayor actividad enzimática demostró ser un excelente sustrato para 2800 U/L, que se logró usando la producción de enzimas únicamente bagazo de caña como extracelulares. sustrato; esto contrasta con otros La tasa máxima de degradación reportes en los que se usa cofactores de lignina fue del 44% alcanzada con (Fenol 10 mg/L)y se obtiene menores Ascomycetes 45ch a una concentración cantidades enzimáticas (Lac 2575 U/L) de 1,5% de sustrato. (Nurdan Kasıkara. 2004), esto sugiere La producción enzimática que posiblemente esta cepa posea una comienza cuando la concentración de capacidad mayor de producir glucosa en el medio de cultivo empieza biocatalizadores. a disminuir. Consumo de glucosa. El género Ascomycetes 45ch, mostró un acelerado Referencias consumo de glucosa, agotando completamente este monosacárido en el ALEXOPOULOS, C., MIMS, C día 7 de cultivo, lo que implicaría una and BLACKWELL, M. (1996). activación de su metabolismo Introductory Mycology. Fourth Edition. secundario para producir enzimas John Wiley & Sons, Inc. United States of extracelulares (Lac), las cuales son America. oxidasas que en determinadas CURTIS, Helena y BARNES, condiciones contribuyen a Sue. (1993). Biología. Quinta Edición. despolimerizar la compleja estructura Editorial Médica Panamericana S. A. de lignina (Cullen, D. 1997). Buenos Aires. Argentina.1999 pág. Degradación de lignina. FORCHIASSIN, Flavia. Ascomycetes 45ch mostró la tasa máxima MAGNELLI, Paula. DIORIO, Luis de degradación de lignina (44% Alberto y MERCURI, Oscar Alberto respecto al contenido inicial), (1999). Manual de Procedimientos. ratificando la eficiente acción de la Lac, Segunda Edición. Laboratorio de que al catalizar las primeras reacciones Micología Experimental. Universidad rompen uniones dentro de la molécula de Buenos Aires. Argentina. de lignina, generando moléculas más MENDOZA, Laura. pequeñas e incorporando estos (2004).Producción de enzimas de iv
  5. 5. interés para biotecnología por hongos del cepario del instituto de investigación fármaco BIOQUÍMICA (IIFB). PAPINUTTI, V., et al. (2003). Degradación de madera de álamo por Fomes sclerodermeus: producción de enzimas ligninolíticas en aserrín de álamo y cedro. Laboratorio de Micología Experimental. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Argentina. UHLIG, Helmut. (1998), Industrial Enzymes and their Applications. New York, USA. v

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