1. UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE
FACULDADE DE AGRONOMIA E ENGENHARIA FLORESTAL
CURSO DE ENGENHARIA FLORESTAL
RELATÓRIO DE FISIOLOGIA VEGETAL
Tema:
NiTraTo reduTase iN vivo Nas folhas das
plaNTas
G4 – 1o Grupo
Docente: Prof. Dr. Orlando Quilambo
Discentes: Chaúque, Milton Domingos
Dra. Célia Martins
Juízo, Cláudio Gumane
Monitora: Abdula, Cházia Gulamo
Mamugy, Faruk P. Semedo
Reis, Sérgio Joaquim Cinco
.
Maputo, Maio de 2007

2. 2

3. 1. Introdução
A enzima Nitrato Reductase é a principal enzima responsável pela assimilação de
nitrogénio pelas plantas e tem a actividade fortemente afectada pela disponibilidade de
água no solo, por isso é usada como variável na avaliação das plantas em diferentes
condições ambientais (http://www.cpa.unicamp.br/sbfv/journal/pdfs/v4n1/v4n1p55.pdf).
Nitrato Reductase é a enzima que reduz o nitrato (NO3-) para nitrito (NO2-). Catalisa o
primeiro passo pelo qual o absorvido pelas raízes é assimilado na forma orgânica (Taiz e
Ziger, 2004). Segundo Salisbury & Ross, (1992), o caminho bioquímico do nitrato para
os aminoácidos é regulado por uma variedade de factores internos e externos, como a
concentração de nitrato, a composição de aminoácidos, a luz, o CO 2 e as hormonas da
planta.
Segundo Oaks (1994) citado por Taiz e Ziger (2004), as plantas assimilam a maioria do
nitrato absorvido por suas raízes em compostos orgânicos nitrogenados. A primeira etapa
do processo é a redução do nitrito no citoplasma. A Nitrato Reductase cataliza esta
reacção:
NO3- + NAD(P)H + H+
NR
NO2- + NAD(P)+ + H2O
As nitratos redutases das plantas superiores são formadas por duas subunidades idênticas
com três grupos prostécticos cada: FAD (Flavina Adenina Dinucleotídeo), heme e um
complexo formado entre o molibdénio e uma molécula orgânica denominada pterina
(Mendel e Stalmeyer, 1995; Campbell, 1999 Citados por Taiz e Ziger, 2004).
A actividade da enzima Nitrato Redutase é afectada por vários factores. Nas folhas e
caules, a luz aumenta a actividade da enzima Nitrato Redutase quando NO3- está
disponível. A luz actuando através da fotossíntese promove a actividade da enzima
Nitrato Redutase porque aumenta o suprimento de carbohidratos e o NAD(P)H
necessário para a redução de nitrato é produzido através destes carbohidratos (Salisbury
& Ross, 1992).
3

4. 2. Objectivos
2.1. Objectivo geral
•
Estudar a actividade da enzima Nitrato Reductase nas folhas das plantas
2.2. Objectivo específico
•
Medir a actividade da enzima Nitrato Reductase nas folhas de feijão nhemba
(Vigna unguiculata) e Amendoim (Arachis hipogea);
•
Verificar qual planta tem mais Nitrato Reductase actual e qual tem mais Nitrato
Reductase Potencial;
•
Determinar a diferença entre o Nitrato Reductase actual e o Nitrato Reductase
Potencial.
3. Método / Princípio
Nesta experiência nós mediremos a actividade da Nitrato Reductase de algumas plantas
com o método in vivo. Nós adicionaremos nitrato (substrato) para as partes verdes em
uma solução tampão. A nitrato entrará nas células da folha pelas margens cortadas em
uma difusão simples. Para facilitar este processo de difusão, é adicionado n-propanol que
faz as membranas mais permeáveis para o substrato e o produto (nitrito). O nitrato será
reduzido nas células pela enzima de NRa, usando o NADH disponível nas células. As
células serão mantidas no escuro, enquanto prevenindo a formação de ferredoxina
reduzida, e o nitrito produzido difundirá em parte fora das células no meio, onde pode ser
medido com uma técnica colorimétrica simples. Usando uma linha de calibração para
absorvancia a 540 nm de várias quantidades de nitrito, nós podemos determinar a
quantidade de nitrito produzidas pelas células de planta em nmol ou µmol NO 2- por hora
por grama de peso fresco de folhas. Normalmente esta é uma expressão muito boa da
actividade de NRa actual nas folhas.
4

5. O mais alto a NRa in vitro, mais nitrato está disponível para as plantas nas condições
naturais. Então, este teste dá uma indicação boa do nitrato disponível na terra, mas
também da capacidade da planta para absorver nitrato e usa isto como uma fonte de
nitrogénio. Plantas com um NRa alto normalmente são plantas nitrófilas para qual a
maioria de nossas plantas de colheita pertence.
4. Materiais e Métodos
4.1. Equipamento e material experimental
•
Folhas verde fresco e maduro de algumas plantas herbáceas (2 espécies
diferentes)
•
Balança electrónica
•
Banho-maria a 30 º C
•
Banho-maria a 100º C
•
Espectofotómetro a 540 nm
•
Cuvetas
•
Medidor de pH
•
Tesouras ou facas afiadas
•
Placas de Petri com tampas (uma por espécie)
•
Papel absorvente
•
40 Tubos de ensaio limpos e secos
•
4 Rolhas de borracha de tubo de ensaio
•
Prateleira de tubos de ensaio, para 24 tubos de ensaio em banho-maria
•
Chapa de alumínio
•
Pipetas automáticas (10 ml e 1ml) com gorjetas
•
Papel milimétrico
•
2 Balões volumétricos de 100 ml
•
Proveta medindo 100 ml
5

6. •
2 Provetas de 150 ml
•
Cronómetro (até 60 minutos)
4.2. Soluções
•
Médio de Incubação básico (preparado)
•
Reagente 1
•
Reagente 2
•
Médio de incubação A
•
Médio de incubação B
•
Solução de Nitrato padrão
5. Procedimentos
•
Levou-se algumas folhas verdes frescas e maduras de duas espécies diferentes, de
ervas e enxaguou-se na água da torneira.
•
Secou-se, removeu-se as nervuras grandes e cortou-se as folhas em pedaços
pequenos de cerca de 0.5 x 0.5 cm. Manteve-se os pedaços de folha até o seu uso em
uma placa de Petri com papel absorvente humedecido de modo a impedir que
secassem.
•
Pôs-se aproximadamente 0.2 g (previamente pesados) de pedaços de folha
misturados de espécies 1 (Feijão) em tubos de ensaio A1 e B1. Fez-se o mesmo para
as espécies 2 (Amendoim) em tubos de A2 e B2.
•
Embrulhou-se o quarto tubos de ensaio em papel de alumínio de modo a impedir
que a luz entrasse. Adicionou-se aos tubos A1 e A2, 5 ml de Meio de Incubação A e
no tubo B1 e B2, 5 ml de Meio de Incubação B. Fechou-se os tubos com rolhas de
borracha e colocou-se em banho-maria à 30ºC.
•
Depois de exactamente 15 minutos abriram-se os tubos, tirou-se duas amostras de
0.5 ml de cada tubo de ensaio e fechou-se novamente. Deixou-se no banho-maria.
6

7. •
Levou-se as amostras de 0.5ml novamente (em duplicado) de cada tubo de ensaio
depois de exactamente 45 minutos.
•
Depois de levar-se as últimas amostras, pôs-se os tubos, sem rolhas em um banho-
maria fervente durante 2 minutos, removeu-se e levou-se as amostras finais de 0.5 ml
(duplicada).
•
Todas as amostras foram postas em tubos de ensaio limpos e secos. Depois de
todas as amostras terem sido coleccionadas e postas nos tubos de ensaio, procedeu-se
da seguinte maneira:
•
Acrescentou-se primeiro a cada uma das amostras de 0.5 ml 1.5 ml de água
destilada.
•
Adicionou-se 1.0 ml de reagente 1 (sulfanilamide) e misturou-se bem.
•
Adicionou-se 1.0 ml de reagente 2 (NED) e misturou-se bem novamente.
•
Deixou-se durante 15 minutos a temperatura ambiental.
•
Mediu-se a absorvência a 540 nm em espectofotómetro. Usou-se como branco 0.5
ml de meio A ou B (dependendo do tratamento da amostra) com 1.5 ml de água
destilada e 1ml de reagente 1 e 1ml de reagente 2.
6. Linha de calibração
•
Pipetou-se 10.0 ml da solução de nitrito padrão para um balão volumétrico de 100
ml e encheu-se a marca com água destilada.
•
Pipetou-se da solução de nitrito padrão diluída as quantidades seguintes em tubos
de ensaio limpos e secos (tudo em duplicado): 0.0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 e 1.0 ml.
Acrescentou-se água destilada a estes tubos para compor um volume de exactamente
2.0 ml.
•
Adicionou-se 1.0 ml do reagente 1 (sulfanilamide) e misturou-se bem.
•
Adicionou-se 1.0 ml do reagente 2 (NED) e misturou-se bem novamente.
•
Deixou-se durante 15 minutos a temperatura ambiente e mediu-se a absorvência a
540 nm em spectofotómetro.
7

8. 7. Resultados
Tabela 1. Absorvância à 540 nm
Tempo
Tubo A1
15 minutos 0.046 0.057
45 minutos 0.01 0.015
Depois dos 0.048 0.051
Média
0.0515
0.0125
0.0495
Absorvância a 540 nm
Tubo A2
Média
Tubo B1
Média Tubo B2 Média
0.049 -0.008 0.0205 0.05 0.045 0.0475 0.015 0.02 0.0175
0.003 0.009 0.006 0.082 0.287 0.1845 0.000 0.048 0.024
0,074 -0,004 0.035 0.040 0,032 0.036 0,018 0,042 0.03
100ºC
Tabela 2: Linha de calibração
Volume de Nitrito (ml)
0,0
0,2
-6
Concentração de Nitrito (x 10 M) 0,0
1,0
-0.205 -0.214
Absorvância
0,4
2,0
0.006
0,6
3,0
-0.201
0,8
4,0
-0.152
1,0
5,0
-0.181
8. Discussão
A planta que tem o NRa actual mais alto é a Vigna unguiculata. A planta que tem o NRa
potencial mais alto é também a Vigna unguiculata.
Segundo Sivasancar e Oaks (1996) citados por Taiz e Zeiger (2004), o nitrato, a luz e os
carbohidratos interferem no nitrato redutase em nível de transcrição e tradução.
A luz e os níveis de carbohidratos, alem de outros factores ambientais, estimulam a
proteína fosfatase, que desfosforila vários resíduos de serina na proteína nitrato redutase,
promovendo a activação da enzima (Taiz e Zeiger, 2004). Segundo Kaiser e Colls (1999)
citados por Taiz e Zeiger (2004), agindo na direcção inversa, o escuro e o Mg + estimulam
a proteína quinase, a qual fosforila os mesmos resíduos de serina, interagindo com a
proteína inibidora 14-3-3 e inactivando a nitrato redutase.
Depois de ferver a amostra final, embora haja algumas variações, a tendência é de
aumentar a absorvância provavelmente porque com o aumento da temperatura haverá um
aumento de citocromo que aumenta a síntese de várias proteínas, incluindo NRa através
dos ribossomas (Salisbury & Ross,1992).
9. Conclusão
8

9. •
A planta que tem mais Nitrato Reductase actual é o feijão nhemba (Vigna unguiculata)
em relação ao amendoim (Arachis hipogea).
•
A planta que tem mais tem mais Nitrato Reductase Potencial é o feijão nhemba (Vigna
unguiculata) em relação ao amendoim (Arachis hipogea).
•
A diferença entre o Nitrato Reductase actual e o potencial esta na acção da enzima
reductase durante a transformação de nitrato em nitrito.
9

10. 10. Bibliográfia
•
Salisbury, F.B. e C. W. Ross (1991). Plant Physiology. 4a edição. 682pp. Wadsworth
Publishing Company, Belmont, California – EUA
•
Taiz, L. e E. Zeiger (2004). Fisiologia Vegetal. 3a edição. Artmad Editora, Califórnia.
719pp.
•
http://www.cpa.unicamp.br/sbfv/journal/pdfs/v4n1/v4n1p55.pdf, 04/05/2007; 11:22 h
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