Daniel Salazar Osorio.
Thalía Ramírez Montoya.
INTRODUCTION
The International Commission on Microbiological
Specifications for Foods classified Cronobacter as
pathogenic...
• The majority of bacteremia cases were patients >15 years in age. from a
survey of >45,000 patients from two hospitals sa...
CRONOBACTER
- Es un género de anaerobios facultativos, bacterias Gram-
negativos que hace parte de la familia Enterobacter...
Especies:
1. C sakazakii
2. C. malonaticus
3. C.muytjensii
4. C.turicensis
5. C. dublinensis
6. C. universalis
7. C. Condi...
• C. sakazakii
- Transmisión al organismo es vía oral, por contacto directo o a
través de los alimentos
- Relacionado con ...
GENOTIPIFICACION
• Procedimiento mediante el cual se obtiene el genotipo de un
organismo. Estas técnicas moleculares utili...
• PCR - RAPD - REP-PCR - ERIC-PCR - BOX-PCR
• PCR-RFLP
• RFLP-Hibridación
• PFGE
• AFLP
• VNTR / MLVA
• MLST
Cambios genét...
INMUNOCOMPROMISO
• Aquella en las cual las cifra de células inmunes disminuye de
manera sustancial, impidiendo la defensa ...
Los principales defectos inmunológicos son:
• neutropenia (deficiencia del componente fagocitario)
• Agamma/hipogammaglobu...
Los principales microorganismos en la deficiencia de la
inmunidad humoral son las bacterias encapsuladas: neumococo,
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GENERAL PURPOSE
• This study aimed to address this lack of knowledge using the
collection of 51 clinical Cronobacter strai...
METODOS Y MATERIALES
• Cepas y cultivos
• Fenotipificacion
• PFGE de aislamiento cronobacter
• Serotipificación molecular ...
CEPAS Y CULTIVOS
• 51 cepas de Cronobacter clínicos.
• Recogidos en una encuesta de Cronobacter por pacientes de
dos hospi...
FENOTIPICACION
• Aislamientos de Cronobacter fueron fenotipificados usando el
32E ID kit.
PRGE
- Enzimas de restricción XbaI y Spel
- Se analizaron los perfiles de banda de ADN con el uso de
software BioNumerics.
PRGE
• Electroforesis en campos pulsantes
- Se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de
separar biom...
- Duración determina el intervalo de tamaños que se pueden
separar (cuanto mayor sea el tamaño de los fragmentos a
separar...
APLICACIONES
- Epidemiologia molecular
Serotipificación molecular de
Cronobacter
• Serotipos Cronobacter se determinaron utilizando el multiplex
reacción en cade...
PCR
• Reacción en cadena de polimerasa
Técnica de amplificación enzimática de secuencias especificas de
ADN. Consiste en a...
PRINCIPIO DEL METODO:
- Desnaturalización del ADN.
- Hibridación especifica de la hebra sencilla con un
oligonucleótido ( ...
EXTRACCION DEL DNA
• Se extrajo el ADN de las cepas diana
• La concentración de ADN se confirmó
• el ADN se almacenaron a ...
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL
ALELO RPO B
• El producto de PCR (637 pb) era secuenciado y alineada con
las secuencias adici...
SECUENCIACION DE ADN
• conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es
la determinación del orden de los nucl...
MLST
• Siete genes de limpieza amplificados fueron:
ATP sintasa cadena beta (TPAT), factor de elongación G (Fusa),
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MLST
• Tipificación multilocus de secuencias
- caracterización taxonómica de bacterias y microorganismos.
- caracteriza mu...
Principio la técnica:
- Mide directamente los cambios en la secuencia de una serie de
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• APLICACIONES
RESULTADOS
51 sepas fueron caracterizadas genotípica mediante fusA y
MLST, además fenotípicamente mediante ID32E, la cual no
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Se encontró una relación
fuerte entre los serotipos y
varios tipos de secuencias.
• PFGE se uso para comparar si las cepas pueden ser usadas
para elaborar el perfil en los dos diferente hospitales.
Usando enzimas de restricción, se lograron separar de
12 a 17 fragmentos de C. sakazakii y de 8 a 10
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• Cepas del mismo tipo fueron secuenciadas y diferenciadas con
mas detalle permitiendo un mejor estudio de ellas.
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AUTOR
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Thalia Ramirez.
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BIBLIOGRAFIA
• http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717
-75182015000100011
• http://www.elika.eus/dato...
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  1. 1. Daniel Salazar Osorio. Thalía Ramírez Montoya.
  2. 2. INTRODUCTION The International Commission on Microbiological Specifications for Foods classified Cronobacter as pathogenic organisms to a restricted population, endangering their lives and causing serious long- term consequences. Among premature neonates and immunocompromised infants, these infections can be life-threatening. The neurological sequelae can be permanent and the mortality rate can be as high as 40–80 %
  3. 3. • The majority of bacteremia cases were patients >15 years in age. from a survey of >45,000 patients from two hospitals sampled from 2005 to 2011 . • The majority of Cronobacter spp. isolates were from throat swabs, followed by urine, tracheal aspirates, Broncho alveolar lavage, cannulae and sputum samples. • To date, over 1000 Cronobacter strains have been genotyped according to MLST . This genotyping has revealed a prevalence of C. sakazakii clonal complex 4 with neonatal meningitis cases and C. malonaticus clonal complex 7 with adult infections.
  4. 4. CRONOBACTER - Es un género de anaerobios facultativos, bacterias Gram- negativos que hace parte de la familia Enterobacteriaceae. ( viven en la flora intestinal) - Presentes naturalmente en el ambiente. - Pueden sobrevivir en condiciones muy secas. - se han encontrado en alimentos secos o deshidratados, como la leche maternizada en polvo, la leche en polvo, los tés de hierbas y los almidones. También se han encontrado en aguas residuales.
  5. 5. Especies: 1. C sakazakii 2. C. malonaticus 3. C.muytjensii 4. C.turicensis 5. C. dublinensis 6. C. universalis 7. C. Condimenti
  6. 6. • C. sakazakii - Transmisión al organismo es vía oral, por contacto directo o a través de los alimentos - Relacionado con brotes de meningitis o enteritis, en especial en los lactantes. - Especie más agresiva en individuos hipersensibles - Grupos de población más afectados recién nacidos y adultos mayores
  7. 7. GENOTIPIFICACION • Procedimiento mediante el cual se obtiene el genotipo de un organismo. Estas técnicas moleculares utilizan el ADN de un organismo, el cual es el material hereditario de los seres vivos, que se encuentra en todas las células nucleadas del y normalmente se mantiene conservado durante toda la vida del animal. Su análisis permite conocer el material genético que un individuo ha heredado de sus padres biológicos.
  8. 8. • PCR - RAPD - REP-PCR - ERIC-PCR - BOX-PCR • PCR-RFLP • RFLP-Hibridación • PFGE • AFLP • VNTR / MLVA • MLST Cambios genéticos en un corto período de tiempo Cambios genéticos en período de tiempo largo
  9. 9. INMUNOCOMPROMISO • Aquella en las cual las cifra de células inmunes disminuye de manera sustancial, impidiendo la defensa adecuada de la persona que la tiene, se debe a múltiples causas, una de las mas conocidas es el SIDA, pero también en una persona con tratamiento oncológico o bien con medicamentos inmunosupresores en enfermedades.
  10. 10. Los principales defectos inmunológicos son: • neutropenia (deficiencia del componente fagocitario) • Agamma/hipogammaglobulinemia (deficiencia de la inmunidad humoral) • Linfopenia T4 (deficiencia de la inmunidad celular)
  11. 11. Los principales microorganismos en la deficiencia de la inmunidad humoral son las bacterias encapsuladas: neumococo, menigococo y Haemophilus influenzae, y Cryptococcus neoformans (hongo encapsulado)
  12. 12. GENERAL PURPOSE • This study aimed to address this lack of knowledge using the collection of 51 clinical Cronobacter strains, which included those from the study by Holý et al. These strains were speciated and genotyped using 7-loci MLST, rpoB gene sequence analysis, O-antigen typing and pulsed-field gel electrophoresis.
  13. 13. METODOS Y MATERIALES • Cepas y cultivos • Fenotipificacion • PFGE de aislamiento cronobacter • Serotipificación molecular de Cronobacter • Extracción de DNA • Análisis de la secuencia del alelo rpo B • MLST
  14. 14. CEPAS Y CULTIVOS • 51 cepas de Cronobacter clínicos. • Recogidos en una encuesta de Cronobacter por pacientes de dos hospitales, desde mayo de 2007 hasta agosto de 2013.
  15. 15. FENOTIPICACION • Aislamientos de Cronobacter fueron fenotipificados usando el 32E ID kit.
  16. 16. PRGE - Enzimas de restricción XbaI y Spel - Se analizaron los perfiles de banda de ADN con el uso de software BioNumerics.
  17. 17. PRGE • Electroforesis en campos pulsantes - Se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. - Separación de grandes fragmentos de DNA induciendo su reorientación mediante cambios periódicos en el campo eléctrico
  18. 18. - Duración determina el intervalo de tamaños que se pueden separar (cuanto mayor sea el tamaño de los fragmentos a separar, mayor ha de ser la duración de los campos aplicados).
  19. 19. APLICACIONES - Epidemiologia molecular
  20. 20. Serotipificación molecular de Cronobacter • Serotipos Cronobacter se determinaron utilizando el multiplex reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
  21. 21. PCR • Reacción en cadena de polimerasa Técnica de amplificación enzimática de secuencias especificas de ADN. Consiste en aumentar un segmento especifico de ADN, usando polimerasa , obteniéndose miles o millones de copias
  22. 22. PRINCIPIO DEL METODO: - Desnaturalización del ADN. - Hibridación especifica de la hebra sencilla con un oligonucleótido ( primer) - Replicación de la hebra sencilla por una DNA Pol a partir del oligonucleótido anterior como cebador. APLICACIONES
  23. 23. EXTRACCION DEL DNA • Se extrajo el ADN de las cepas diana • La concentración de ADN se confirmó • el ADN se almacenaron a -20 ° C durante 6 meses.
  24. 24. ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL ALELO RPO B • El producto de PCR (637 pb) era secuenciado y alineada con las secuencias adicionales de la Base de datos de Cronobacter.
  25. 25. SECUENCIACION DE ADN • conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. • APLICACIONES: - Procesos biologicos fundamentales - Investigación forense - Mutaciones somáticas - Proyecto genoma humano TIPOS • Secuenciación por terminador fluorescente • Secuenciación alelo-específica por bisulfito
  26. 26. MLST • Siete genes de limpieza amplificados fueron: ATP sintasa cadena beta (TPAT), factor de elongación G (Fusa), glutaminyltRNA sintetasa (GLN), glutamato sintasa subunidad grande(gltB), ADN girasa subunidad B (gyrB), la traducción inicio factor IF-2 (INFB) y sintasa fosfoenolpiruvato (PSA).
  27. 27. MLST • Tipificación multilocus de secuencias - caracterización taxonómica de bacterias y microorganismos. - caracteriza muestras de especies microbianas mediante la secuenciación de ADN de fragmentos internos de varios genes de mantenimiento. - Cada muestra se caracteriza por las secuencias únicas de alelos en cada uno de los siete loci , lo cual constituye su perfil alélico o tipo de secuencia
  28. 28. Principio la técnica: - Mide directamente los cambios en la secuencia de una serie de genes de mantenimiento y caracteriza cepas mediante sus perfiles alélicos únicos - consiste en amplificación mediante PCR seguida de la secuenciación del ADN. Se pueden rastrear las diferencias en nucleótidos entre cepas en un número variable de genes en función del nivel de discriminación que se desee
  29. 29. • APLICACIONES
  30. 30. RESULTADOS
  31. 31. 51 sepas fueron caracterizadas genotípica mediante fusA y MLST, además fenotípicamente mediante ID32E, la cual no tiene la capacidad de identificar genero bacteriano por esto las sepas obtenidas como predominantes fueron distintas a las obtenidas mediante el fus A genotípico, el cual reconocido el porcentaje de c sakasakii de 63%, de c melanoticus 33%, c muytjensii de 2%.
  32. 32. Se encontró una relación fuerte entre los serotipos y varios tipos de secuencias.
  33. 33. • PFGE se uso para comparar si las cepas pueden ser usadas para elaborar el perfil en los dos diferente hospitales.
  34. 34. Usando enzimas de restricción, se lograron separar de 12 a 17 fragmentos de C. sakazakii y de 8 a 10 fragmentos de C. melanoticus.
  35. 35. • Cepas del mismo tipo fueron secuenciadas y diferenciadas con mas detalle permitiendo un mejor estudio de ellas.
  36. 36. PATRICK ME VS ARTICLE There was no apparent relatedness between the age or sex of the patintent and the cronobacter species isolated.
  37. 37. AUTOR JOSEPH S, SONBOL H VS VS PATRICK ME, PETRZELOVA Despite the greater discrimination of strains using PFGE than MLST. Disagree,PFGE profiles differentiated strains with each sequence type into 15 pulsotypes. There was almost complete agrement between MLST and rpoB
  38. 38. AUTOR PETRZELOVA VS HOLI O The carriage of the organism by adults and the high incidens of urinal tract infections indicate that the exposure routes to this bacterium still require elucidation
  39. 39. AUTOR VAN ACKER J,D SMET F VS ARTICLE Reporter cronobacter infections have primary concerned infans, especially premature neonates whit clinical presentations of necrotising enterocolitis. The article is disagree with that afirmation because In the first part of it, the autors write that the neonates are a one type of poblation that have many incidence of cronobateris but that the principal group is grown people.
  40. 40. CONCLUSIONES
  41. 41. Usingtwodiferent restictionenzymes(spelandxbal)isexpected thattheygettwodiferentspatronsofelectroforesisallowinga betterdefferentiation
  42. 42. The pulsotype is independent of the sequences types.
  43. 43. Exist more facility to take the isolates of sputum than other tipe of sources.
  44. 44. The51strinscanbeclusteredinfeveteenpulsotypes,ninecsakasakii,five cmelanoticusandonemuytjensii.
  45. 45. Thalia Ramirez.
  46. 46. THE SPECIATION AND GENOTYPIN OF CRONOBACTER ISOLATES FROM HOSPITALISED PATIENTS Is taken 51 cronobacterias strains, from different classes of hospitalized patients They were genotyped and speciated using methods such as, PFGE MLST ID 3E RPOB Teniendo en cuenta otro anteriormente realizados They nowledged strain how csakasakii (master),c malaticus c muytjasii cause of infections in children (neurosis meningitis, enterocolitis, death) and in adults (malignancy, underlying conditions) A Better identifying of these bacterias, the patologys and the insidencia, will be posible make better treatments Daniel Salazar.
  47. 47. BIBLIOGRAFIA • http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717 -75182015000100011 • http://www.elika.eus/datos/pdfs_agrupados/Documento88/C opia%20de%2010.Cronobacter.pdf • http://www.scielo.org.pe/pdf/rmh/v24n2/v24n2r2.pdf • http://www.cdc.gov/spanish/especialesCDC/Cronobacter/ • http://es.slideshare.net/hrmorales71/electroforesis-en- campos-pulsantes

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